基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

要約

線虫を維持し、伝播の容易さ C.エレガンスそれを使って作業するのに良いモデル生物を確認します。同期ワームの可能性は多くの動物の1つの特定のプロセスの研究を促進するもの、同じ発達段階での被験者のかなりの量で作業することができます。

要約

線虫 Caenorhabditis elegansの分子発生生物学の研究は、シドニー·ブレナーによって1970年代初頭に始まった、それは以降のモデル生物¹として広く使用されています。C.は、線虫は、このようなシンプルさ、透明性と、長年にわたって基本的な生物学的研究に適した実験系²作った短いライフサイクルなどの主要な属性を持っています。この線虫の発見は、対照動物の開発は進化の保存された³であることを多くの細胞および分子プロセスのために広範な影響を持っています。

動物たちが成人に達する前に、C. elegansのライフサイクルは胚のステージと4幼虫の段階を通過します。開発は、温度に応じて2から4日かかる場合があります。の各段階でいくつかの特徴的な形質を観察することができます。深いannotatと一緒に、完全な細胞系譜の知識は^4,5そのゲノムのイオンは^7,8、幹細胞生物学⁹と生殖生物学ライン^10を老化、神経生物学⁶のように多様な分野での優れたモデルには、この線虫をオンにします。

C.を行う追加機能で動作するように魅力的なモデルは、比較的簡単なプロトコルを介して特定の段階で同期ワームの集団を得る可能性である線虫 。この線虫を維持し、伝播の容易さは、このようなRNAiスクリーニング、マイクロアレイ、大規模シークエンシングのような小さなまたはハイスループット実験の多種多様に使用することができますワームを大量に取得するために強力なツールを提供する同期の可能性に加えとりわけイムノブロットやin situハイブリダイゼーション 、。

その透明性、C.のためelegansの構造もノマルスキーマイクロとして知られている、微分干渉コントラスト顕微鏡を用いた顕微鏡下で区別することができますコピーします。蛍光DNAバインダー、DAPI（4 ',6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール）の使用は、例えば、個々の細胞と同様に、それらに関連付けられている細胞内構造/欠陥の特定の識別およびローカライゼーションにつながる可能性があります。

プロトコル

1。プロトコル^：11漂白の培養ワーム

C.の大規模な集団エレガンスは、液体培地または固体培地プレート中のいずれかで培養することにより得ることができます。彼らは通常、固体NGM（線虫の増殖培地）とE.と飼育栽培されている生きているのか死んどちら板（UV ¹²により、熱¹³によってまたは寒い¹⁴によって殺さ）に追加され大腸菌 、。最も一般的な手順は、ライブOP50 E.を使用しています大腸菌 、ウラシルの合成に欠陥があるとワームが不明瞭になる厚い層に生い茂ることはできません。

1. NaClの3グラム、寒天17グラムとペプトン2.5gを混合し、H ₂ Oの975ミリリットルを追加する50分間オートクレーブします。
2. 55℃にフラスコを冷却する
3. 1 M CaCl ₂の1ミリリットル、エタノール中の5 mg / mlのコレステロールの1ミリリットル、1 M MgSO _4を 1 mlの1 M KPO ₄緩衝液25mlの（それらのすべてがコレステロール以前autoclavを追加します。ED）。
4. 滅菌手順を使用してペトリ皿にNGMソリューションを分配する、彼らの体積の2/3にプレートを埋める。
5. 一度乾燥した、それは汚染物質の検出のために使用する前に2〜3日室温でプレートを残すことをお勧めします。 OP50 E.の連勝を準備します。グリセロールストックから大腸菌 （OP50は、線虫遺伝学センターから入手することができます）。
6. シングルコロニーをピックアップし、撹拌しながら37℃で一晩LBでそれを育てています。
7. 層流で蓋を除去することによりプレートから蒸発し、滅菌パスツールピペットを用いて、プレートの中央にOP50を追加するには、水分の過剰なことができます。
8. OP50 E.を許可する大腸菌の芝生は8時間、室温または37℃で一晩成長させる。
9. プレート（37℃でインキュベート場合°Cプレートは使用前に室温に冷却する必要があります）へのワームの所望量を追加します。

TIPS：

• メディアと同じ量の注入ピペットまたはポンプディスペンサーのプレートにプレートに寒天の同じボリュームを確保し、実体顕微鏡のフォーカスを調整し直す必要がなく、プレートのシフトを容易にします。
• 室温または4℃で容器内に格納されているときにプレート（シードと細菌とシーディングの両方）を数週間の準備の後に使用することができます
• プレートの端に細菌をメッキは避けてください。芝生がプレートの端に拡張する場合、ワームは、側面を這い上がる乾燥して死ぬ可能性があります。
• プレート上に播種した細菌はすでに¹⁵死んでいる場合、ワームは、長生きする。

