Обнаружение бактерий с помощью флуорогенных DNAzymes

Резюме

Недавно мы сообщали о новом подходе для создания флуорогенных зондов DNAzyme которые могут быть применены для создания простых, "сочетание и читать" флуоресцентный тест для обнаружения бактериальной. Эти специальные ДНК-зонды катализируют расщепление хромофора модифицированных ДНК-РНК химерных субстрата в присутствии внеклеточных сырой смеси (CEM) производства конкретных бактерий, тем самым переводя бактериальных обнаружения флуоресценции в поколение сигнала. В этом докладе мы опишем основной экспериментальной процедуры, когда конкретный зонд DNAzyme обозначается "RFD-EC1" используется для определения модели бактерии, Кишечной палочки (E.coli).

Аннотация

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.¹ PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.^2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.⁵

DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.^6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 10¹⁶ individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).^9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.^6-8

Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.^17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.

More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.⁵ These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.

Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).⁵ This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).

Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

протокол

1. Подготовка химических растворов

1. 0,5 М этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА): В 2-х литровый (L) пластиковый стакан, вес 186,1 г ЭДТА (EM Science) и добавить 800 мл (мл) из автоклавного деионизированной дистиллированной водой (DDH ₂ O). Скорректировать значение рН до 8,0 с помощью NaOH гранул (EM Science). Сделать окончательный объем до 1 л использованием DDH ₂ O. Передача решения стеклянные бутылки, автоклав и хранить при температуре 4 ° C.
2. 10 × Трис-борат раствором ЭДТА (10 × КЭ, 89 мМ трис, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН 7,5): Взвесить 432 г Трис-основание (BioShop Канада) и 220 г борной кислоты (BioShop Канада) , а также добавлять к каждому 4 л пластмассовых стаканчиков. Измерьте 80 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) и добавить в стакан. Добавить DDH ₂ O до конечного объема в 4 Л. Тщательно перемешайте раствор с магнитной мешалкой, пока компоненты полностью не растворится. Передача решения стеклянные бутылки, автоклав и хранить при температуре 4 ° C.
3. 10% денатурирующих polyacrylamiде Гель складе: В 4 л пластиковый стакан, добавить 1681,7 г мочевины (BioShop Канада), 400 мл 10 × КЭ, 1 л 40% акриламида / бисакриламид (29:1) решение (BioShop Канада). Регулировка громкости на 4 л с DDH ₂ O. Растворите мочевины при перемешивании. Перенесите раствор до 1 л янтаря стеклянные бутылки и хранят при температуре 4 ° C. (Внимание! Акриламид должны быть обработаны с перчатки, маски, защитные очки и халат, потому что это нейротоксин до полимеризации).
