الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Summary

لسهولة صيانة والترويج لالخيطية C. ايليجانس تجعل من كائن نموذج للعمل مع لطيفة. إمكانية مزامنة الديدان يسمح للعمل مع كمية كبيرة من المواد الدراسية في هذه المرحلة التنموية نفسه، ما يسهل دراسة عملية واحدة خاصة في العديد من الحيوانات.

Abstract

بدأ البحث في البيولوجيا الجزيئية والتنموية للايليجانس Caenorhabditis الخيطية في أوائل السبعينات من قبل برينر سيدني، ومنذ ذلك الحين يستخدم على نطاق واسع بوصفه الكائن نموذج ^1. C. ايليجانس تمتلك سمات أساسية مثل الشفافية والبساطة وباختصار دورة الحياة التي جعلت من نظام مناسب التجريبية للدراسات البيولوجية الأساسية لسنوات عديدة ^2. الاكتشافات في هذا الخيطية لها آثار واسعة لأن العديد من العمليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في تطور الحيوان هي ³ حفظها تطوري.

جيم دورة الحياة ايليجانس يمر في مرحلة جنينية، وأربع مراحل اليرقات قبل الحيوانات يبلغون سن الرشد. ولا يمكن للتنمية أن 2 إلى 4 أيام تبعا لدرجة الحرارة. ويمكن في كل مرحلة من المراحل يمكن ملاحظة الصفات المميزة عدة. معرفة سلالته خلية كاملة ^4،5 جنبا إلى جنب مع annotat عميقايون من الجينوم تحويل هذه الديدان الخيطية الى نموذج عظيم في مجالات متنوعة مثل علم الأعصاب ^{6، 7،8} الشيخوخة، بيولوجيا الخلايا الجذعية ⁽⁹⁾ والبيولوجيا الجرثومية خط ^10.

ميزة إضافية أن يجعل C. ايليجانس نموذجا جذابا للعمل مع هو إمكانية الحصول على السكان من الديدان متزامنة في مرحلة معينة من خلال بروتوكول سهلة نسبيا. وأضاف أن سهولة صيانة ونشر هذه الدودة الخيطية إلى إمكانية تزامن توفير أداة قوية للحصول على كميات كبيرة من الديدان، والتي يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التجارب الصغيرة أو الإنتاجية العالية، مثل شاشات رني، ميكروأرس، التسلسل واسع، طخة مناعية أو في التهجين في الموقع، من بين آخرين.

بسبب شفافيتها، C. ويمكن التمييز بين الهياكل ايليجانس تحت المجهر باستخدام المجهر التفاضلية على النقيض من التدخل، والمعروف أيضا MICROS Nomarskiنسخ. استخدام الحمض النووي الموثق فلوري، دابي (4 '،6-diamidino-2-phenylindole)، على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي إلى تحديد هوية محددة، وتوطين الخلايا الفردية، فضلا عن الهياكل التحت خلوية / العيوب المرتبطة بها.

Protocol

1. بروتوكول ج: الديدان التثقيف للتبييض ¹¹

كبير من السكان C. ويمكن الحصول على ايليجانس بواسطة زراعة منهم سواء في وسائل الإعلام السائلة أو الصلبة على وسائل الإعلام في لوحات. وتزرع عادة في NGM الصلبة (وسائط النمو النيماتودا) وبنك الاحتياطي الفيدرالي مع E. البكتيريا القولونية، التي تضاف إلى لوحات إما حيا أو ميتا (قتل بواسطة الأشعة فوق البنفسجية ^12، بفعل الحرارة ⁽¹³⁾ أو من قبل الباردة ^14). الإجراء الأكثر شيوعا يستخدم حية OP50 E. كولاي، الذي هو عيب في تركيب اليوراسيل ولا يمكن كسا الى طبقة سميكة من شأنه أن يحجب الديدان.