2。プロトコルB：アルカリ性次亜塩素酸溶液で処理（ "漂白^"）11

漂白技術は、Cを同期させるために使用されます第一幼虫の段階で線虫の培養（L1）。卵の殻は、電子を保護しながら、法の原理は、ワームが漂白剤に敏感であるという事実にあるそれからmbryos。アルカリ性次亜塩素酸塩溶液で処理した後、胚は孵化を使用できますが、さらなる発展を防ぎ食品、なくても液体培地中でインキュベートされています。

1. ワームは成虫まで成長することができます。
2. M9バッファーでプレートを洗浄することにより、15 mlチューブに妊娠成人を回復します。
3. 室温で400xg（標準テーブルの遠心上〜1500 rpm）で2分間遠心分離し、上清を捨てることによってペレットのワーム。
4. バッファは、細菌の明確な表示されるまで、1から3回洗浄を行います。
5. 大人の痕跡がまだ表示されているときに所望の漂白液（ 表I）を追加し、いくつかの分間攪拌（成体組織の破壊は、通常、いくつかのに応じて3〜9分かかり、解剖顕微鏡で観察し、反応を停止する必要があります議論で述べたようなワームペレットの量などの問題、、）（ 図3）。
6. M9 buffeを追加することによって反応を停止rは管を埋めるために。
7. すぐに400 xgで1分間（治療がまだアクティブであるかもしれないので）遠心し、上清を捨てる。
8. M9バッファーでチューブを充填することによってペレットを3回洗浄します。
9. ペレットにM9緩衝液1mlを追加したり、非シードNGMプレートに卵を置き、穏やかに撹拌しながら所望の温度でインキュベートする。適切な通気が（ 図4）提供されるべきである。

TIPS：

• 別の漂白ソリューションがありますが、あなたの手の中にうまく機能（ 表1、図1）いずれかを選択します。
• すでにプレート上に卵がこのようなX線フィルムの一部のような柔らかい素材で寒天の表面を解体して回収することができます。
• 彼らは最近、孵化した幼虫の食糧供給を構成するように成体動物の数が多すぎる遺跡では、同期を損なう可能性があります。
• より高い温度が若干不便で開発をスピードアップI同期と非同期のワームとの間の開発の違いは、より高い温度で大きくなるので、fのいずれかのワームは、同期をスキップします。
• 漂白液は、その使用の直前に実行する必要があります。それはしばらくの間、オープンされた後に加えて、漂白剤は、感光性のために一部には、効力を失います。我々はこのような損失を防止し、光への曝露を最小限に抑えるために小さなオレンジ色のボトルに分注し、各新しいボトルをお勧めします。

3。プロトコルC：ワームメッキ

1. 漂白を行った後、12時間および24時間（胚発生が完了するまでの時間は温度に依存する）の間に待機し、遠心（400 xgで2分間）でワームを回復します。
2. 必要なプレート上清、シードワームを破棄し、残りの液が乾燥させます。
3. 必要な温度でプレートを配置します。

TIPS：

• M9、バッファ内のL1幼虫℃で一週間、少なくともロッキングwiを15℃に保つことができる明らかな変化をthout。
• あまりにも多くの人が予想よりも早く食べ物を排気し、実験を台無しにする可能性があるため、シードなるワームを計算するときは注意が必要です。約500 L1は、食物が不足してなくても55ミリメートルの板に成人に達することができます。

4。プロトコルD：C.虫の観察

D.1ノマルスキー観察

微分干渉顕微鏡は、染色透明な試料のコントラストを高めるために使用される光学顕微鏡照明技術です。単語ノマルスキーは彼の発明者にちなんで名付けられ使用されプリズムを指します。生きている動物を観察することによって、我々は、固定化から派生した唯一の変化と動物の生理機能を調べることができます。ない固定が追加されないため、さらに、蛍光マーカーは、in vivoで観察することができます。この事実と、目的の遺伝子に融合蛍光マーカーの可能性はwのプロセスを追跡することが可能にする研究のタンパク質が関与している可能性があるHICH。このプロトコルで説明されているテクニックを使用して、ライブのワームだけでなく、観察することができるが、それらはまた再び回収してめっきすることができる。

