الكشف عن البكتيريا عن طريق DNAzymes Fluorogenic

Summary

وذكرت ونحن في الآونة الأخيرة نهجا جديدا لتوليد تحقيقات DNAzyme fluorogenic التي يمكن تطبيقها لاقامة بسيطة، "مزيج والقراءة" فلوري فحص للكشف عن البكتيريا. هذه التحقيقات DNA خاص تحفيز الانقسام من الحمض النووي الريبي الركيزة حامل اللون معدلة وخيالية في وجود مزيج النفط الخام خارج الخلية (CEM) التي تنتجها بكتيريا معينة، وترجمة وبالتالي اكتشاف بكتيريا في توليد إشارة مضان. في هذا التقرير سنقوم بشرح الإجراءات التجريبية الرئيسية التي يعمل تحقيقا DNAzyme محددة تدل على "تكتل القوى الديمقراطية، EC1" للكشف عن نموذج للبكتيريا، القولونية (اي كولي).

Abstract

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.¹ PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.^2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.⁵

DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.^6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 10¹⁶ individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).^9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.^6-8

Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.^17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.

More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.⁵ These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.

Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).⁵ This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).

Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

Protocol

1. إعداد المحاليل الكيميائية

1. 0.5 متر الاثيلين diaminetetraacetic حامض (EDTA): في 2 لتر (L) كوب من البلاستيك، وتزن 186.1 غرام EDTA (EM العلوم) وإضافة 800 ملليلتر (مل) من الماء المقطر منزوع الأيونات، مشبع (DDH ₂ O). ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الكريات (EM العلوم). جعل الحجم النهائي ل1 لتر باستخدام DDH ₂ O. نقل حل لقوارير الزجاج، الأوتوكلاف ومخزن في درجة مئوية 4
2. 10 × تريس بورات-EDTA حل (10 × TBE؛ تريس 89 ملم و 89 ملم حمض البوريك، 2 مم EDTA، ودرجة الحموضة 7.5): زن 432 غرام من تريس قاعدة (BioShop كندا) و 220 غرام من حمض البوريك (BioShop كندا) وإضافة إلى كل كوب من البلاستيك 4 لتر. قياس 80 مل من EDTA M 0.5 (درجة الحموضة 8.0)، ويضاف إلى الدورق. إضافة DDH ₂ O إلى وحدة تخزين النهائي من 4 ل. مزيج دقيق الحل مع شريط مغناطيسي حتى تذوب تماما المكونات. نقل حل لقوارير الزجاج، الأوتوكلاف ومخزن في درجة مئوية 4
3. 10٪ تبديل طبيعة polyacrylamiدي هلام الأوراق المالية: لكوب من البلاستيك 4 لتر، إضافة 1681.7 غرام من اليوريا (BioShop كندا)، 400 مل من 10 × TBE، 1 لتر من 40٪ حل (29:1) الأكريلاميد / bisacrylamide (BioShop كندا). ضبط مستوى الصوت إلى 4 لتر ​​مع DDH ₂ O. حل اليوريا مع التحريك. نقل الحل إلى 1 لتر الزجاجات الزجاج العنبر وتخزين عند 4 درجات مئوية (وينبغي التعامل مع Caution! الأكريلاميد مع وقفازات نظارات واقية وقناع ومعطف المختبر لأنه عصبي قبل البلمرة).
4. 2 تحميل الجل × العازلة (2 × GLB): لكوب زجاج مل 200، إضافة 44 غرام من اليوريا و 8 غرام من السكروز (BioShop كندا)، و 10 ملغ من اللون الأزرق برموفينول (BioShop كندا)، و 10 ملغ من FF xylenecyanol (سيجما الدريخ)، و 400 ميكرولتر من 10٪ سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS؛ BioShop كندا)، و 4 مل من TBE × 10. ضبط مستوى الصوت النهائي الى 40 مل مع DDH ₂ O وحل المواد الصلبة مع التدفئة معتدل (50 درجة مئوية) واثارة مع شريط مغناطيسي. نقل قسامة 1 ملم في 1.5 مل من أنابيب microcentrifuge ومخزن في 4 درجات مئوية. استنادا لديناالخبرة، فمن الضروري أن حرارة 2 × GLB لفترة وجيزة في 90 درجة مئوية قبل استخدامها لأن 2 × GLB يتصلب تحت ظروف التخزين.
5. 1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة): زن 12.1 غرام من تريس القاعدة في كوب زجاج مل 200. إضافة 60 مل من DDH ₂ O وتذوب المواد الصلبة عن طريق اثارة مع محرك مغناطيسي. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك (سيغما الدريخ). وتشكل وحدة التخزين إلى 100 ​​مل مع DDH ₂ O، ونقل إلى زجاجة والتعقيم. تخزن في درجة مئوية 4
6. 5 M كلوريد الصوديوم: في كوب زجاج تزن 58.4 غرام من كلوريد الصوديوم (BioShop كندا)، وتذوب مع 150 مل من DDH ₂ O. ضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع DDH ₂ O. نقل حل لتعقيم الزجاج، وزجاجة، ومخزن في درجة مئوية 4
7. الحمض النووي العازلة شطف: في كوب من الزجاج، خلط 2 مل من 1 M-تريس حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، و 8 مل من كلوريد الصوديوم M 5 و 0.4 مل من EDTA M 0.5 (درجة الحموضة 8.0). ضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع DDH ₂ O. الأوتوكلاف ومخزن في درجة مئوية 4
8. 2 × رد فعل العازلة (2 × RB؛ HEPES 100 ملم، 300 ملم كلوريد الصوديوم، 30 ملم MgCl _2): لأنبوب 50 مل الصقر دينار بحريني (فالكون)، إضافة 1.2 غرام من HEPES (BioShop كندا)، 0،88 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.30 غرام من MgCl ₂ • 6H ₂ O (المواد الكيميائية EMD) و 30 مل من DDH ₂ O. مزيج من اهتزاز أقل ما يقال حتى تذوب تماما المكونات. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم 10 N وتعديل حجم النهائي الى 50 مل مع DDH ₂ O. تنقية حل باستخدام وحدة حقنة يحركها فلتر (0.22 ميكرون، ميليبور) ومخزن في C. رقم 4
9. لوريا Bertani (LB) حساء: في كوب، وتزن 20.0 غرام من مسحوق LB (سيغما الدريخ)، يليه إضافة 1 لتر من DDH ₂ O. تماما خلط الحل مع شريط مغناطيسي، ونقل إلى حل دورق مخروطي. الأوتوكلاف الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
10. 1.5٪ أجار LB: زن 1.5 غرام من أجار (BioShop كندا) في قارورة سعة 250 مل و 100 مل إضافة LB السائل. الأوتوكلاف الخليط ومخزن في درجة حرارة الغرفة.
11. تصفيح أجار: ميلر أجار LB في الميكروويف وبارد الحل لجيم ~ ° 50 صب الحل في أطباق بتري (فيشر العلمية) تحت لهب. في تجربتنا، ويمكن 100 مل من آجار LB تسفر 5-6 لوحات.