1. مزيج 3 غرام من كلوريد الصوديوم، 17 غراما من أجار و 2.5 غرام من البيبتون وإضافة 975 مل من H ₂ O. الأوتوكلاف لمدة 50 دقيقة.
2. تبريد قارورة إلى 55 درجة مئوية.
3. إضافة 1 مل من CaCl M 1 _2، 1 مل من 5 ملغ / مل الكولسترول في الإيثانول، 1 مل من MgSO M 1 ₄ و 25 مل من 1 M العازلة ₄ KPO (جميع من لهم ولكن الكولسترول autoclav سابقاED).
4. باستخدام الإجراءات العقيمة الاستغناء الحل NGM إلى لوحات بيتري؛ ملء صفائح تصل إلى 3/2 من حجمها.
5. جفاف مرة واحدة، فإنه من المستحسن أن ترك لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أيام قبل الاستخدام للكشف عن الملوثات. يعد خط من E. OP50 كولاي من مخزون الجلسرين (يمكن الحصول على OP50 من مركز علم الوراثة Caenorhabditis).
6. اختيار مستعمرة واحدة وتنمو في LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الإثارة.
7. السماح للفائض من حتى تتبخر الرطوبة من لوحات عن طريق إزالة الغطاء في تدفق رقائقي وإضافة OP50 إلى وسط لوحات مع ماصة باستير العقيمة.
8. السماح للE. OP50 العشب القولونية في النمو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو في درجة حرارة 37 م لمدة 8 ساعات.
9. إضافة المبلغ المطلوب من الديدان إلى لوحات (إذا المحتضنة في 37 يجب أن تبرد درجة مئوية لوحات في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام).

نصائح:

• وتتدفق من نفس الكمية من وسائل الاعلامفي لوحات مع ماصة أو موزع مضخة يضمن نفس الحجم من أغار على لوحات ويسهل التحول من لوحة من دون الحاجة إلى إعادة تركيز stereomicroscope.
• ويمكن استخدام لوحات (على حد سواء المصنفة وغير المصنفة مع البكتيريا) بعد عدة أسابيع من المعدة عند تخزينها في وعاء على درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية.
• تجنب الطلاء البكتيريا إلى حافة اللوحة. إذا في حديقة تمتد على حواف لوحة الديدان قد يصل الزحف الجانبين، تجف وتموت.
• الديدان تعيش لفترات أطول إذا كان المصنف البكتيريا على لوحات هي بالفعل القتلى ^15.

2. بروتوكول (ب): المعاملة مع محلول هيبوكلوريت القلوية ("التبييض") ¹¹

يتم استخدام تقنية التبييض لمزامنة C. ايليجانس الثقافات في مرحلة اليرقات الأول (L1). مبدأ الطريقة تكمن في حقيقة أن الديدان حساسة للمبيض في حين أن قشرة البيضة يحمي هmbryos منه. بعد العلاج مع محلول هيبوكلوريت القلوية، وحضنت الأجنة في وسائل الإعلام السائلة من دون طعام، والذي يسمح الفقس ولكن يمنع مزيد من التطوير.

1. تسمح الديدان أن تنمو حتى مرحلة البلوغ.
2. استعادة البالغين حامل في 15 مل من أنابيب غسل الصحون مع عازلة M9.
3. الديدان بيليه بواسطة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 400xg (~ 1500 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي جدول قياسي) في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف.
4. أداء يغسل 1-3 حتى المخزن المؤقت يبدو واضحا من البكتيريا.
5. إضافة الحل المنشود تبيض (الجدول الأول)، وتستنهض الهمم لبعض دقائق (وينبغي رصد تدمير أنسجة البالغين تحت مجهر تشريح وردود الفعل عندما توقفت آثار من البالغين لا تزال مرئية، والتي تأخذ عادة ما بين 3 و 9 دقائق اعتمادا على عدة القضايا، مثل حجم بيليه دودة، المذكورة في مناقشة) (الشكل 3).
6. التوقف عن رد فعل عن طريق إضافة M9 buffeص لملء أنبوب.
7. أجهزة الطرد المركزي بسرعة (منذ العلاج قد يكون لا يزال نشط) لمدة 1 دقيقة في 400 XG وتجاهل طاف.
8. غسل بيليه أكثر ثلاث مرات من قبل ملء أنبوب مع عازلة M9.
9. إضافة 1 مل من عازلة M9 لبيليه، أو وضع البيض لوحات NGM غير المصنف، واحتضان في درجة الحرارة المطلوبة مع الإثارة لطيف. وينبغي توفير التهوية المناسبة (شكل 4).

