Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Resumen

La facilidad de mantenimiento y propagación del nematodo C. elegans Lo convierten en un organismo modelo agradable trabajar con él. La posibilidad de que los gusanos de sincronización permite el trabajo con una gran cantidad de temas en la misma etapa de desarrollo, lo que facilita el estudio de un proceso en particular en muchos animales.

Resumen

La investigación sobre la biología molecular y del desarrollo de los nematodo Caenorhabditis elegans se inició en los años setenta por Sydney Brenner y desde entonces ha sido utilizado ampliamente como un organismo modelo ^1. C. elegans posee atributos clave tales como la simplicidad, la transparencia y el corto ciclo de vida que han hecho un adecuado sistema experimental para estudios biológicos fundamentales desde hace muchos años ^2. Los descubrimientos en este nematodo tener amplias implicaciones debido a que muchos procesos celulares y moleculares que controlan el desarrollo evolutivo de los animales son conservadas ^3.

C. elegans ciclo de vida pasa por una fase embrionaria y cuatro estadios larvarios antes que los animales alcanzan la edad adulta. El desarrollo puede tomar de 2 a 4 días dependiendo de la temperatura. En cada una de las varias etapas rasgos característicos pueden ser observadas. El conocimiento de su linaje celular completo, junto con el ^4,5 annotat profundaión de su genoma convertir este nematodo en un gran modelo en campos tan diversos como la neurobiología ^6, el envejecimiento de ^{7,8, 9} biología de células madre y la biología de la línea germinal ^10.

Una característica adicional que hace C. elegans un modelo atractivo para trabajar con la posibilidad de la obtención de las poblaciones de gusanos sincronizados en una etapa específica a través de un protocolo relativamente fácil. La facilidad de mantenimiento y propagación de este nematodo añadido a la posibilidad de sincronización proporcionar una poderosa herramienta para obtener grandes cantidades de gusanos, que pueden ser utilizados para una amplia variedad de experimentos pequeños o de alto rendimiento, tales como pantallas de RNAi, micromatrices, secuenciación masiva, inmunotransferencia o la hibridación in situ, entre otros.

Debido a su transparencia, C. estructuras elegans pueden distinguirse bajo el microscopio de interferencia diferencial utilizando microscopía de contraste, también conocido como micros Nomarskicopiar. El uso de un ligante de ADN fluorescente, DAPI (4 ',6-diamino-2-fenilindol), por ejemplo, puede conducir a la identificación específica y localización de las células individuales, así como las estructuras subcelulares y defectos asociados a ellos.

Protocolo

1. Protocolo A: El cultivo de gusanos de blanqueo ¹¹

Las grandes poblaciones de C. elegans puede obtenerse mediante el cultivo de ellos, ya sea en medios líquidos o en medios sólidos en placas. Por lo general se cultiva en sólidos NGM (medios de comunicación de crecimiento de nematodos) y alimentados con E. bacteria E., que se añade a las placas ya sea vivos o muertos (muerto por UV ^12, por el calor o por frío ^{13 14).} El procedimiento más común utiliza en vivo E. OP50 coli, que es defectuoso en la síntesis de uracilo y no puede crecer más en una capa gruesa que oscurecen los gusanos.

1. Mezclar 3 g de NaCl, 17 g de agar y 2,5 g de peptona y añadir 975 ml de H ₂ O. Autoclave durante 50 min.
2. Enfriar a 55 ° C.
3. Añadir 1 ml de 1 M CaCl _2, 1 ml de 5 mg / ml de colesterol en etanol, 1 ml de 1 M MgSO ₄ y 25 ml de 1 M KPO ₄ tampón (todos ellos, pero el colesterol previamente Autoclaved).
4. El uso de procedimientos estériles dispensar la solución NGM en placas de Petri, placas de relleno hasta 2/3 de su volumen.
5. Una vez seco, es conveniente dejar las placas a temperatura ambiente durante 2-3 días antes de su uso para la detección de contaminantes. Preparar una racha de OP50 E. coli de un stock de glicerol (OP50 puede obtenerse desde el Centro de Caenorhabditis genética).
6. Elija una sola colonia y crecer en LB durante la noche a 37 ° C con agitación.
7. Permitir el exceso de humedad se evapore de las placas mediante la eliminación de la tapa en el flujo laminar y añadir OP50 al centro de las placas con una pipeta Pasteur estéril.
8. Deje que el E. OP50 césped coli para crecer durante la noche a temperatura ambiente oa 37 ° C durante 8 horas.
9. Añadir la cantidad deseada de los gusanos a las placas (si se incuban a 37 ° C las placas deben enfriarse a temperatura ambiente antes de su uso).