4. 2 × гель загрузки буфера (2 х GLB): Для 200 мл стакан стекло, добавить 44 г мочевины, 8 г сахарозы (BioShop Канада), 10 мг бромфенола синий (BioShop Канада), 10 мг xylenecyanol FF (Sigma -Aldrich), 400 мкл 10% сульфата натрия додецилсульфат (SDS; BioShop Канада) и 4 мл 10 × КЭ. Установите конечный объем до 40 мл DDH ₂ O и растворяются твердые тела с легким отопления (50 ° C) и перемешивание с магнитным бар. Передача 1 мл аликвоты в 1,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при 4 ° C. Основываясь на нашемОпыт показывает, что необходимо тепло 2 х GLB кратко на 90 ° C до использования, потому что 2 х GLB затвердевает под условия хранения.
5. 1 М Трис-HCl (рН 7,5): Взвесить 12,1 г трис-базой в 200 мл стакан стекло. Добавить 60 мл DDH ₂ O и растворяются твердые тела при перемешивании магнитной мешалкой. Скорректировать значение рН до 7,5 с помощью 1 М HCl (Sigma-Aldrich). Макияж объем до 100 мл с DDH ₂ O и трансфер в стеклянную бутылку и автоклав. Хранить при температуре 4 ° C.
6. 5 М NaCl: В стеклянный стакан весом 58,4 г NaCl (BioShop Канада) и растворить в 150 мл DDH ₂ O. Регулировка громкости до 200 мл с DDH ₂ O. Перенесите раствор в стеклянную бутылку, автоклав и хранить при температуре 4 ° C.
7. Буфера элюции ДНК: в стеклянном стакане, смешайте 2 мл 1 М Трис-HCl (рН 7,5), 8 мл 5 М NaCl и 0,4 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Регулировка громкости до 200 мл с DDH ₂ O. Автоклав и хранить при температуре 4 ° C.
8. 2 × реакционного буфера (2 × РБ, 100 мМ HEPES, 300 мМ NaCl, 30 мМ MgCl _2): К 50 мл Сокол трубки (BD Falcon), добавляют 1,2 г HEPES (BioShop Канада), 0,88 г NaCl и 0,30 г MgCl ₂ • 6H ₂ O (EMD Chemicals) и 30 мл DDH ₂ O. Перемешайте, встряхивая, пока мягко компоненты полностью не растворится. Скорректировать значение рН до 7,5, добавляя 10 N NaOH решения и корректировать конечный объем до 50 мл с DDH ₂ O. Очисти решение с помощью шприца управляемой фильтр (0,22 мкм, Millipore) и хранить при температуре 4 ° C.
9. Лурия Бертани (LB) Отвар: В стакан, вес 20,0 г порошка LB (Sigma-Aldrich) с последующим добавлением 1 л DDH ₂ O. Тщательно перемешайте раствор с магнитной мешалкой, передавать решение коническую колбу. Автоклава решения и хранить при комнатной температуре.
10. 1,5% LB агар: Взвесить 1,5 г агара (BioShop Канада) в 250 мл колбу и добавить 100 мл жидкости LB. Автоклава смесь и хранить при комнатной температуре.
11. Агар покрытие: Мелт LB агар в микроволновой печи и охлаждают раствор до 50 ° C. Залейте раствор в чашки Петри (Fisher Scientific) в пламени. По нашему опыту, 100 мл LB агар может дать 5-6 пластин.