نصائح:

• هناك حلول مختلفة التبييض، واختيار واحد أن يعمل على نحو أفضل في يديك (الجدول 1، الشكل 1).
• يمكن استرداد البيض وضعت بالفعل على لوحات عن طريق التخلص من سطح أجار بمادة لينة مثل قطعة من فيلم الأشعة السينية.
• قد لا يزال عدد كبير جدا من الحيوانات البالغة يضعف تزامن لأنها تشكل الإمدادات الغذائية للاليرقات في الآونة الأخيرة.
• ارتفاع درجات الحرارة قليلا عن سرعة التطور الذي هو غير مريح أناو تزامن يتخطى أي دودة لأن الفرق في التنمية بين الديدان متزامنة وغير متزامنة ستكون أكبر عند ارتفاع درجات الحرارة.
• يجب تنفيذ حل التبييض فقط قبل استخدامه. وبالإضافة إلى ذلك، تبييض يفقد قوة بعد أن كانت مفتوحة لفترة من الوقت، ويرجع ذلك جزئيا إلى حساسية لها. نقترح على كل زجاجة قسامة جديدة في زقاق صغير العنبر لمنع مثل هذه الخسائر والتقليل من التعرض للضوء.

3. بروتوكول C: التصفيحات دودة

1. الانتظار ما بين 12 و 24 ساعة (من الوقت لاستكمال التطور الجنيني يعتمد على درجة الحرارة) بعد تم إجراء تبييض واستعادة الديدان عن طريق الطرد المركزي (2 دقيقة في 400 x ج).
2. تجاهل طاف ديدان البذور، وعلى لوحات المطلوبة وترك السائل المتبقي الجافة.
3. وضع لوحات في درجة الحرارة المطلوبة.

نصائح:

• يمكن أن تظل اليرقات في L1 العازلة M9 على 15 درجة مئوية على الأقل هزاز لمدة اسبوع وايthout تغييرات واضحة.
• توخي الحذر عند حساب الديدان شئتم البذور لأن الكثير جدا قد يستنفد الغذاء بشكل أسرع مما كان متوقعا والخراب تجربتك. يمكن أن ما يقرب من 500 L1 يبلغون سن الرشد في لوحة 55 ملم دون نفاد المواد الغذائية.

4. بروتوكول D: C. ايليجانس مراقبة

D.1 Nomarski المراقبة

المجهري الفرق المقابل تدخل هو إضاءة المجهر الضوئي تقنية تستخدم لتعزيز تباين في عينات شفافة غير ملوثين. وNomarski كلمة تشير الى منظور المستخدمة، الذى سمى باسم المخترع له. من خلال مراقبة الحيوانات على قيد الحياة ونحن قادرون على دراسة علم وظائف الأعضاء للحيوان مع تعديلات فقط المستمدة من الشلل. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو مثبت وأضاف لا يمكن ملاحظة علامات فلوري في الجسم الحي. هذه حقيقة وإمكانية دمج علامات الفلورسنت لجينة من مصلحة تجعل من الممكن لمتابعة العمليات في ثhich قد تكون لهم علاقة البروتين من الدراسة. باستخدام هذه التقنية المبينة في هذا البروتوكول، يمكن ملاحظة ليس فقط ديدان حية، ولكن يمكن أيضا أن تكون تعافى ومطلي مرة أخرى.

