Ein Maus-Closed-Brust-Modell von Myokardischämie und Reperfusion

Zusammenfassung

Chirurgisches Trauma eine entzündliche Reaktion induziert. Zytokine und endogene Liganden bekannt zu modulieren Myokardinfarkt Größe nach Ischämie und Reperfusion. Wir präsentieren eine modifizierte geschlossener Brust Modell der murinen Ischämie und Reperfusion mit hängenden Gewichte zu Auswirkungen der Thorakotomie zu minimieren.

Zusammenfassung

Chirurgische Trauma Thorakotomie im offenen Brustkorb Modelle Koronarligatur eine Immunantwort induziert, die über verschiedene Mechanismen, Ischämie und Reperfusion beteiligt ändert. Immunantwort umfasst Zytokin-Expression und Freisetzung oder Sekretion von endogenen Liganden des angeborenen Immunsystems Rezeptoren. Die Aktivierung der angeborenen Immunität kann potenziell modulieren Infarktgröße. Wir haben eine bestehende murinen geschlossener Brust Modell modifiziert mit hängenden Gewichten, die nützlich sein könnte für die Untersuchung myokardialer Vor-und Postconditioning und die Rolle der angeborenen Immunität bei Myokard-Ischämie und Reperfusion. Dieses Modell ermöglicht es, Tiere aus chirurgischen Traumas vor Beginn der Myokardischämie zu erholen.

Volatile Anästhetika wurden intensiv untersucht und ihre Wirkung für die Vorkonditionierung ischämische Herzerkrankung ist bekannt. Allerdings steht diese protektive Wirkung die Nutzung im offenen Brustkorb Modelle der koronaren Ligation. Somit könnte ein weiterer Vorteil der Verwendung von ten seine gut steuerbare volatilen Anästhetika für die Instrumentierung in einem chronischen geschlossener Brust-Modell, da ihre Präkonditionierung Wirkung hält bis zu 72 Stunden. Chronischer Herzerkrankungen ist mit intermittierender Ischämie und mehrere Hit-Modelle sind andere mögliche Anwendungen dieses Modells.

Für die chronische geschlossener Brust-Modell, unterziehen intubiert und Mäusen eine laterale Thorakotomie stumpf über den vierten Interkostalraum. Nach Identifikation der linken vorderen absteigenden eine Ligatur unterhalb den Behälter geführt und beide Fadenenden durch eine Sperre geschraubt. Dann werden beide Fadenenden durch die Brustwand, verknotet geleitet, um eine Schleife zu bilden und links in das subkutane Gewebe. Nach Schließung der Brust-und Recovery für 5 Tage, Mäuse betäubt sind wieder wird Brusthaut wiedereröffnet und hängenden Gewichte werden bis zu der Schleife unter EKG-Kontrolle süchtig.

Am Ende der Ischämie / Reperfusion-Protokolls kann Herzen mit TTC Infarkt gefärbt werdenGröße oder Beurteilung unterzogen Perfusionsfixierung zu morphometrische Untersuchungen zusätzlich zu Histologie und Immunhistochemie zu ermöglichen.

Protokoll

1. Einleitung der Narkose

1. Zur Induktion mit Isofluran, platzieren Sie den Mauszeiger in eine Box, die Induktion der Dampf-Set bis 3,0 Vol% und Sauerstoff-Flow von 0,5 l / min angeschlossen ist.
2. Nach Bewusstlosigkeit mit taktiler Reiz andernfalls um eine Antwort und das Vorderbein oder Hinterlauf Pedal Rückziehreflex abwesend induzieren erreicht wird, legen Sie die Maus auf eine temperaturgeführte OP-Tisch in Rückenlage. Aufrechterhaltung der Narkose über eine Nasen-Kegel, der zu dem Dampf über die Induktion Box angeschlossen ist. Zurücklehnen den Kopf durch die Fixierung der oberen Schneidezähne mit einem 5-0 Nylonfaden an der Intubation zu erleichtern.
3. Legen Sie die rektale Temperatur Sonde an Körper-Kerntemperatur bei 37 ° C zu halten Befestigen Sie die Enden mit Klebeband. Überqueren Sie die untere linke Bein über das rechte Bein zur Öffnung der linken Brust und das Herz aussetzen besser.
4. Bewerben Enthaarungscreme an den Hals und der linken Brust. Wischen Sie die Creme nach 1 Minute. Tragen Sie PVP-Jod für lokale HautDesinfektion. Inject Buprenorphin 0,05 mg / kg Körpergewicht subkutan zur Schmerzlinderung.
5. Machen Sie eine Mittellinie Hals Hautschnitt mit einer kleinen Schere. Blunt sezieren die Drüsen und Muskeln, die die Luftröhre zu decken. Schalten Sie den Ventilator. Ventilator Einstellungen müssen physiologische Parameter eingestellt werden. Wir verwenden eine Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Harvard Apparatus mit einer Atemfrequenz von 105/min und einem Tidalvolumen von 200 pl. Ziehen Sie die Zunge mit einer Zange und vorsichtig mit einem 22 G Metallrohr. Bestätigen Intubation durch direkte Visualisierung der Röhre im Inneren der Luftröhre und Brust Bewegung.
6. Umgehen Sie den Induktions-Feld durch die Umstellung auf Gas-Schlauch zu verschwenden, um eine Kontamination von Laborflächen zu verhindern. Stellen Dampf bis 2,0 Vol.%.