2. Строительство RFD-EC1 и RFSS1 по шаблону опосредовано ферментативного лигирования

RFD-EC1 (рис. 2) является признакам DNAzyme. Он состоит из каталитического EC1 последовательность и подложки последовательность FS1 (показано черными и зелеными линиями на рис. 2А). RFSS1 (рис. 2) представляет собой зашифрованный версия RFD-EC1 где каталитического EC1 последовательность частично перемешиваются в SS1 но FS1 часть остается неизменной. RFD-EC1 и RFSS1 были сделаны по шаблону опосредовано ферментативного лигирования олигонуклеотидов FS1 с олигонуклеотидом EC1 или SS1 в присутствии LT1 как перевязка шаблон (см. вставлены окна на рис. 2А). Порядок проведения реакции лигирования приводится ниже.FS1 была получена из Услуги Кек Oligo Синтез Йельского университета, снимают защиту и очищали с помощью гель-электрофореза после ранее установленным протоколом. ^17-24 EC1, SS1 и LT1 были приобретены интегрированные технологии ДНК и очищали с помощью гель-электрофореза.

1. Подготовьте 100 мкМ фондовый решение FS1, EC1, SS1 и LT1 использованием DDH ₂ O. Храните их при температуре -20 ° C до использования.
2. Передача 5 мкл FS1 маточного раствора до двух 1,5 мкл труб микроцентрифужных помечен как труба 1 и трубы 2. В каждую пробирку, добавьте 38,5 мкл DDH ₂ O, а затем 5 мкл 10 х T4 полинуклеотидной киназы (ПНК) реакционный буфер (MBI Fermentas), который содержит 500 мМ Трис-HCl (7,6 рН, 25 ° C), 100 мм MgCl _2, 50 мМ ДТТ, 1,0 мм спермидин. Смешайте каждого решения с помощью пипетки (пипеткой решение вверх и вниз несколько раз).
3. Добавить 1 мкл АТФ (100 мм; MBI Fermentas) и перемешать с помощью пипетки.
4. Добавить 0,5 мкл T4 полинуклеотидной киназы (PNK, 10 ед / мкл; MBI Fermentas) и перемешать с помощью пипетки. Инкубируйте реакционной смеси при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Убедитесь, что для покрытия труб с алюминиевой фольгой, чтобы минимизировать фотообесцвечивания флуорофора.
5. Гашения реакции при нагревании при температуре 90 ° С в течение 5 мин. Охладите реакционной смеси при комнатной температуре в течение 10 мин.
6. Добавьте 5 мкл EC1 и SS1 фондовый решение труб 1 и трубы 2, соответственно.
7. Добавьте 5 мкл LT1 маточного раствора в каждую пробирку, перемешайте с помощью пипетки. Нагрейте реакционной смеси при 90 ° С в течение 1 мин и охладить до комнатной температуры в течение 10 мин.
8. Добавить 118 мкл DDH ₂ O, а затем 20 мкл 10 х T4 ДНК-лигазы буфера (MBI Fermentas), который содержит 400 мМ Трис-HCl (рН 7,8 при 25 ° С), 100 _мМ MgCl2, 100 мМ DTT, и 5 мМ АТР. Смешайте раствор с помощью пипетки.
9. Добавьте 2 мкл T4 ДНК-лигазы (5 ед / мкл; MBI Fermentas) и перемешать с помощью пипетки. Инкубируйте реакционной смеси при комнатной температуре в течение 1 часа.
10. Добавить 20 мкл 3 М NaOAc (рН 7,0) в каждую пробирку, вихревые и спином вниз. Добавить 500 мкл холодного 100% этанола в каждую пробирку, перемешайте раствор встряхивая и поместить пробирки в морозильной камере -20 ° C в течение 30 мин.
11. Центрифуга смесей на 11000 г в течение 20 мин при 4 ° C в охлажденном центрифуги (Allegra X22-R, Beckman Coulter) и осторожно удалите супернатант с помощью пипетки.
12. Высушите осадок в ДНК ДНК концентратора (Savant ДНК Speedvac, Thermo Scientific) в течение 10 мин.
13. Ресуспендируйте ДНК гранул в 30 мкл 1 × гель загрузки буфера (GLB), кратко вихря и спином вниз с центрифуги настольные (Minicentrifuge, VWR Scientific). Лигировали образцов ДНК готовы к загрузке на 10% dPAGE геля.

3. Подготовка 10% dPAGE гель

Ниже кратко описаны аппарат электрофореза и его настройки. Для большей информации о аппарата, настройки и обработки, пожалуйста, обращайтесь тО наших ранее опубликованных протоколов. ^30,31

1. Промойте и высушите двух стеклянных пластин, две распорки 0,75 мм и 16-и расческу. Соберите стеклянных пластин и прокладок с клипами и лежал горизонтально на ровную поверхность с зубчатым стеклом вверх.
2. Трансфер 40 мл 10% dPAGE смесь в 150 мл стакан. Добавить 40 мкл тетраметилэтилендиамин (TEMED; Bioshop Канада), 400 мкл 10% APS, и перемешать, вращая с пипетки.
3. Вылейте смесь тщательно между пластинами и сразу вставить гребень. Оставьте смесь для полимеризации от 10 до 20 мин. Полимеризация может быть подтвержден путем проверки остаточных смесь гель остается в стакан.
4. После полимеризации удалите гребень мягко и промыть лунки с DDH ₂ O для удаления остатков решение геля в скважинах.
5. Установить пластины на аппарат гель-электрофореза с прямоугольной пластины без надреза наружу и поставить металлическую пластину за зубчатой ​​пластиной. Использование металла плели помогает предотвратить перегрев, который может взломать стеклянных пластин.
6. Добавить 1 × КЭ в верхней и нижней палат аппарата. Убедитесь в том, что скважины заполняют буфер и нижний край гель погружен в буфере.
7. Применение 40 мА (или 750 В) тока и предварительно выполнить от 10 до 15 мин.