أجار إعداد لوحة (قبل الاستخدام):

1. إعداد الاغاروز 2٪ في الماء وتذوب. إبقاء ذاب في 65 درجة مئوية.
2. وضع شريحتين مع قطعة من الشريط عليها في كلا الجانبين من الانزلاق، والثالثة نظيفة.
3. باستخدام مكان ماصة باستير قطرة من أجار على سطح نظيف.
4. تغطية أجار مع شريحة أخرى نظيفة وضعت على رأس الشرائح 3 عموديا.
5. اضغط بلطف حتى يتم بالارض انخفاض أجار للسمك الفواصل الشريط.
6. مرة واحدة في أجار يتصلب، برفق من الشرائح مسجلة وفصل الشرائح المتبقيين من قبل انزلاق 1 بالنسبة للأخرى.

تصاعد الحيوانات الحية

7. مكان قطرة واحدة (10 ميكرولتر) من 1MM يفاميزول أو أزيد الصوديوم 10-30 ملم على تيانه مركز للمنصة.
8. نقل الحيوانات إلى انخفاض باستخدام معول دودة.
9. وضع بلطف ساترة على الحيوانات واصلاحها في كلا الجانبين مع بعض طلاء الأظافر أو السيليكون.

نصائح:

• إبقاء aliquots من 2٪ الاغاروز في درجة مئوية 4
• يمكن أن تظل الاغاروز ذاب في 65 درجة مئوية واحدة على الأقل يوميا.
• ملاحظة: ليفاميزول هو ناهض مستقبلات النيكوتين التي يتسبب الشلل التشنجي في العضلات ^16.
• أن يكون حذرا، أزيد الصوديوم هي سامة للغاية!

D.2 تثبيت الإيثانول وتلطيخ دابي

بروتوكول الموصوفة هنا يمثل وسيلة سريعة للصباغة الديدان مع دابي، ولكن بسبب dissecation من الدودة بعض الهياكل قد ينطوي على بعض التعديلات. هناك عدة طرق أخرى لإصلاح الديدان السابقة لتلطيخ دابي مثل تثبيت مع حل Carnoy أو الفورمالديهايد التي تحافظ على سلامة أفضل للدودة ¹⁷.

تثبيت الإيثانول (معدلة من ¹⁸⁾

1. مكان ~ 10 ميكرولتر من العازلة M9 (أو الماء) على شريحة المجهر.
2. باستخدام دودة الإختيار نقل بعناية 10-25 الديدان إلى الانخفاض.
3. استعمال ورق الترشيح أو الجزئي ماصة إزالة العازلة M9 قدر الإمكان دون إزالة الديدان أو السماح لهم الجافة.
4. إضافة ~ 10 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 90٪ والسماح لها الجافة.
5. كرر الخطوة 4 مرة أو مرتين.

4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) تلطيخ

6. مزيج دابي مع وسائل الإعلام المطلوب متزايدة للتركيز النهائي من 2 نانوغرام / ميكروليتر.
7. مرة واحدة في الإيثانول قد تبخرت تماما، إضافة 7 ميكرولتر من دابي: تركيب وسائل الاعلام خليط.
8. وضع ساترة واصلاحها في كلا الجانبين مع بعض طلاء الأظافر أو السيليكون. وسوف يكون جاهزا للشرائح دقيقة تقريبا 5 المراقبة بعد إضافة دابي.

نصائح:

• وتصاعد ميدألف يحتوي على الجلسرين، لذلك كمية صغيرة غير كافية لتغطية اعداد كامل.
• هناك طائفة واسعة من وسائل الإعلام التجارية المتزايدة (Fluoromount أو إطالة أمدها، على سبيل المثال)، والجودة والسعر يعتمد على مدى طويل كنت تريد تخزين عينتك.
• كن حذرا، دابي هو المغير المعروفة التي تربط بقوة إلى AT المناطق الغنية في الحمض النووي.