2. Thorakotomie

1. Machen Sie einen Hautschnitt in der linken Medioklavikularlinie. Blunt sezieren das Unterhautgewebe in Richtung Achselhöhle. Identifizieren Sie den Rand des Musculus pectoralis maior und stumpf sezieren sie aus dem kleinen pectoralis Muskel darunter. Ziehen Sie den kleinen Brustmuskel nach rechts. Sie erhalten einen direkten Blick auf den Brustkorb.
2. Identifizieren und unverblümt eindringen kann den vierten Intercostalraum mit einer Pinzette. Lassen Sie die Spitzen der Pinzette umspannen den Interkostalraum zu gönnen, um die Haken, die mit Gummibändern an den OP-Tisch angepasst werden einzufügen. Sie sollten einen klaren Blick des Herzens einschließlich der linken Ohrmuschel. Dieser Zugang ist in der Regel ohne Blutverlust erreicht und daher ohne die Notwendigkeit von elektrischen Koagulation.

3. Herstellung des Herzens

1. Ziehen Sie den Herzbeutel ohne Verletzung der Herzen.
2. Identifizieren Sie den linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) durch Abheben des linksatrialen Ohrmuschel aus der vorderen Wand des linken Ventrikels. KOP wird nur über einen kurzen geraden Kurs mit unscharfen Grenzen und leuchtend rote Farbe, um die Venen im Vergleich gesehen werden.

4. Coronary ArteryInstrumentierung

1. Planen einer 8-0 Prolene Naht mit einem sich verjüngenden Nadelspitze von Formen in einer U-Form. Führen Sie die Nadel durch das Myokard tief genug unter der LAD.
2. Abgeschnitten die Nadel des Fadens bis 1 cm der Naht auf jeder Seite haben.
3. Schneiden Sie ein 1 mm PE-10 Rohrabschnitt als Okkluder verhindert keine scharfen Ecken. Lassen Sie den Okkluder mit alkoholischen Desinfektionsmittel tränken und tippen Sie sich vor dem Gebrauch. Hinweis: Der Schlauch sollte in 100% Ethanol werden Einweichen für 24 Stunden das Gerät ordnungsgemäß zu ⁴ sterilisieren.
4. Themen sowohl Fadenenden durch die Okkluder.
5. Verwenden Sie eine Größe 3 Kalt Nähnadel zu führen beide Fadenenden aus der oberen Interkostalraum.

5. Chest Closure

1. Binden Sie den oberen und unteren Rippe des Interkostalraum eröffnet zusammen mit einem 6-0 Prolene Naht. Bevor Sie die Brust zu schließen, sollten Sie auf 5.2 gehen.
2. Hyperinflation der Lunge für ein paar Atemzyklen zu öffnenbis Atelektase durch Klemmen des exspiratorischen Rohr. Dieses Manöver kann auch von der Art des Ventilators Sie verwenden. Stellen Sie die Tidalvolumen zu 300 ul bis der Brustkorb geschlossen wird.
3. Stellen Sie den Ventilator Tidalvolumen wieder auf 200 pl.
4. Binden beide Enden des LAD 8-0 Ligaturnaht haben sie eine Schleife bilden.
5. Befestigen Sie ein EKG.
6. Schließen Sie die Gewichte an den 8-0 Schleife und lassen Sie die Gewichte vorsichtig aufzuhängen. Sie sollten eine deutliche ST-Hebung innerhalb weniger Herzschläge zu sehen. Lassen Sie die Gewichte. Hinweis: Diese Experimente nutzen insgesamt 5,5 g Gewicht, aber Gewicht könnte auf der Grundlage Belastung und Körpergewicht der Mäuse variieren.
7. Legen Sie die Schleife in einer subkutanen Tasche und schließen Sie die Haut mit 6-0 Knoten einzelne Nähte.
8. Lassen Sie die Maus nach Extubation unter einer Wärmelampe zu erholen.