4. Очистка лигировали RFD-EC1 и RFSS1 на 10% dPAGE гель

1. После шага 3.7, промыть скважины с 1 × КЭ с помощью шприца и иглы.
2. Загрузите перевязки смесь RFD-EC1 и что из RFSS1 (с 2.13) в 2 скважины (по одной на каждый) с помощью пипетки и гель загрузкой советы (Диамед). Применение 40 мА (750 В) тока до нижней красителя (бромфенола синий) примерно на 5 см выше нижнего края пластин.
3. Удалить стеклянных пластин из аппарата ход гель, лечь на плоской вершине скамейке и осторожно снимите распорки.
4. Аккуратно снимите верхнюю стеклянные пластины с гелем иобернуть гель с полиэтиленовой пленкой (попробуйте избежать морщин и складывания обертывания на гель).
5. Лигированных продукты могут быть визуализированы либо УФ слежки (260 нм) или просвечивание (360 нм), который будет производить видимом диапазоне ДНК на несколько сантиметров выше EC1 или SS1 (100 пмоль EC1 или SS1 может быть использован в качестве маркера и загружается в скважину в шаге 4.2). Отметьте нужное ДНК полос с маркером.
6. Акцизные полосы ДНК стерильной лезвия, сократить гель на мелкие кусочки и передачи в свежем 1,5 трубки микроцентрифужных мл.
7. Раздавить гель частей в микроцентрифужных трубки с помощью стерильного наконечником пипетки (200 мкл размера наконечника).
8. Добавить 500 мкл буфера элюции ДНК в каждую пробирку и покрывают их с алюминиевой фольгой для защиты от света флуорофоров. Vortex образцов в течение 10 мин.
9. Центрифуга образцы на 11000 г в течение 4 мин при 4 ° C в охлажденном центрифуги (Allegra X22-R, Beckman Coulter) и осторожно передавать 350 мкл сupernatant к новому 1,5 мл микроцентрифужных трубки (в случае необходимости, второй элюирования можно сделать с 350 мкл свежей буфер элюирования в течение еще 10 мин.)
10. Добавить 35 мкл (0,1 × объема образца) от 3 М ацетата натрия (NaOAc, рН 7,0) в каждую пробирку, перемешайте на вортексе и спином вниз. Добавить 900 мкл холодного 100% этанола в каждую пробирку. Смешайте каждого образца рукопожатий трубку в течение нескольких секунд. Поместите трубы при температуре -20 ° С в течение не менее 1 часа.
11. Центрифуга образцы на 11000 г в течение 20 мин при 4 ° C в охлажденном центрифуги и осторожно удалите супернатант с помощью пипетки.
12. Добавить 100 мкл холодного 70% этанола и использовать его аккуратно промойте все внутренние стенки трубки. Re-центрифуге при 11000 г в течение 7 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и высушить осадок в ДНК концентратора в течение 10 мин.
13. Растворите гранулы ДНК в 100 мкл DDH ₂ O и вихрь. Определить концентрацию ДНК на основе УФ-поглощению при 260 нм. Хранить образцы при -20° C до использования.

5. Подготовка бактерии

1. Целевая бактериального штамма E. палочки K12 (MG1655) и соответствующих штаммов контроля во-первых высевали на LB пластины агара из глицерина акций. Под огонь или в кабинете биологической безопасности, прикоснуться к бактериальным акции глицерин стерильным наконечником пипетки и нежно полоса на поверхности пластины, чтобы не повредить LB агара.
2. Обратить прожилками пластин и инкубируют при 37 ° C в течение 14 часов. После инкубации уплотнения по всему периметру плиты с парафильмом (Pechiney пластиковая упаковка) и хранить при 4 ° C. Эти плиты можно хранить не более 4 недель.

6. Подготовка сырой внеклеточной смесей (ПОВ)

1. Внесите 2 мл LB в стерильные 14 мл культуры труб (BD Сокол) с помощью пистолета пипетки (Corning).
2. Используя стерильный наконечник пипетки, выберите одну из колоний агар пластин подготовлен в шаге 5.2 и вставьте его в переменный токulture трубку. Место труб в инкубатор (New Brunswick Scientific) установлен на уровне 37 ° С, и трясти на 250 оборотов в минуту в течение 14 часов.
3. 1% повторной прививки культуры: Внесите 2 мл свежей LB в 14 мл культуры труб и шип с 20 мкл бактериальных культур подготовлен в шаге 6.2. Инкубировать пробирки при 37 ° C при встряхивании на 250 оборотов в минуту, пока каждый бактериальных решение достигает OD ₆₀₀ (оптическая плотность измеряли при 600 нм) примерно в 1. Чтобы измерить OD _600, передают 1 мл каждая культура одноразовых кювет и мера оптической плотности при 600 нм с УФ-спектрофотометр (Genesys УФ-10, Thermo Scientific).
4. Передача 1 мл каждой культуры на новый 1,5 мл трубки микроцентрифужных и гранул клеток путем центрифугирования при 11000 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Передача четкого супернатант к новому 1,5 мл трубки микроцентрифужных и хранить при температуре -20 ° С, если не используется сразу.