2. وساطة بناء تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 بواسطة قالب ربط الأنزيمية

تكتل القوى الديمقراطية، EC1 (الشكل 2A) هو DNAzyme مميزة. وهي تتألف من EC1 تسلسل الحافز والركيزة FS1 تسلسل (المشار إليها بواسطة خطوط سوداء وخضراء في الشكل 2A). RFSS1 (الشكل 2A) هو نسخة تدافعت من تكتل القوى الديمقراطية، حيث يتم EC1 جزئيا EC1 تسلسل الحفاز تعديلا في SS1 لكن الجزء FS1 لم يتغير. وأدلى تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 بواسطة قالب بوساطة ربط الأنزيمية للFS1 قليل النوكليوتيد مع EC1 قليل النوكليوتيد أو SS1 في حضور LT1 كقالب ربط (أنظر المربع إدراجها في الشكل 2A). يتم توفير هذا الإجراء لإجراء عملية ربط رد فعل أدناه.تم الحصول على FS1 من المرافق كيك التجميعي أليغو في جامعة ييل، وتنقيته بواسطة deprotected الكهربائي للهلام بعد بروتوكول المحددة سابقا. تم شراؤها ^17-24 EC1، SS1 وLT1 من تقنيات الحمض النووي المتكاملة وتنقيته بواسطة الكهربائي للهلام.

1. تعد الأوراق المالية 100 ميكرومتر حل FS1، SS1، EC1 وLT1 باستخدام DDH ₂ O. تخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخدامها.
2. نقل 5 ميكرولتر من محلول المخزون FS1 لاثنين من 1،5 أنابيب microcentrifuge ميكرولتر وضعت الأنبوبة (1) وأنبوب 2. إلى كل أنبوب، إضافة 38.5 ميكرولتر من DDH ₂ O ثم 5 ميكرولتر من 10 × T4 كيناز عديد النوكليوتيد (PNK) العازلة رد فعل (MBI Fermentas)، والذي يحتوي على 500 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.6 أس هيدروجيني و 25 درجة مئوية)، 100 مم MgCl _2، 50 ملي DTT، 1.0 ملم سبيرمدين. خلط كل حل من قبل pipetting (ماصة الحل صعودا وهبوطا عدة مرات).
3. إضافة 1 ميكرولتر من بطولة (100 مم؛ Fermentas MBI)، ومزيج من قبل pipetting.
4. إضافة 0،5 ميكرولتر من كيناز عديد النوكليوتيد T4 (Pناغورني كاراباخ، و 10 وحدة / ميكرولتر؛ Fermentas MBI)، ومزيج من قبل pipetting. احتضان ومخاليط رد فعل على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تأكد لتغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لتقليل photobleaching من fluorophore.
5. إخماد رد فعل عن طريق التسخين في 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبريد مخاليط رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
6. إضافة 5 ميكرولتر من EC1 وSS1 حل الأوراق المالية إلى أنبوب (1) والأنبوبة 2 على التوالي.
7. إضافة 5 ميكرولتر من محلول المخزون LT1 إلى كل المزيج، بواسطة أنبوب pipetting. تسخين خليط التفاعل في 90 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، وتبرد لدرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
8. إضافة 118 ميكرولتر من DDH ₂ O ثم 20 ميكرولتر من 10 × T4 العازلة يغاز الحمض النووي (MBI Fermentas)، الذي يحتوي على 400 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.8 درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية)، 100 مم MgCl _2، 100 DTT ملم، و 5 ملي للاعبي التنس المحترفين. خلط الحل بواسطة pipetting.
9. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي يغاز T4 (5 وحدات / ميكرولتر؛ Fermentas MBI)، ومزيج من قبل pipetting. احتضان ومخاليط رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
10. إضافة 20 ميكرولتر من NaOAc م 3 (درجة الحموضة 7.0) إلى كل دوامة، وتدور أنبوب أسفل. إضافة 500 ميكرولتر من البرد الإيثانول بنسبة 100٪ لكل أنبوب، خلط الحل بواسطة vortexing ووضع أنابيب في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
11. أجهزة الطرد المركزي في مخاليط في 11000 جم لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة (أليجرا X22-R، بيكمان كولتر) وإزالة بعناية وطاف بواسطة pipetting.
12. تجفيف بيليه الحمض النووي باستخدام مكثف الحمض النووي (DNA سافانت Speedvac، الحرارية العلمية) لمدة 10 دقيقة.
13. الكريات Resuspend الحمض النووي في 30 ميكرولتر من 1 × هلام العازلة تحميل (GLB)، لفترة وجيزة دوامة وتدور باستمرار مع جهاز للطرد المركزي الفوق (Minicentrifuge، VWR العلمي). على عينات من الحمض النووي ligated على استعداد لتحميلها على مادة هلامية dPAGE 10٪.