寒天パッドの準備（使用直前に）：

1. 水にアガロース2パーセントを準備して溶かす。 65で溶融保つ℃、
2. 第三に、きれいなスライドの両側に、それらのテープの部分を持つ2つのスライドに配置します。
3. パスツールピペットの場所にきれいな表面に寒天のドロップを使用します。
4. 垂直に3つのスライドの上に置か別のきれいなスライドで寒天をカバーしています。
5. 寒天ドロップがテープスペーサーの厚さに平坦化されるように優しく押します。
6. 寒天が固化したら、そっとテープ、スライドを引き出し、もう一方の相対的にスライドさせて、残りの2つのスライドを区切ります。

生きた動物をマウントする

7. トンへレバミゾール1mm以上のアジ化ナトリウムの代わりに1滴（10μl）を10から30 mMの彼はパッドの中心。
8. ワームのピックを使用して、ドロップに動物を転送します。
9. 優しく動物を介してカバースリップを置き、いくつかのマニキュアまたはシリコーン両面でそれを修正します。

TIPS：

• 4℃でアガロース2％のアリコートを保つ
• 溶かしたアガロースは、少なくとも1日に65℃で保存することができます。
• 注：レバミゾールは、痙性筋麻痺^16を誘発するニコチン受容体アゴニストである。
• 慎重に、アジ化ナトリウムは非常に有毒である！

D.2エタノール固定し、DAPI染色

ここで説明するプロトコルはDAPIでワームを染色の迅速な方法を表し、ただし、ため、ワームのdissecationのいくつかの構造は、いくつかの変化をもたらす可能性があります。このような優れたワーム¹⁷の整合性を維持カルノア溶液またはホルムアルデヒドで固定としてDAPI染色前にワームを修正するために、他のいくつかの方法があります。。

エタノール固定^（18から変更）

1. 場所〜顕微鏡スライド上でM9緩衝液10μl（または水）。
2. ワームのピックを使用して慎重に降下に10月25日ワームを転送します。
3. ろ紙またはマイクロピペットを使用すると、ワームを削除するか、それらが乾燥させることなく、できるだけ多くのM9バッファーとして削除します。
4. 〜90％エタノールを10μl添加し、それが乾燥してみましょう。
5. 一度か二度、手順4を繰り返します。

4 ',6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）染色

6. 2 ng /μlに、最終濃度に希望されている実装のメディアでDAPIを混ぜる。
7. マウントメディアの混合物：エタノールが完全に蒸発した後、DAPIの7μlを追加します。
8. カバースリップを置き、いくつかのマニキュアまたはシリコーン両面でそれを修正します。スライドはDAPIを添加した後、約5分の観察のための準備が整います。

TIPS：

• 取付MEDIAはグリセロールが含まれており、少量の製剤全体をカバーするのに十分ですので。
• （Fluoromountまたは延長など）の商用実装メディアの多種多様が存在し、その品質と価格はあなたのサンプルを保存したいどのくらいの時間に依存しています。
• 慎重に、DAPIは、DNAのATリッチ領域に強く結合する既知の変異原である。

レシピ

線虫の増殖培地（NGM）

1.7％（w / v）の寒天
50mMのNaCl
0.25％（w / v）のペプトン
1mMのCaCl ₂
5μg/ mlのコレステロール
25mMのKPO ₄
1 mMのMgSO _4を

M9バッファー

22mmのKH ₂ PO ₄
42のmmのNa ₂ HPO ₄
86 mM NaClを
1 mMのMgSO _4を

テスト漂白ソリューション

	レシピ＃1	レシピ＃2	レシピ＃3	レシピ＃4	レシピ＃5
水（ml）を	2.75	3.5	0.5	0.5	1.5
水酸化ナトリウム（ML）	1.25（1M）	0.5（5M）	2.5（1M）	2.5（2M）	2.5（1M）
次亜塩素酸ナトリウム〜4％（ML）	1	1	1	2	1
合計（ML）	5	5	4	5	5

表I.さまざまな漂白液のレシピはこの記事のためにテストされています。レシピ＃3と＃4が2倍であり、M9の同じボリュームに追加する必要があります。 ＃1、＃2、＃5のレシピは、以前^2、11、19が報告されています。最終濃度：第1位水酸化ナトリウム0.25M、次亜塩素酸ナトリウム〜0.8％ 、＃2のNaOH 0.5M、次亜塩素酸ナトリウム〜0.8％、第3位水酸化ナトリウム0.625M、次亜塩素酸ナトリウム〜1％、第4位水酸化ナトリウム1 M、次亜塩素酸ナトリウム〜1.6％、第5位水酸化ナトリウム0.5M、次亜塩素酸ナトリウム〜0.8％。