7. Обнаружение с помощью флуоресцентной спектрофотометр

1. Включите спектрофотометра флуоресценции (Cary Eclipse, Varian Inc) и настроить параметры сбора данных при возбуждении на 488 нм и излучения на длине волны 520 нм. Чтения могут быть приняты каждую минуту в течение 1 часа.
2. Промыть 3 кварцевых кюветах кристалла (Varian Cary) с DDH ₂ O, а затем 100% этанола. Высушите кювет миганием азота. Этикетка кювет C1 (контроль 1), С2 (контроль 2) и T (тест).
3. Трансфер 24 мкл DDH ₂ O С1 и 24 мкл CEM-ЕС в C2 и Т. Добавить 25 мкл 2 × РБ каждой кюветы и место их флуоресценции спектрофотометр. Начать сбор данных флуоресценции в течение первых 5 мин.
4. Добавить 1 мкл RFSS1 (от 5 мкм маточного раствора) до C2 и 1 мкл RFD-EC1 (от 5 маточного раствора мкМ) Т и C1. Смешайте каждого решения с помощью пипетки. Это должно быть тщательно инициировал так, что флуоресценция показания не прерывается. Позвольте реакции продолжать до конца 1 раз в приобретении час.
5. Экономитьданных в формате Excel, передачи данных на персональный компьютер и обрабатывать данные для создания графического изображения.

8. Обнаружение помощью гель-электрофореза

То же реакционные смеси, подготовленный в шаге 7,4 могут быть использованы для анализа с помощью гель-электрофореза; альтернативно новые реакции могут быть получены так же и инкубировали в пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных. В любом случае:

1. Quench реакции (через 1 час), добавив 5 мкл 3 М NaOAc и 125 мкл 100% этанола. Смешайте каждого решения по встряхивая и поместить пробирки в морозильной камере -20 ° C в течение 1 часа.
2. Центрифуга реакционной смеси в 11 000 г в течение 20 мин при 4 ° С и тщательно удалите супернатант с помощью пипетки.
3. Сухие гранулы использованием ДНК концентратора в течение 10 мин.
4. Ресуспендируйте гранул в 20 мкл 1 × GLB коротко встряхивая. Спином вниз трубы очень кратко центрифуга настольная (Minicentrifuge, VWR Scientific). Эти образцы читатьу для загрузки в виде геля dPAGE.
5. Подготовьте 10% dPAGE гель, как описано в 3,1-3,7. Загрузите реакцию образцов (с шагом 8.4) в лунки помощью пипетки и гель загрузкой советы (Диамед). Применение 40 мА (750 В) тока до нижней красителя (бромфенола синий) примерно на 5 см выше нижнего края пластин.
6. Удалить стеклянных пластин и тщательно промыть проточной водой, чтобы удалить гель штук. Протрите пластины с kimwipe (Kimberly-Clark Professional).
7. Сканирование гель пластина для флуоресценции с помощью сканера Typhoon (Тайфун 9200, Переменный режим, GE Healthcare). Анализ данных с помощью программного обеспечения ImageQuant (Molecular Dynamics).

9. Обнаружение Специфика

1. Для тестирования бактериальных специфика, те же процедуры, описанной выше для культивирования E. палочки, готовит свои CEM и проведения анализа реакции расщепления могут быть выполнены в течение нескольких различных штаммов бактерий, таких как B. Сенная, П. Пели, Е. ruckeri, Л. рlanturum, П. acidilactici (показано на рис. 3А).

10. Одноместный обнаружения сотового

Подготовить 1 мл E. палочки глицерин акции 2 КОЕ / мл (КОЕ: колониеобразующих единицы) от серийного разведения и подтвердить КОЕ концентрации покрытие ⁵ Эта акция должна содержать 0,2 CFU/100 мкл.. Хранить при температуре от -80 ° C до использования.