3. إعداد جيل dPAGE 10٪

تصف الخطوات التالية لفترة وجيزة من الجهاز الكهربائي للهلام ولها مجموعة من القاعدة. لمزيد من التفاصيل حول هذا الضبط، والتعامل مع الجهاز، يرجى الرجوع رس بروتوكولات لدينا المنشورة سابقا. ^30،31

1. غسل وتجفيف ألواح الزجاج اثنين، واثنين من الفواصل 0،75 ملم ومشط 16-جيدا. جمع لوحات الزجاج والفواصل مع لقطات ووضع أفقي على سطح مستو مع لوحة زجاج حقق مواجهة.
2. نقل 40 مل من مزيج dPAGE 10٪ إلى كأس ML 150. اضافة 40 ميكرولتر من tetramethylethylenediamine (TEMED؛ Bioshop كندا)، و 400 ميكرولتر من APS 10٪، ومزيج من دوامات مع pipettor.
3. صب الخليط بعناية بين لوحات وتضاف فورا المشط. يسمح هذا المزيج على تتبلمر لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ويمكن التأكد من البلمرة عن طريق التحقق من مزيج هلام المتبقية في الكأس.
4. بلمرة مرة واحدة، وإزالة المشط بلطف وشطف الآبار مع DDH ₂ O لإزالة المتبقي حل هلام في الآبار.
5. تركيب لوحات على الجل جهاز الكهربائي مع لوحة مستطيلة unnotched التي تواجه بها ووضع لوحة معدنية وراء لوحة حقق. استخدام PL المعدنأكل يساعد على منع ارتفاع درجة الحرارة التي يمكن أن كسر ألواح الزجاج.
6. إضافة 1 TBE × إلى غرف العلوي والسفلي من الجهاز. تحقق للتأكد من أن يتم ملء الآبار مع العازلة ومغمورة الحافة السفلى من هلام في المنطقة العازلة.
7. تنطبق على درجة الماجستير 40 (أو 750 فولت) الحالية والسابقة للتشغيل لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