6. Myokardischämie und Reperfusion

1. Nach einer Erholungszeit von mindestens 5 Tage zu induzieren Anästhesie mit einem Gemisch aus Ketamin, Xylazinund Atropin (4 ml / kg KG, Ketamin 10 mg / ml, Xylazin 2 mg / ml, Atropin 0,06 mg / ml, ^1.
2. Intubieren und lüften mit Raumluft für Ischämie und Reperfusion Experimente.
3. Öffnen Sie die genäht Haut der Brust. Bereiten Sie die 8-0 Nahtschlaufe. Befestigen Sie ein EKG.
4. Schließen Sie die Gewichte und ließ sie hängen. Folgen Sie Ihrem Ischämie-Protokoll. Sehen EKG für potenzielle Auflösung des ST-Hebung ^2.
5. Lassen Sie die Gewichte am Ende der Ischämie. Schließen Sie die Haut, extubiert der Maus und lassen Sie es wiederherstellen.

7. Infarktgröße Beurteilung mit Reperfusionszeit bis zu 3 Tage

1. Betäuben und intubieren die Maus am Ende der Reperfusion gewünschten Zeit.
2. Schneiden Sie die Brusthaut in der Mittellinie bis zum Xyphoid. Öffnen Sie den Bauch und schnitt die Membran unterhalb des Brustkorbs. Schneiden Sie die Brust offen auf beiden Seiten der Medioklavikularlinie.
3. Befestigen Sie das flatterte vorderen Brustwand mit einer Naht, um einen ungehinderten Zugang zum Herzen zu gewinnen.
4. Sorgfältig bereiten den 8-0 Nahtschlaufe. Schneiden Sie die Schleife und Knoten knüpfen, um die LAD verschließen.
5. Injizieren Sie 10% Phthaloblau in den linken Vorhof. Um kardialen Volumenbelastung zu verhindern, injizieren färben sich langsam, und saugen Sie von Zeit zu Zeit.
6. Inject Kaliumchlorid in den linken Vorhof. Dadurch wird das Herz in der Diastole für gleiche Infarktgröße Beurteilung zu verhaften.
7. Schneiden Sie das Herz, so dass so viel von extrakardialen Gewebe wie möglich zu erleichtern Schneiden des Herzens.
8. Waschen des Herzens in Phosphatpufferlösung.
9. Frieren Sie das Herz in Isopentan und flüssigem Stickstoff. Alternativ können Herzen in einen Gefrierschrank gelegt werden, bis sie leicht gefroren.
10. Schneiden Sie das Herz in 1 mm-Scheiben schneiden. Wir haben eine Schneideinrichtung von Rasierklingen, um die Herzen in gleich große Teile (4) geschnitten. Stellen Sie sicher, dass das Herz richtig ausgerichtet ist, dass sie senkrecht zur Längsachse des Herzens zu schneiden.
11. Inkubieren der Schnitte in 1,5% TTC bei 37 ° C für 20 min. Wir verwenden eine 96-Well-Platte, wojede Scheibe wird in einen gut gesagt. Das spart TTC und erspare Ihnen die Verwendung eines Whatman-Filter, um Artefakte zu vermeiden.
12. Befestigen Sie die Scheiben mit 4% Formaldehyd über Nacht. Dies wird schrumpfen, aber die Scheiben verstärkt den Kontrast des Farbstoffs.
13. Legen Sie die Scheibe auf einen Objektträger. Deckel mit einer anderen Folie. Verwenden Sie 1 mm Metall-Abstandhalter an jedem Ende des Schlittens und halten Sie die Folien zusammen mit Büroklammern.
14. Nehmen eines digitalen Bildes von beiden Seiten jeder Scheibe. Verwenden Sie immer die gleichen Einstellungen und nicht in kleinere Scheiben zu vergrößern.
15. Verwenden Sie eine Software für die Planimetrie. Wir verwenden ImageJ durch die NIH. Verwenden Sie immer die gleichen Kriterien für Infarkt-Bezirke, sind zB nur weiße Flächen infarziert. Weiß rosa Bereiche sind nicht infarzierten. Wir haben Ermittler für Interventionen und Planimetrie als auch geblendet.