1. Подготовить 10 культура пробирки, содержащие 2 мл LB.
2. Инокулировать каждой культуры с 100 мкл 2 КОЕ / мл глицерина акции и инкубировать при температуре 37 ° C при встряхивании при 250 оборотах в минуту. Использование весь запас глицерина (1 мл) должно дать 10 культур.
3. Урожай 300 мкл каждого из привитых в пробирку на следующие моменты времени: 4, 8, 12, 16 и 24 часов. Оставьте остальные культуры растут в течение 24 часов.
4. Измерить диаметр ₆₀₀ и осаждения клеток путем центрифугирования при 11000 г в течение 5 мин.
5. Перенести на свежий ПОВ 1,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при -20 и гнапример, C до использования.
   Примечание: Так может и не быть обнаружены OD ₆₀₀ для образцов, собранных во время пункты 4, 8 и 12, позволяют оставшиеся культуры растут в течение 24 часов с целью выявления культур, содержащих бактерии (определяется по мутности и OD измерения). Только один или два 10-культур может содержать E. палочки после прививки, а остальные трубы не будет содержать никаких клеток.
6. Используйте ПОВ оправился от положительных культур (хранить при температуре -20 ° C) в назначенное моменты времени для подготовки реакции расщепления с RFD-EC1, а затем анализировать реакционной смеси с помощью электрофореза dPAGE гель, как описано в разделе 8.

11. Концепция и представитель Результаты

Концепция использования РНК-расщепляющих люминесцентные DNAzyme (RFD) для бактериальных обнаружения показан на рис. 1. RFD расщепляет химерных ДНК / РНК субстрат на одинокого РНК связи (синий R) в сопровождении двух нуклеотидов помеченыс флуорофора (F) и гасителем (Q), соответственно. Как бактерии интерес (например, кишечная палочка) растет в средствах массовой информации, он оставит позади сырой внеклеточной смеси (CEM). Это CEM в целом, то, используемые в эксперименте на лабораторных выбор для получения RFD, отвечающей специально для CEM, предположительно RFD взаимодействует с определенным молекулы (фиолетовая звезда) в CEM это подпись молекулы бактерии. Когда CEM добавляется в раствор, содержащий реакцию RFD, это вызывает РНК-расщепляющих деятельности RFD. Расщепление событие отделяет F от Q, в результате флуоресцентный сигнал, который может быть обнаружен, либо используя флуориметра или гель-электрофореза.

Экспериментальная проверка над концепцией было сделано с CEM из E. палочки (CEM-ЕС). Мы получили 3 RFD молекул через выбор в пробирке, и наиболее эффективным был назначен RFD-EC1 (рис. 2). ⁵ Втэлектронной испытания расщепления деятельности RFD-EC1 (вместе с мутантом последовательность имени RFSS1) в ответ на CEM-ЕС. Оба RFD-EC1 и RFSS1 были подготовлены ферментативного лигирования DNAzyme части к основанию FS1 (все последовательности показан на рис. 2А). В флуоресценции эксперименте измерений (рис. 2В), CEM-ЕС инкубировали только в течение 5 минут, с последующим добавлением в RFD-EC1 или RFSS1, а также дальнейшей инкубации в течение 55 минут больше. Интенсивность флуоресценции раствора непрерывно читать каждую минуту, и данные были использованы для расчета относительной флуоресценции (РФ, рассчитываемый как отношение интенсивности флуоресценции в момент т против интенсивности флуоресценции во время 0). РФ против значения времени инкубации приведены на рис. 2B. Было установлено, что RFD-EC1 производства высокого уровня флуоресцентного сигнала при добавлении CEM-ЕС, в противоположность этому, RFSS1 не производит сильного сигнала флуоресценции. Таким образом, флуоресценция производству фуемки по RFD-EC1 на контакт CEM-ЕС является последовательностью конкретных.

Для того, чтобы убедиться, что наблюдаемое увеличение флуоресценции связаны с расщеплением связи РНК, мы проанализировали реакцию смесей dPAGE. Расщепление RFD-EC1, как ожидается, генерировать два фрагмента ДНК, 5 'фрагмент сохраняя флуорофора и 3' фрагмента сохранить утоления. Только нерасщепленного RFD-EC1 (unclv) и 5 ​​'фрагмент (CLV), могут быть обнаружены с помощью флуоресценции. DPAGE результат, показанный на рис. 2C показывает, что реакция смеси RFD-EC1 и CEM-ЕС действительно дали ожидаемых продуктов расщепления, а RFSS1/CEM-EC смеси не было.