4. تنقية Ligated EC1-RFD و RFSS1 بواسطة هلام dPAGE 10٪

1. بعد خطوة من 3.7، شطف الآبار مع 1 TBE × باستخدام محقنة وإبرة.
2. تحميل خليط من ربط تكتل القوى الديمقراطية، وذلك من EC1 RFSS1 (من 2.13) إلى 2 الآبار (واحد لكل) باستخدام pipettor ونصائح التحميل هلام (Diamed). تنطبق على درجة الماجستير 40 (750 فولت) الحالي حتى صبغ أسفل (برموفينول الأزرق) ما يقرب من 5 سم فوق الحافة السفلى من لوحات.
3. إزالة ألواح الزجاج من الجل جهاز تشغيل، الاستلقاء على مقعد رأس مسطح وإزالة بعناية الفواصل.
4. إزالة بعناية لوحات من الزجاج أعلى من الجل والتفاف جل مع اللفائف البلاستيكية (في محاولة لتجنب التجاعيد وقابلة للطي ليلتف على الجل).
5. لا يمكن للمنتجات ligated تصور إما عن طريق تلقي بظلالها على الأشعة فوق البنفسجية (260 نانومتر) أو عن طريق تضوء (360 نانومتر)، والتي سوف تنتج فرقة الحمض النووي مرئية بضعة سنتيمترات فوق EC1 أو SS1 (100 بمول من EC1 أو SS1 يمكن استخدامه كعلامة و تحميلها في بئر في خطوة من 4.2). بمناسبة عصابات الحمض النووي المطلوب مع علامة.
6. المكوس الفرقة الحمض النووي مع شفرات الحلاقة معقمة، وقطع هلام الى قطع صغيرة ونقل الى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
7. سحق القطع هلام داخل أنبوب microcentrifuge باستخدام طرف ماصة معقمة (200 حجم رأس ميكرولتر).
8. إضافة 500 شطف الحمض النووي ميكرولتر العازلة إلى كل أنبوب وغطاء لهم مع رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores من ضوء. دوامة العينات لمدة 10 دقيقة.
9. منبذة العينات في 11000 ز لمدة 4 دقائق في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة (أليجرا X22-R، بيكمان كولتر) ونقل بدقة 350 ميكرولتر من لياليupernatant لالطازجة 1.5 أنبوب microcentrifuge مل (إذا لزم الأمر، يمكن ان يتم شطف المركز الثاني برصيد 350 ميكرولتر من العازلة شطف جديد للحصول على آخر 10 دقيقة).
10. إضافة 35 ميكرولتر (0.1 × من حجم العينة) من 3 خلات الصوديوم M (NaOAc، ودرجة الحموضة 7.0) إلى كل أنبوب، مزيج من قبل vortexing، وتدور باستمرار. إضافة 900 UL من البرد الإيثانول بنسبة 100٪ على كل أنبوب. خلط كل عينة بواسطة المصافحة الأنبوب لبضع ثوان. وضع الأنابيب عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 س.
11. منبذة العينات في 11000 جم لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة وإزالة بعناية وطاف بواسطة pipetting.
12. أضف 100 ميكروليتر من البرد الايثانول 70٪ واستخدامه لشطف بلطف الجدار كله الداخلي للأنبوب. إعادة الطرد المركزي في 11000 ز لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف وتجفيف بيليه باستخدام الحمض النووي المكثف لمدة 10 دقيقة.
13. حل الكريات الحمض النووي في 100 ميليلتر من DDH ₂ O ودوامة. تحديد تركيز الحمض النووي بناء على امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 260 نانومتر. عينات من متجر في -20درجة مئوية حتى استخدامها.

5. إعداد البكتيريا

1. الهدف السلالة البكتيرية E. ومطلي أولا القولونية K12 (ال MG1655) والسلالات ذات الصلة سيطرة على لوحات أجار LB من أسهم الجلسرين. تحت لهب أو داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وتلمس الأوراق المالية الجلسرين البكتيرية مع طرف ماصة معقمة وخط بلطف على سطح لوحة لتجنب إتلاف أجار LB.
2. عكس لوحات يشوبه واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة. بعد الحضانة، وختم محيط كامل من لوحات مع Parafilm (بيشيني بلاستيك التغليف) ومخزن في درجة مئوية 4 ويمكن تخزين هذه اللوحات لمدة أقصاها 4 أسابيع.

6. إعداد خلطات الخام خارج الخلية (CEMS)

1. الاستغناء 2 مل من LB إلى 14 أنابيب معقمة ثقافة مل دينار بحريني (فالكون) باستخدام بندقية ماصة (كورنينج).
2. باستخدام طرف ماصة معقمة، واختيار مستعمرة واحدة من لوحة أجار أعد في خطوة من 5.2 وأدخله في ميلانulture أنبوب. أنابيب مكان في حاضنة (نيو برونزويك العلمي) وضعت في 37 درجة مئوية، ويهز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 14 ساعة.
3. 1٪ إعادة تلقيح ثقافة: الاستغناء عن 2 مل من LB الطازجة إلى 14 مل من أنابيب ثقافة ومسمار مع 20 ميكرولتر من الثقافات البكتيرية أعدت في الخطوة 6.2. احتضان هذه الأنابيب في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى حل كل البكتيرية يصل إلى OD ₆₀₀ (قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر) من حوالي 1. لقياس OD _600، نقل 1 مل من كل ثقافة إلى كوفيت القابل للتصرف وتدبير الامتصاصية في 600 نانومتر مع الطيف للأشعة فوق البنفسجية (UV جينيسيس 10، الحرارية العلمية).
4. نقل 1 مل من كل ثقافة إلى جديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في 11000 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. نقل وطاف واضحة الى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية إذا لم يتم استخدامها على الفور.