CONSEJOS:

• El vertido de la misma cantidad de mediosen las placas con una pipeta o un dispensador de bomba asegura el mismo volumen de agar para las placas y se facilita el desplazamiento de la placa sin necesidad de reorientar el microscopio estereoscópico.
• Placas tanto sin semillas y sin sembrar con bacterias) se pueden utilizar varias semanas después de preparado cuando se almacena en un recipiente a temperatura ambiente o 4 ° C.
• Evitar placas las bacterias hasta el borde de la placa. Si el césped se extiende a los bordes de la placa de los gusanos puede arrastrarse por los lados, se secan y mueren.
• Los gusanos viven más tiempo si las bacterias en las placas sembradas ya ¹⁵ muertos.

2. Protocolo B: El tratamiento con solución de hipoclorito alcalino ("blanqueo") ¹¹

La técnica de blanqueo se utiliza para sincronizar C. elegans culturas en la primera etapa larval (L1). El principio del método reside en el hecho de que los gusanos son sensibles a la lejía, mientras que la cáscara del huevo protege embryos de ella. Después del tratamiento con solución de hipoclorito alcalino, los embriones se incuban en medios líquidos sin alimentos, lo que permite incubar pero impide un mayor desarrollo.

1. Deje que los gusanos de crecer hasta la etapa adulta.
2. Recuperar los adultos grávidas en tubos de 15 ml por lavado placas con tampón M9.
3. Pellets gusanos por centrifugación durante 2 minutos a 400xg (~ 1500 rpm en una centrífuga de mesa estándar) a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
4. Realizar lavados de 1-3 hasta que el buffer aparece libre de bacterias.
5. Añadir la solución deseada de blanqueo (Tabla I) y agitar durante unos minutos (destrucción del tejido adulto deben ser monitoreados bajo el microscopio de disección y la reacción se detuvo cuando los rastros de los adultos son todavía visibles, que suele durar entre 3 y 9 minutos, dependiendo de varios cuestiones, tales como el volumen de gusano de pellets, mencionado en la discusión) (Fig. 3).
6. Detener la reacción añadiendo M9 buffer para llenar el tubo.
7. Centrifugar rápidamente (ya que el tratamiento todavía puede ser activo) durante 1 minuto a 400 xg y desechar el sobrenadante.
8. Lavar pellet más tres veces llenando el tubo con tampón M9.
9. Añadir 1 ml de buffer M9 de la pastilla, o poner los huevos a las placas de NGM no cabezas de serie, y se incuba a la temperatura deseada con una suave agitación. Aireación adecuada debe ser suministrada (Fig. 4).

CONSEJOS:

• Existen diferentes soluciones blanqueadoras, elegir la que funciona mejor en sus manos (Tabla 1, Fig. 1).
• Los huevos ya establecidos en las placas pueden ser recuperados por el desguace de la superficie del agar con un material blando tal como un trozo de una película de rayos-X.
• Demasiados restos de los animales adultos puede afectar a la sincronización, ya que constituyen una fuente de alimento para las larvas recién eclosionadas.
• Las altas temperaturas ligeramente acelerar el desarrollo, que es un inconveniente if cualquier salta gusano de sincronización debido a la diferencia en el desarrollo entre los gusanos sincronizados y sin sincronizar será mayor a temperaturas más altas.
• Solución de blanqueo debe realizarse justo antes de su uso. Además, el cloro pierde su potencia después de haber sido abierta por un tiempo, en parte debido a su fotosensibilidad. Sugerimos alícuota de cada nueva botella en botellas de color ámbar pequeños para evitar tal pérdida y minimizar la exposición a la luz.

3. Protocolo C: Revestimiento Gusano

1. Esperar entre 12 y 24 horas (tiempo para completar el desarrollo embrionario depende de la temperatura) después del blanqueo se realizó y recuperar gusanos por centrifugación (2 minutos a 400 xg).
2. Descartar el sobrenadante, las semillas de gusanos en las placas necesarias y dejar que el líquido residual seco.
3. Colocar las placas a la temperatura requerida.