8. Alternative Herz Vorbereitung für die Histologie

1. Folgen Sie den Schritten von 7,1 bis 7,2. und auf 8,2 gehen. Zuverlässige Beurteilung Infarkt mit TTC-Färbung kann innerhalb von 7 durchgeführt werden2 Stunden nach der Reperfusion wegen Narbenschrumpfung.
2. Bereiten Sie jede extrakardialen Gewebe stumpf und sezieren die Thymusdrüse für den Aortenwurzel.
3. Besorgen Sie sich die aufsteigenden Aorta mit der Pinzette und schneiden Sie das Herz mit weniger als extrakardialen Gewebe wie möglich.
4. Waschen und quetschen das Herz sanft in kardioplegischen Lösung.
5. Platzieren Sie das Herz in eine Schüssel mit p35 Kardioplegie-Lösung gefüllt.
6. Bereiten Sie den aufsteigenden Aorta.
7. Kanülierung der aufsteigenden Aorta mit einer Kanüle, die mit Formaldehyd vorgefüllt wird. Wir verwenden Zink-Formalin Fixativ und eine 24 G IV-Bahnlinie ^3.
8. Schneiden Sie ein Loch zwischen dem linken Vorhof und linken Vorhof.
9. Legen Sie eine 26 G-Katheter in den linken Vorhof mit einem 16 cm langen Schlauch attached to it. Sie können auch ein PE50-Schlauch.
10. Perfundieren das Herz für zehn Minuten mit der Formalin-Lösung fixiert.
11. Platzieren Sie das Herz in ein Rohr mit Fixativ für maximal 24 Stunden bei 7 ° C gefüllt
12. Fahren Sie mit preparation für die Histologie / Immunhistochemie.

9. Repräsentative Ergebnisse

Chronische koronare Ligation ist eine komplexe Technik mit mehreren Fallen. Doch sobald sie einmal gemeistert es mit sehr niedrigen Sterblichkeit und höchst zuverlässige Ergebnisse durchgeführt werden können. Optimale Positionierung der Mäuse und der Zugang zum Herzen sind entscheidend für die erfolgreiche Identifizierung und Instrumentierung des LAD. Die Position der Ligation wird beeinflussen offensichtlich Infarktgröße und erfordern somit eine standardisierte Ligationsstelle haben. Auch, wenn septalen Äste betroffen sind, könnte dies zu einem Schenkelblock statt ST-Hebung führen. Blutungen aus Venen oder aus epimyocardial Ventrikel, wenn Ligation zu tief ist, können auftreten und Mäusen sollte ausgeschlossen werden, wenn Blutungen ist übertrieben werden. Pericard sollte so vollständig wie möglich entfernt werden. Verlassen des Pericard wird verschlimmern schieben die Nadel in die Myokard für die Ligation. Auch wird es dazu führen, Perikarditis, schließlichinduzieren Verwachsungen und macht eine histologische Untersuchung schwierig. Die PE-Okkluder sollte so kurz wie möglich ohne scharfe Ecken auf ein Trauma zu Myokard zu minimieren. Hyperinflation der Lunge ist absolut entscheidend für Spannungspneumothorax nach Brust Schließung zu verhindern. Es besteht keine Notwendigkeit für eine Thoraxdrainage. Prüfung von einer korrekten Position der Ligation in den offenen Brustkasten, indem die Fadenenden sollte weggelassen werden, da der Zugkraft ist schwierig zu steuern sein. Wenn Instrumentierung des LAD fehlschlägt, sollten weitere Versuche zu vermeiden, da dies Trauma und Ödeme an den Herzmuskel hinzuzufügen.

Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, sollte Protokollparameter standardisiert werden. Daher werden die Mäuse intubiert und mit Raumluft und Körpertemperatur fest mit einem Feedback-System gesteuert wird. Die Verwendung von hängenden Gewichten wurde bereits betont. Andere Zuggeräte haben den Nachteil, Spannungsverlust und nicht-standardisierte Zugkraft. IschämischeVor-und Postconditioning Protokolle mit mehreren Zyklen der Reperfusion und Okklusion werden leichter mit hängenden Gewichten, weil sie müssen nur gehoben werden und lassen aufgehängt (Abb. 1) durchgeführt.