7. الكشف عن استخدام الطيف الإسفار

1. تشغيل معمل مضان (كاري الكسوف، فاريان المؤتمر الوطني العراقي)، وإعداد المعلمات للحصول على البيانات مع الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات عند 520 نانومتر. يمكن أن تؤخذ القراءات كل دقيقة لمدة 1 ساعة.
2. غسل 3 cuvettes الكريستال الكوارتز (فاريان كاري) مع DDH ₂ O، تليها الإيثانول بنسبة 100٪. تجفيف cuvettes التي تومض غاز النيتروجين. التسمية cuvettes C1 (مراقبة 1)، C2 (مراقبة 2) و T (اختبار).
3. نقل 24 ميكرولتر من DDH ₂ O إلى C1 و 24 ميكرولتر من CEM-EC إلى C2 و T. إضافة 25 ميكرولتر من 2 × RB إلى كل كفيت ووضعها في الطيف مضان. البدء في جمع البيانات مضان ل5 دقائق الأولى.
4. إضافة 1 ميكرولتر من RFSS1 (من التوصل إلى حل ميكرومتر الأسهم 5) إلى C2 و 1 ميكرولتر من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 (من التوصل إلى حل ميكرومتر الأسهم 5) إلى T و C1. خلط كل حل من قبل pipetting. يجب أن يكون هذا شرع بعناية بحيث لا تنقطع القراءات مضان. السماح للتفاعل أن تستمر لبقية الوقت 1 اكتساب ح.
5. حفظالبيانات في شكل ملف إكسل، ونقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر شخصي وبيانات عملية لخلق صورة بيانية.

8. الكشف عن طريق الكهربائي للهلام

يمكن استخدام خليط رد الفعل نفسه على استعداد في الخطوة 7.4 لتحليلها من قبل الكهربائي للهلام، ويمكن أن تكون مستعدة ردود الفعل بدلا من جديد على نحو مماثل، وحضنت في 1.5 مل من أنابيب microcentrifuge. في كلتا الحالتين:

1. إخماد ردود فعل (بعد 1 ح) من خلال إضافة 5 ميكرولتر من NaOAc م 3 و 125 ميليلتر من الإيثانول بنسبة 100٪. خلط كل حل من قبل vortexing ووضع أنابيب في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
2. منبذة الخلطات رد فعل على 11000 جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية، وإزالة بعناية طاف بواسطة pipetting.
3. تجفيف حبيبات باستخدام الحمض النووي المكثف لمدة 10 دقيقة.
4. Resuspend الكريات في 20 ميكرولتر من 1 × GLB بواسطة vortexing لفترة وجيزة. تدور أسفل أنابيب لفترة وجيزة جدا مع جهاز للطرد المركزي الفوق (Minicentrifuge، VWR العلمي). تتم قراءة هذه العيناتذ لتحميل إلى هلام dPAGE.
5. إعداد هلام dPAGE 10٪ كما هو موضح في 3،1-3،7. تحميل عينات من رد فعل (من الخطوة 8.4) في الآبار باستخدام pipettor ونصائح التحميل هلام (Diamed). تنطبق على درجة الماجستير 40 (750 فولت) الحالي حتى صبغ أسفل (برموفينول الأزرق) ما يقرب من 5 سم فوق الحافة السفلى من لوحات.
6. إزالة ألواح الزجاج، ويغسل جيدا مع ماء الصنبور لإزالة أي قطع هلام. مسح لوحات مع kimwipe (كيمبرلي كلارك الفنية).
7. تفحص لوحة هلام لمضان باستخدام ماسح ضوئي اعصار (تايفون 9200، وضع المتغير، وجنرال الكتريك للرعاية الصحية). تحليل البيانات باستخدام برنامج ImageQuant (حيوية الجزيئية).

9. الكشف عن خصوصية

1. لاختبار نوعية البكتيرية، وصفت نفس الإجراءات المذكورة أعلاه لزراعة E. كولاي، ويمكن أن يؤديها CEM إعداد وإجراء فحص رد فعل الانقسام لعدد من سلالات بكتيرية مختلفة مثل ب. الرقيقة، P. بيلي، Y. ruckeri، L. Planturum، P. acidilactici (كما هو موضح في الشكل 3A).

10. وحيد الخلية كشفها

إعداد 1 مل E. كولاي الأسهم الجلسرين من 2 كفو / مل (CFU: مستعمرة لتشكيل وحدة) من خلال تخفيف مسلسل وتأكيد CFU تركيز من قبل طلي ⁵ هذا المخزون يجب أن يحتوي على 0،2 CFU/100 ميكرولتر. متجر في -80 درجة مئوية حتى استخدامها.

1. تحضير أنابيب ثقافة 10 التي تحتوي على 2 مل من LB.
2. تطعيم كل ثقافة مع 100 ميكرولتر من 2 الأسهم الجلسرين كفو / مل واحتضانها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. يجب استخدام الأوراق المالية الجلسرين كامل (1 مل) 10 تسفر الثقافات.
3. حصاد 300 ميكرولتر من كل أنبوب ثقافة تلقيح عند نقاط الزمني التالي: 4 و 8 و 12 و 16 و 24 ساعة. مغادرة ثقافة المتبقية لتنمو لمدة 24 ساعة.
4. قياس التطوير التنظيمي ₆₀₀ و يعجل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 11000 ز لمدة 5 دقائق.
5. نقل إلى CEMS الطازجة 1.5 أنابيب microcentrifuge مل ومخزن في -20 و دعلى سبيل المثال، C حتى الاستخدام.
   ملاحظة: بما أنه قد لا يكون التطوير التنظيمي للكشف عن ₆₀₀ عينات تحصد في الوقت 4 نقاط و 8 و 12، والسماح للثقافة المتبقية لتنمو لمدة 24 ساعة من أجل تحديد الثقافات التي تحتوي على البكتيريا (التي يحددها قياس العكارة والتطوير التنظيمي). ربما واحد فقط أو اثنين من الثقافات تحتوي على 10 E. وسوف القولونية بعد التلقيح وأنابيب المتبقية لا يحتوي على أية خلايا.
6. استخدام CEMS تعافى من الثقافات الايجابية (المخزنة في درجة مئوية -20) في timepoints المعينة إلى إعداد ردود الفعل انقسام مع EC1-RFD، ومن ثم تحليل مخاليط رد فعل باستخدام dPAGE هلام إستشراد على النحو المبين في المادة 8.