وصفات

الديدان الخيطية متوسطة النمو (NGM)

1.7٪ (W / V) آجار
50 ملي كلوريد الصوديوم
0.25٪ (W / V) البيبتون
1 مم CaCl ₂
5 ميكروغرام / مل نسبة الكولسترول في الدم
25 ملم KPO ₄
1 مم MgSO ₄

M9 العازلة

22mm و KH ₂ PO ₄
42 مم نا ₂ هبو ₄
86 ملم كلوريد الصوديوم
1 مم MgSO ₄

حلول اختبار تبيض

	وصفة # 1	وصفة # 2	وصفة # 3	وصفة # 4	وصفة # 5
الماء (مل)	2.75	3.5	0.5	0.5	1.5
هيدروكسيد الصوديوم (مل)	1.25 (1M)	0.5 (5M)	2.5 (1M)	2.5 (2M)	2.5 (1M)
~ وهيبوكلوريت الصوديوم 4٪ (مل)	1	1	1	2	1
مجموع (مل)	5	5	4	5	5

الجدول أولا مختلفة وصفات حل التبييض لاختبار هذه المادة. وصفات # # 3 و 4 هي 2X، وينبغي أن تضاف إلى نفس الحجم من M9. وقد وصفات لرقم 1، رقم 2 ورقم 5 وذكرت سابقا ^{2، 11، 19.} ~ وNaOCl # 1 هيدروكسيد الصوديوم 0.25M، 0.8٪: تركيزات النهائي ، # 2 هيدروكسيد الصوديوم 0.5M، NaOCl ~ 0.8٪، # 3 هيدروكسيد الصوديوم 0.625M، NaOCl ~ 1٪، # 4 هيدروكسيد الصوديوم 1 م، NaOCl ~ 1.6٪، # 5 0.5M هيدروكسيد الصوديوم، NaOCl ~ 0.8٪.

5. ممثل النتائج

الشكل 1. تم تقسيم المقارنة بين مختلف الحلول 5 تبيض مرتين في حضانة مختلفة. الديدان N2 غسلها مرتين مع M9 إلى خمسة أنابيب مخروطية 15 مل تحتوي على كل حل التبييض. اهتزت بقوة والأنابيب 1 مل نقل إلى أنبوب جديد مع M9 لوقف رد فعل بعد الوقت المحدد. بعد التبييض وحضنت الديدان الإجراء مع 1 مل من M9 على 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في كل حالة على حدة، واتخذ الدنيا صور فقط بعد التبييض، وصور العليا بعد 24 ساعة.

_upload/4019/4019fig2.jpg "ALT =" الشكل 2 "/>
الشكل 2. درجة الحرارة من حل التبييض يؤثر على فعالية العلاج. وتبييض كميات متساوية من الديدان N2 مع نفس الحل تبيض إما فتور في السابق على الجليد لمدة 20 دقيقة أو الاحتفاظ بها في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة نفس الوقت. العمودين على إظهار الصور غادر لتوه بعد التبييض. بعد وحضنت علاج الديدان في أنابيب مخروطية 15 مل مع 1 مل من M9 على 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. الأعمدة على صور العرض حق 24 ساعة في وقت لاحق.

الشكل 3. نسبة بيليه دودة: مرة من حضانة هيبوكلوريت القلوية يؤثر على فعالية العلاج وحضنت 50، 100، 250 و 500 ميكرولتر من بيليه دودة مع 2 مل من محلول التبييض # 3 دقائق 3 و 6 و 9. وتم قياس كمية تحاك L1، الأجنة الميتة وبقايا شظايا الكبار بعد حضانة في 20 درجة مئوية لمدة 2 4 ساعات في أنابيب مخروطية 15 مل مع 1 مل من عازلة M9. وهناك حاجة إلى ما يقرب من ثلاث لوحات متكدسة 55 ملم مع الديدان البالغة في الحصول على 100 ميكروليتر بيليه دودة.