Infarkt Bereiche (weiß) sollten unterscheidbar von denen eine Gefährdung (rot) und nicht auf Risiken Bereich (blau) (Abbildung 2A-B). Infarktgrößen sind abhängig von Dauer der Ischämie. Reperfusion sollte mindestens 2 Stunden für eine erfolgreiche TTC-Färbung (1 und 2) zu ermöglichen. Am wichtigsten ist, Zytokin-RNA-Expression in sham operierten Tieren, die alle operativen Eingriffe mit Ausnahme Ischämie und Reperfusion hatten sie den Tieren, die Myokardinfarkt (Abbildung 3a-c) wurden im Vergleich niedrig.

Abbildung 1. Infarktgröße in Prozent des gefährdeten Bereiches (IS / AAR%). Mäuse unterzog sich 30 Minuten Ischämie gefolgt von 120 Minuten Reperfusions (I / R, n = 10). IPC: ischämische Postconditioning, Mäuse 30 Minuten der Ischämie von 3 Zyklen Reperfusion / Okklusion 20 sec jeweils gefolgt unterzogen (n = 6, * zeigt Ihnen, p <0,05).

2A. Vertreter TTC-gefärbten Herzen Scheibe. Weiß: Infarktgebiet, Rot: gefährdete Gebiet, Blau: nicht-verschlossenen Zone.

2B. Vertreter Scheibe nach einem Infarkt (weiß) Bereich. Beachten Sie, dass aufgrund der konischen Form des linken Ventrikels nahe der Spitze, die epimyocard als ebene Fläche kommen und nicht für planimetrische Messung (rosa / blau äußeren Bereich) berücksichtigt werden. Rot = TTC angefärbt lebensfähigen Myokard.

3A. Kein signifikanter Unterschied in meinemTNF-α ocardial mRNA-Expression nach 30 Minuten Ischämie und 120 Minuten Reperfusion. n = 4-6 pro Gruppe.

3B. Myokardiale IL-1β-mRNA-Expression nach 30 Minuten und 120 Minuten Ischämie Reperfusions (I / R). Es besteht kein signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle (keine Operation) und Sham-(kein Ischämie / Reperfusion)-Gruppe. n = 4-6 pro Gruppe, zeigt * p <0,05.

3C. Myokardiale IL-6 mRNA-Expression nach 30 Minuten und 120 Minuten Ischämie Reperfusions (I / R). Es besteht kein signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle (keine Operation) und Sham-(kein Ischämie / Reperfusion)-Gruppe. n = 4-6 pro Gruppe, zeigt * p <0,05.

Abbildung 4a-c. Hörent Schneidevorrichtung. A: geschlossen mit Rasierklingen in Schneidposition. B: offen, Seitenansicht. C: offen, Vorderansicht. Herz wird in der Nut des weißen Kunststoff Bett mit seiner Längsachse senkrecht zu den Rasierklingen (Pfeil) ausgerichtet werden.

Diskussion

Wir haben ein Mäuse-Modell geschlossener Brust durch Zugriff auf das Herz durch eine linke seitliche Thorakotomie Interkostalraum und führen Sie die LAD Nähte an der Brust in den linken Medioklavikularlinie geändert. Würde man die knöcherne Brustkorb intakt minimiert Trauma, Bedarf an Schmerzmitteln, postoperative Wundinfektion und damit die Erholung zu erleichtern. Durch die Bewahrung der linken inneren Arterie Säuger besteht keine Notwendigkeit zur Elektrokauterisation. Wir verlassen die Nahtschlaufe im subkuta...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Dampf	Drägerwerk AG	Isoflo
Mikroskop	Leica	M80
Lichtquelle	Schott	KL 1500 LCD
Homöothermen Blanket Control Unit	Harvard Apparatus
MiniVent Typ 845	Hugo Sachs Elektronik
8-0 Prolene	Ethicon	BV130-5 6,5 mm 3/8c
6-0 Prolene	Ethicon	BV-1 9,3 mm 3/8c
Kalt Nähnadel Größe 3	FST	12050-03
Triphenyltetrazoliumchlorid	Sigma Aldrich	93145
Phthaloblau	Heucotech LTD
PowerLab	ADInstruments