11. مفهوم والممثل النتائج

ويتضح مفهوم استغلال 1 DNAzyme فلوري الرنا الشق (تكتل القوى الديمقراطية) للكشف عن البكتيريا في الشكل. 1. وتكتل القوى الديمقراطية يشق الحمض النووي خيالية / ركيزة الحمض النووي الريبي في وجود صلة RNA وحيد (الأزرق R) يحيط بها اثنان النيوكليوتيدات المسمىمع fluorophore (F) وفاكهه تقضي على (س) على التوالي. كما بكتيريا من الفائدة (مثل كولاي) ينمو في وسائل الاعلام، وسوف تترك وراءها خليط الخام خارج الخلية (CEM). ثم يتم استخدام هذا CEM ككل في في تجربة اختيار المختبر للحصول على تكتل القوى الديمقراطية وقادرة على الاستجابة على وجه التحديد إلى CEM، يفترض أن تكتل القوى الديمقراطية يتفاعل مع جزيء معين (النجم الأرجواني) في CEM الذي هو جزيء التوقيع على البكتيريا. عندما يتم إضافة CEM إلى محلول التفاعل التي تحتوي على تكتل القوى الديمقراطية، فإنه سوف يثير النشاط الرنا الشق من تكتل القوى الديمقراطية. حالة الانقسام يفصل F من س، مما أدى إلى إشارة فلوري الذي يمكن اكتشافه إما باستخدام مقياس التألق أو هلام إستشراد.

وقد تم التحقق من صحة التجريبية للمفهوم أعلاه مع CEM من E. كولاي (CEM-EC). حصلنا على 3 جزيئات تكتل القوى الديمقراطية عن طريق اختيار في المختبر، وعين واحدة أكثر كفاءة وتكتل القوى الديمقراطية، EC1 (الشكل 2A). ⁵ واطه اختبار النشاط انشقاق من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 (جنبا إلى جنب مع سلسلة المسخ المسمى RFSS1) استجابة لCEM-EC. وأعدت كل من تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 بواسطة ربط الأنزيمية للأجزاء DNAzyme إلى الركيزة FS1 (ترد جميع متواليات في الشكل 2A). في التجربة قياس مضان (الشكل 2B)، وقد حضنت CEM-EC حده لمدة 5 دقائق، تليها إضافة تكتل القوى الديمقراطية، أو EC1 RFSS1، وكذلك حضانة لمدة 55 دقيقة أكثر. وكثافة مضان من الحل قراءة بشكل مستمر في كل دقيقة، وكان يستخدم البيانات لحساب مضان النسبية (RF، محسوبة على أساس نسبة من كثافة مضان في الزمن t مقابل كثافة مضان في وقت 0). يتم رسم القيم مقابل RF وقت حضانة كما الشكل. 2B. وحيث تبين ان تكتل القوى الديمقراطية، EC1 المنتجة على مستوى عال من إشارة مضان على إضافة CEM-EC، في تناقض صارخ، RFSS1 لم تنتج إشارة قوية مضان. وهكذا، فإن فو مضان المنتجة للnction من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 على الاتصال CEM-EC هو تسلسل محدد.

قمنا بتحليل من أجل التحقق من أن الزيادات الملحوظة مضان هي نتيجة لانشقاق الربط الجيش الملكي النيبالي، والخلائط رد فعل من قبل dPAGE. ومن المتوقع أن الانقسام من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 لتوليد شظايا من الحمض النووي اثنين، "الإبقاء على جزء fluorophore و 3" على بعد 5 قطعة فاكهه تقضي على الاحتفاظ. uncleaved فقط تكتل القوى الديمقراطية، EC1 (unclv)، ويمكن أن يتم الكشف عن جزء من 5 '(CLV) عن طريق التصوير مضان. نتيجة dPAGE هو مبين في الشكل. 2C يكشف عن أن خليط التفاعل من تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 CEM EC-تنتج في الواقع نتاج الانقسام المتوقعة، في حين أن مزيج RFSS1/CEM-EC لم يفعل ذلك.

تم فحص خصوصية تكتل القوى الديمقراطية، EC1 باستخدام CEMS التي تم جمعها من عدد آخر من الجراثيم سلبية وإيجابية غرام وتظهر البيانات في الشكل. 3A. تنتج سوى عينة تحتوي على CEM-EC (الأزرق منحنى) زيادة في مضان. عدم وجود التفاعل المتبادل مع CEMSمن بكتيريا أخرى تشير إلى أن تكتل القوى الديمقراطية، EC1 هو انتقائي للغاية لE. القولونية.