Специфика RFD-EC1 были изучены с помощью ПОВ собраны из ряда других грамотрицательных и грамположительных бактерий, и данные приведены на рис. 3А. Только образца, содержащего CEM-EC (синяя кривая) производится увеличение флуоресценции. Отсутствие перекрестной реактивности с ПОВот других бактерий указывает, что RFD-EC1 обладает высокой избирательностью в отношении E. палочка.

Мы также рассмотрели время, необходимое для выращивания одного E. кишечной клетки для того, чтобы производить достаточное CEM, которые могут вызвать расщепление RFD-EC1. Для этого эксперимента, Е. палочки образца, содержащего определенный КОЕ (колониеобразующих единиц) было достаточно, разбавляли для достижения концентрации 1 КОЕ / мл. За этим последовал путем смешивания 100 мкл разбавленного образца с бактериальной питательной среды и культивирование его на 4, 8, 12, 16 и 24 часов. ПОВ затем были собраны для каждого timepoint и протестированы для стимуляции расщепления деятельности RFD-EC1. DPAGE результат, показанный на рис. 3B показывает, что культивирование время 12 часов не требуется.

Важно отметить, что небольшое увеличение начального сигнала, наблюдаемого на флуоресцентных измерений после добавления RFSS1 последовательности (в качестве отрицательного контроля) в CEM-EC (рис. 2, б, красный curvе) или RFD-EC1 других бактериальных ПОВ (рис. 3В, все кривые, за исключением синего) относится к собственной флуоресценции модуля FRQ (в связи с неполным тушения F на Q). Таким образом, ожидается, что добавление F-и Q-меченных последовательности будет производить начальное увеличение флуоресценции. Тем не менее, только RFD-EC1/CEM-EC смеси способны производить высокий уровень флуоресценции с течением времени.

Рисунок 1. Схематическое изображение РНК-расщепляющих люминесцентные DNAzyme (RFD) зонд, который флуоресцирует при контакте с сырой внеклеточной смеси (CEM) производства конкретных бактериальных клеток, представляющих интерес. RFD расщепляет химерных ДНК / РНК субстрат на одинокого РНК связи (синий R) в сопровождении двух нуклеотидов, меченных флуорофора (F) и гасителем (Q), соответственно. Перед реакции расщепления, уровень флуоресценции в RFD является минимальным благодаря тесному близость Р и Q. После расщепления, Q отличается от F, в результате сильного флуоресцентного сигнала производится.

Рисунок 2. Е. палочки зондирования РД. (A) RFD-EC1 является DNAzyme зонд, который может быть активирован CEM-ЕС. RFSS1 это зашифрованная последовательность RFD-EC1 использовали в качестве контроля. RFD-EC1 и RFSS1 были произведены путем лигирования FS1 с EC1 и SS1, соответственно, в присутствии LT1 в качестве шаблона. F: флуоресцеин модифицированных дезокситимидина. Вопрос: Dabcyl модифицированных дезокситимидина. R: аденин рибонуклеотид. (B) флуоресценции сигнализации профили RFD-EC1 и RFSS1 в присутствии CEM-ЕС. (C) dPAGE анализ реакции расщепления смесей в B (время реакции: 60 мин.) На фото это флуоресценции образ dPAGE геля, полученного с сканером Typhoon. Лейн NC: RFD-EC1 или RFSS1 в реакции буфера в одиночку, пер CEM-ЕС: RFD-EC1 или RFSS1 в реакции буфер, содержащий CEM-ЕС. Маркер: RFD-CE1 лечение с 0,25 N NaOH, процедура как известно, вызывает полное расщепление РНК. unclv: нерасщепленного RFD-EC1. CLV: расщепление фрагмента, содержащего флуорофора.