5。代表的な結果

図1。二つの異なる培養時間における5つの異なる漂白ソリューションの比較。N2ワームはM9で二回洗浄し、それぞれの漂白液を含む5つの15 mlコニカルチューブに分割された。チューブを激しく振盪し、1mlを指定した時間後に反応を停止するM9を使用して新しいチューブに移した。漂白した後、プロシージャのワームが20 M9の1ミリリットル℃で24時間インキュベートした。それぞれのケースで、下の写真はちょうど24時間後、上部の写真を漂白した後に撮影された。

_upload/4019/4019fig2.jpgの "alt ="図2 "/>
図2。漂白液の温度は、治療の有効性に影響を与えます。N2ワームの均等のボリュームはどちら以前に20分間氷上で冷却したり、同じ時間に25℃に保持し、同じ漂白液で漂白された。ちょうど漂白後の左のショーの写真の2つの列が。治療ワームは24時間20°CでM9の1ミリリットルで15 mlコニカルチューブ中でインキュベートした後。 24時間後、右側のディスプレイの写真の列。

図3。比ワームペレット：アルカリ性次亜塩素酸塩のインキュベーション時間は、治療の有効性に影響を与えるワームペレットの50、100、250、500μlの3、6と9分のためのソリューション第3漂白の2mlでインキュベートした。孵化したL1、死んだ胎児と成人のフラグメントの遺骨が2の20°Cでインキュベートした後、定量した M9バッファー1 mlの15 mlコニカルチューブで4時間。成虫で約3コンフルエント55ミリメートルプレートは、100μlのワームペレットを得るために必要とされている。

図4。適切な通気が孵化し、Cの生存に必要とされる線虫の胚。N2ワーム100μlのペレットを6分間漂白し、24時間、20℃でM9の、指定された、1、5または10ミリリットルで15 mlコニカルチューブ中でインキュベートした。矢印は孵化しなかった卵を示しているところ図の上部には、24時間後に培養液の写真を表示します。下部には、上記の条件で漂白した後の幼虫（ライトグレー）と死んだ胚（濃い灰色）48時間の量を示すグラフがあります。

tp_upload/4019/4019fig5.jpgの "alt ="図5 "/>
図5。 C.のライフサイクルエレガンス 。 。さまざまな段階でワームのおおよその長さ。時間は、温度^（20から変更）指定された発達段階で異なるワームの。B。ノマルスキー（上）およびDAPI（下）写真に応じて各段階に到達するために必要。各フェーズにおける最も重要な機能が拡大されL1：矢印は体生殖腺と生殖系列の前駆体であることを示しL4初期：黒矢印（ノマルスキー）が開発陰部を示し、白矢印（DAPI）は、2つの性腺の腕を示す中期 。 L4後期：矢印は、いわゆるクリスマスツリーの段階で開発陰部を示していますヤングアダルト：黒矢印は子宮内の胎児を示し、矢印は、ポイントは貯精嚢に、白い矢印は卵母細胞を示しています妊娠大人：矢印（DAPI）が指摘するように受精胚。 DAPI画像内の矢印は、貯精嚢を示しています。

図6。 L3、L4と大人の段階で外陰部の形態。L3段階では外陰部が形成されたわ ​​ずかな内腔を観察することができます。 L4で、この内腔は、いわゆる "クリスマスツリー"を形成し展開します。成人では外陰部はすでにクローズされます。黄色の線は、これらの3つの段階で、外陰部の位置を示しています。

図7。 L3でのDAPI染色、初期のL4、L4後期および成人のステージは、L3、生殖細胞系で伸長されています。 L4で、生殖腺アームはU字型の形態を提示します。後期L4段階の精子で生殖腺の遠位部で観察することができます。若い大人は卵母細胞を提示します。大人の生殖系列は、卵母細胞および胚を提供します。黄色の線が目に生殖線をdelimitate電子異なる述べたステージ。

図8℃ で 15〜25℃の N2型ワームで、 エレガンスの開発は 15でM9と攪拌°C、プレートに移し、規定の温度で示された時間を成長に一晩インキュベートし、漂白された。

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ディスカッション

線虫の同期

いくつかの漂白ソリューションが記載されている。我々は5つの異なるレシピを（ 表I）しようとした、我々の手で、彼らはワーム集団の同期に有意差（ 図1）を表示しませんでした。ワームのボリューム（ 図3）、胚を孵化（ 図4）インキュベートされるとM9の量が影響を与えない：しかし、我々の実験は、温度?...

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