فحصنا أيضا الوقت اللازم للزراعة 1 هاء واحدة خلية بكتيريا من أجل إنتاج ما يكفي من CEM التي يمكن أن تحفز انقسام من تكتل القوى الديمقراطية، EC1. لهذه التجربة، وهاء عينة تحتوي على بكتيريا تعرف CFU (مستعمرة لتشكيل وحدة) ويخفف على نحو كاف لتحقيق تركيز من 1 كفو / مل. وأعقب هذا عن طريق خلط 100 ميكروليتر من عينة جرثومية المخفف مع وسائل الاعلام النمو وزراعة لمدة 4، 8، 16، 12 و 24 ساعة. ثم جمعت CEMS لكل timepoint واختبارها لحفز النشاط انشقاق من تكتل القوى الديمقراطية، EC1. نتيجة dPAGE هو مبين في الشكل. 3B يشير إلى أن هناك حاجة إلى وقت زراعة من 12 ساعة.

من المهم أن نلاحظ أن الزيادة الأولي إشارة صغيرة لوحظ في قياسات مضان بعد إضافة RFSS1 تسلسل (كعنصر تحكم سلبي) لCEM-EC (الشكل 2B، أحمر المنحنياتويعزى كل منحنيات باستثناء الأزرق) إلى مضان لا يتجزأ من وحدة FRQ (نظرا لعدم اكتمال التبريد بواسطة F س)، ه) أو تكتل القوى الديمقراطية، EC1 إلى CEMS البكتيرية الأخرى (الشكل 3B. وبالتالي، فإنه من المتوقع أن إضافة F-وتسلسل Q-المسمى ستنتج زيادة أولية مضان. ومع ذلك، والخلائط فقط RFD-EC1/CEM-EC هي قادرة على انتاج على مستوى عال من التألق مع مرور الوقت.

الشكل 1. توضيح تخطيطي لالرنا الشق فلوري مسبار (تكتل القوى الديمقراطية) DNAzyme أن fluoresces على اتصال مع خليط من النفط الخام خارج الخلية (CEM) التي تنتجها الخلايا البكتيرية محددة من الفائدة. وتكتل القوى الديمقراطية يشق الحمض النووي خيالية / ركيزة الحمض النووي الريبي في وجود صلة RNA وحيد (الأزرق R) يحيط بها اثنان وصفت النيوكليوتيدات مع fluorophore (F) وفاكهه تقضي على (س) على التوالي. قبل رد فعل الانقسام، ومستوى مضان من تكتل القوى الديمقراطية هو الحد الأدنى الواجب لبالوكاله وثيقimity من واو وفاء وبعد انشقاق، س ينحرف عن F، ونتيجة، ويتم إنتاج إشارة قوية مضان.

الشكل 2، وهاء كولاي الاستشعار تكتل القوى الديمقراطية. (A)-RFD EC1 هو تحقيق DNAzyme التي يمكن تفعيلها من خلال CEM-EC. RFSS1 هو تسلسل تدافعت من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 يستخدم كعنصر تحكم. وأنتجت تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 بواسطة ligating FS1 مع EC1 وSS1، على التوالي، في ظل وجود LT1 كقالب. F: فلوريسئين المعدلة ديوكسي تيميدين. س: Dabcyl المعدلة ديوكسي تيميدين. R: ريبونوكليوتيد الأدنين. (ب) الإسفار يشير لمحات من تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 في وجود CEM الجماعة الأوروبية. (ج) تحليل dPAGE من خلائط رد فعل انشقاق في B (وقت رد فعل: 60 دقيقة). في الصورة هي صورة مضان من هلام dPAGE التي تم الحصول عليها بواسطة الماسح الضوئي مع الاعصار. حارة NC: تكتل القوى الديمقراطية، أو EC1 RFSS1 في المخزن المؤقت رد فعل وحدها؛ لين CEM-EC: تكتل القوى الديمقراطية، أو EC1 RFSS1 في المنطقة العازلة التي تحتوي على رد فعل CEM-EC. علامة: تكتل القوى الديمقراطية، CE1 تعامل مع هيدروكسيد الصوديوم N 0،25، وهو إجراء يعرف عنها التسبب في انقسام كامل من الحمض النووي الريبي. unclv: uncleaved تكتل القوى الديمقراطية، EC1. CLV: جزء الانقسام الذي يحتوي على fluorophore.