الشكل 4. مطلوب التهوية المناسبة للتفقيس وبقاء C. تم تبييض ايليجانس الأجنة. وبيليه 100 ميكروليتر من الديدان N2 لمدة 6 دقائق وحضنت في أنابيب مخروطية 15 مل مع 1 مل، 5 أو 10، على النحو المحدد، من M9 على 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. الجزء العلوي من هذا الرقم يعرض صورا للثقافات بعد 24 ساعة، حيث تشير الأسهم البيض التي لم تفقس. في الجزء السفلي، وهناك رسم بياني يصور كمية من اليرقات (رمادي فاتح)، وأجنة ميتة (رمادي غامق) بعد 48 ساعة من التبييض في الشروط المنصوص عليها.

tp_upload/4019/4019fig5.jpg "ALT =" الشكل 5 "/>
الشكل 5. دورة حياة C. ايليجانس. أ. تقريبي طول الديدان في مراحل مختلفة. الساعات المطلوبة للوصول إلى كل مرحلة تبعا لدرجة الحرارة (معدل من ^20). ب. Nomarski (حتى) ودابي (أسفل) صورا لديدان مختلفة في المراحل التنموية المشار إليها. يتم تضخيم ملامح الأكثر أهمية في كل مرحلة L1: يشير السهم إلى السلائف في الغدد التناسلية الجسدية والخط جرثومة في وقت مبكر L4: السهم الأسود (Nomarski) يدل على الفرج النامية؛ السهام البيضاء (دابي) تدل على ذراعي الغدد التناسلية في منتصف. في وقت متأخر L4: يشير السهم الفرج النامية في مرحلة ما يسمى شجرة عيد الميلاد الشباب الراشدين: السهم الأسود يدل على وجود الجنين داخل الرحم، ونقاط رأس السهم إلى spermatheca، أبيض السهم يدل على وجود بويضة حامل الكبار:. رأس السهم (دابي) يشير الأجنة المخصبة. سهم في صورة دابي يشير spermatheca.

الشكل 6. مورفولوجيا الفرج في L3، L4 ومراحل الكبار. وفي المرحلة L3 يمكن ملاحظتها إلا تجويف صغير حيث يتم تشكيل الفرج. في L4، هذا التجويف يوسع تشكيل ما يسمى ب "شجرة عيد الميلاد". في البالغين مغلقا بالفعل الفرج. الخطوط الصفراء تشير إلى مكان وجود الفرج في هذه المراحل الثلاث.

الشكل 7. تلوين دابي في L3، L4 في وقت مبكر، المراحل المتأخرة L4 وتعليم الكبار. في L3، هو ممدود خط الجرثومية. في L4، والأسلحة المناسل الحالي U-شكل التشكل. يمكن للحيوانات المنوية في مرحلة متأخرة من L4 يلاحظ في الجزء الأعلى من الغدد التناسلية. الشباب يقدم البويضات. خط الجرثومية الكبار ويعرض البويضات والأجنة. الخطوط الصفراء delimitate خطوط جرثومة في اله مختلف المراحل المذكورة.

الرقم 8. جيم تم تبييض ايليجانس التنمية في 15 و 25 درجة الديدان N2 جيم، حضنت بين عشية وضحاها في M9 والتحريض على 15 درجة مئوية، ونقل إلى لوحات ونمت مرة ذكرت في درجات الحرارة المعلنة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الديدان الخيطية التزامن

وقد وصفت عدة حلول التبييض. حاولنا 5 وصفات مختلفة (الجدول الأول)، وبين أيدينا، فإنها لم تظهر فروق ذات دلالة في تزامن السكان دودة (الشكل 1). ومع ذلك، لم تجاربنا تبين أن المعلمات مثل درجة الحرار...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.