Рисунок 3. (A) флуоресценции сигнализации профиля RFD-EC1 в ПОВ приготовленные из различных бактериальных клеток. ЕС: кишечная палочка-K12, ПП: Pseudomonas Peli, BD: Brevundimonas diminuta; HA: Hafnia alvei, YR: Yersinia ruckeri; О.Г.: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans, MO: Moraxella osloensis; AI: Acinetobacter lwoffi; СФ: Serratia fonticola, BS: Сенная палочка, Л.М. Leuconostoc mesenteroides, LP: Lactobacillus planturum, PA: Pediococcus acidilactici, АО: Actinomyces восточная. Каждый образец CEM инкубировали в течение 5 мин с последующим добавлением в RFD-EC1. (B) dPAGEАнализ RFD-EC1/CEM-EC смеси после 60-минутной реакции. Лейн НС1: RFD-EC1 в реакции буфера в одиночку. Лейн НС2: RFD-EC1 в реакции буфер, содержащий CEM-BS (CEM приготовленные из Сенная палочка). Полос с надписью 4, 8, 12, 16 и 24: RFD-EC1 в реакции буфер, содержащий CEM-ЕС взяты из бактериальной культуры, содержащие один E. кишечной клетки после вегетационного периода 4, 8, 12, 16 и 24 ч соответственно.

Обсуждение

Большинство общих методов обнаружения бактериальной сегодня либо медленно (классический микробных) или технически сложных (антитела, ПЦР). Таким образом, мы считаем, что новое поколение средств обнаружения должно удовлетворить на скорость и простоту. С этой целью мы создали РНК-раскалывания и флуоресценции сигнализации DNAzyme которые могут быть использованы для разработки простых тестов, чтобы сообщить о наличии бактерий через поколение сигнала флуоресценции. Рекомендуемые DNAzyme зонд, RFD-EC1, активируется CEM производятся в процессе роста E. палочки в культуре средств массовой информации. Так как наш метод использует сырье внеклеточной смеси бактерий в качестве целевого обнаружения и обходит трудоемкая добыча цели и усиление шагов, он может быть использован для создания очень простая, "сочетание и читать" типа тестов для выявления бактериальных. Использование наших DNAzyme не ограничивается флуоресценции на основе метода обнаружения. Например, колориметрический обнаружения с использованием той же системы DNAzyme анализ сбыть разработаны с использованием ранее метод, который использует прокатки усиления круга в сочетании с органическим красителем ^32. Мы предвидим использования DNAzymes для обнаружения бактериальных как привлекательный путь к созданию новых бактериальных биосенсоров с большей простотой эксплуатации.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу или модели
Агар	BioShop Канаде	AGR003
Персульфат аммония (APS)	BioShop Канаде	AMP001
Акриламид / бис-акриламид (40%, 29:1)	BioShop Канаде	ACR004
Борная кислота	BioShop Канаде	BOR001
Bromophenol синий	Sigma-Aldrich	B8026
ЭДТА	EM науки	EXO539-1
HCl	Sigma-Aldrich	38281
HEPES	Bioshop Канаде	HEP001
LB бульоне	Sigma-Aldrich	L3022
MgCl 2	EMDХимические вещества	B10149-34
NaCl	BioShop Канаде	SOD002
NaOAc	EMD химическими веществами	SXO255-1
NaOH	EMD химическими веществами	SXO590-1
SDS	BioShop Канаде	SDS001
TEMED	BioShop Канаде	TEM001
Трис-основание	BioShop Канаде	BST666
Твин-20	Sigma-Aldrich	P9416
Мочевина	BioShop Канаде	URE001
Xylenecyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126
ДНК концентратор	Thermo Scientific	Savant ДНК SpeedVac 120
Millex фильтра	Millipore	SLGP033RS
Советы гель загрузкой	Диамед	TEC200EX-K
ImageQuant программного обеспечения	Молекулярная динамика	Версия 5.0
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34705
Мини Vortexer	VWR	58816-121
Парафильмом	Pechiney пластиковой упаковки	PM996
Чашки Петри	Fisher Scientific	Fisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (Пипетка пушка)	Гранулирование	07764714
Кварцевые кюветы	Varian Inc	66-100216-00
Шейкер / инкубатор	New Brunswick Scientific	Классическая серия C24
Тайфун сканер	GE Healthcare	9200 Переменный режим
Центрифугировать	Beckman Coulter	Allegra X22-R
УФ-спектрофотометр	Thermo Scientific	GenesysUV 10
Флуоресцентный спектрофотометр	Varian Inc	Кэри затмение