الشكل 3: (أ) الإسفار يشير الملف من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 في CEMS أعدت من الخلايا البكتيرية المختلفة. المفوضية الأوروبية: coli ل-K12، PP: بيلي الزائفة؛ دينار بحريني: Brevundimonas الضئيلة؛ HA: الهافنية النخروبية؛ ريال: يرسينيا ruckeri، خطأ في مرماه: Ochrobactrum grignonese؛ AX: المنتصلة xylosoxidans، MO: الموراكسيلة osloensis؛ منظمة العفو الدولية: الراكدة اللفوفية؛ SF: السراتية fonticola؛ BS: العصوية الرقيقة، LM: النستقة المساريقية؛ ليرة لبنانية: planturum الملبنة: مجلس الشعب: المملسة acidilactici؛ AO: الشعية الفلوبتوماس. وقد حضنت كل عينة CEM لمدة 5 دقائق يليه إضافة تكتل القوى الديمقراطية، EC1. (ب) dPAGEتحليل مخاليط RFD-EC1/CEM-EC بعد رد فعل 60 دقيقة. حارة NC1: تكتل القوى الديمقراطية، EC1 في المخزن المؤقت رد الفعل وحده. حارة NC2: تكتل القوى الديمقراطية، EC1 في المنطقة العازلة التي تحتوي على رد فعل CEM-BS (CEM وأعدت من العصوية الرقيقة). الممرات المسمى مع 4، 8، 16، 12 و 24: تكتل القوى الديمقراطية، EC1 في المنطقة العازلة التي تحتوي على رد فعل CEM الجماعة الأوروبية مأخوذة من ثقافة البكتيرية التي تحتوي على واحد E. خلية كولاي بعد فترة متزايد من 4 و 8 و 12 و 16 و 24 ساعة، على التوالي.

Discussion

معظم طرق الكشف البكتيرية شيوعا اليوم اما ان تكون بطيئة (الجراثيم الكلاسيكية) أو مطالبة من الناحية الفنية (الضد، PCR). وبالتالي، فإننا نعتقد أن الجيل القادم من أدوات الكشف وينبغي أن تلبي نحو السرعة والبساطة. تحقيقا لهذه الغاية، لقد أنشأنا الرنا الانفطار ومضان، مما يشير DNAzyme التي يمكن استخدامها لتطوير فحوصات بسيطة للإبلاغ عن وجود البكتيريا من خلال توليد إشارة مضان. يتم تنشيط الميزات DNAzyme التحقيق، تكتل القوى الديمقراطية، EC1، التي أنتجت خلال CEM نمو E. القولونية في وسائل الإعلام ثقافة. منذ أسلوبنا يستخدم خليط من النفط الخام خارج الخلية جرثومة كهدف الكشف واستخراج يتجاوز الهدف شاقة والخطوات التضخيم، أنها يمكن أن تستخدم لإعداد بسيط جدا "، ومزيج، وقراءة" نوع من فحوصات للكشف عن البكتيريا. ولا يقتصر استخدام DNAzyme جهدنا لمضان طريقة كشف القائم. على سبيل المثال، كشف اللونية باستخدام نظام DNAzyme نفسه فحص جتصميم لاستخدام أسلوب ذكرت في وقت سابق ان يستغل المتداول التضخيم دائرة بالتعاون مع لصبغ العضوية ^(32). ونحن نتوقع استخدام DNAzymes للكشف عن البكتريا كوسيلة جذابة لتوليد أجهزة الاستشعار بكتيرية جديدة مع بساطة تشغيلية أكبر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	عدد دليل أو نموذج
أجار	BioShop كندا	AGR003
بيرسلفات الأمونيوم (APS)	BioShop كندا	AMP001
الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (40٪، 29:1)	BioShop كندا	ACR004
حمض البوريك	BioShop كندا	BOR001
زرقة البروموفينول	سيغما الدريخ	B8026
EDTA	EM العلم	EXO539-1
حمض الهيدروكلوريك	سيغما الدريخ	38281
HEPES	Bioshop كندا	HEP001
LB مرق	سيغما الدريخ	L3022
MgCl 2	EMDالمواد الكيميائية	B10149-34
كلوريد الصوديوم	BioShop كندا	SOD002
NaOAc	EMD كيماويات	SXO255-1
هيدروكسيد الصوديوم	EMD كيماويات	SXO590-1
SDS	BioShop كندا	SDS001
TEMED	BioShop كندا	TEM001
تريس القاعدة	BioShop كندا	BST666
توين 20	سيغما الدريخ	P9416
اليوريا	BioShop كندا	URE001
Xylenecyanol FF	سيغما الدريخ	X4126
الحمض النووي المكثف	الحرارية العلمية	رجل علم الحمض النووي SpeedVac 120
Millex مرشح وحدة	ميليبور	SLGP033RS
نصائح هلام التحميل	Diamed	TEC200EX-K
ImageQuant البرمجيات	جزيئية حيوية	الإصدار 5.0
Kimwipes	كيمبرلي كلارك الفنية	34705
مصغرة Vortexer	VWR	58816-121
Parafilm	بيشيني تغليف بلاستيكية	PM996
أطباق بتري	فيشر العلمية	Fisherbrand 08-757-12
Stripettor زائد (ماصة بندقية)	كورنينج	07764714
الكوارتز cuvettes	فاريان المؤتمر الوطني العراقي	66-100216-00
شاكر / حاضنة	نيو برونزويك العلمي	الكلاسيكي سلسلة C24
الاعصار سكانر	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	9200 وضع متغير
نبذ	بيكمان كولتر	أليجرا X22-R
الأشعة فوق البنفسجية الطيف	الحرارية العلمية	GenesysUV 10
مضان الطيف	فاريان المؤتمر الوطني العراقي	كاري الكسوف