CONSEJOS:

• Larvas L1 en M9 tampón puede mantenerse a 15 ° C balanceo al menos durante una semana wiThout alteraciones evidentes.
• tenga cuidado en el cálculo de los gusanos que servirán para comenzar porque muchos se agotan los alimentos más rápido de lo esperado y la ruina de su experimento. Aproximadamente 500 L1 puede llegar a la edad adulta en una placa de 55 mm sin el funcionamiento de los alimentos.

4. Protocolo D: C. elegans Observación

D.1 Nomarski la observación

Interferencia diferencial microscopía de contraste es una técnica de microscopía óptica de iluminación utilizado para mejorar el contraste en muestras no teñidas transparentes. La palabra se refiere a Nomarski el prisma utilizado, el nombre de su inventor. Mediante la observación de los animales vivos que son capaces de estudiar la fisiología del animal con las únicas alteraciones derivadas de la inmovilización. Además, como fijador se añade, marcadores fluorescentes se puede observar en vivo. Este hecho y la posibilidad de marcadores fluorescentes a la fusión de un gen de interés que sea factible para seguir los procesos en which la proteína de estudio pueden estar involucrados. Mediante el uso de la técnica descrita en este protocolo, no sólo gusanos vivos se puede observar, pero también pueden ser recuperados y se colocaron de nuevo.

Agar preparación de la almohadilla (justo antes de su uso):

1. Preparar agarosa al 2% en agua y se funden. Mantenga funde a 65 ° C.
2. Coloque dos diapositivas con un trozo de cinta en ellos a ambos lados de una tercera diapositiva, limpio.
3. Utilizando una pipeta Pasteur lugar una caída de agar sobre la superficie limpia.
4. Cubrir el agar con otro portaobjetos limpio colocado en la parte superior de las tres diapositivas perpendicularmente.
5. Presione suavemente por lo que la caída de agar se aplana al grosor de los separadores de cinta.
6. Una vez que el agar se solidifica, tire suavemente de las diapositivas pegados y separar las dos diapositivas restantes deslizando una respecto a la otra.

Montaje animales vivos

7. Azida Ponga una gota (10 l), 1 mM de levamisol o sodio 10-30 mM en tl Centro de la almohadilla.
8. Trasladar a los animales dentro de la gota con una selección de gusano.
9. Con suavidad, coloque un cubreobjetos sobre los animales y fijarlo a ambos lados con un poco de esmalte de uñas o de silicona.

CONSEJOS:

• Mantener las alícuotas de agarosa al 2% a 4 ° C.
• Agarosa fundida puede mantenerse a 65 ° C durante al menos un día.
• Nota: El levamisol es un agonista del receptor nicotínico que provoca parálisis muscular espástica ^16.
• Tenga cuidado, azida de sodio es extremadamente tóxico!

D.2 etanol fijación y DAPI

El protocolo descrito aquí representa una forma rápida de teñido con DAPI gusanos, sin embargo, debido a la desecación del gusano algunas estructuras pueden presentar alguna alteración. Hay varios otros métodos para fijar los gusanos anteriores a DAPI tales como la fijación con solución de Carnoy o formaldehído que conservar mejor la integridad del gusano ¹⁷.

La fijación de etanol (modificado a partir de ¹⁸⁾

1. Lugar ~ 10 l de tampón M9 (o agua) en un portaobjetos de microscopio.
2. El uso de un gusano de escoger cuidadosamente la transferencia 10-25 gusanos a la caída.
3. El uso de papel de filtro o una micro-pipeta eliminar tampón M9 tanto como sea posible sin quitar los gusanos o dejando que se sequen.
4. Añadir aproximadamente 10 l de etanol al 90% y dejar secar.
5. Repita el paso 4 una o dos veces.

4 ',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) tinción

6. Mezclar DAPI con los medios de montaje deseada a una concentración final de 2 ng / l.
7. Una vez que el etanol se ha evaporado por completo, añadir 7 l de la DAPI: mezcla de medios de montaje.
8. Coloque un cubreobjetos y fijarlo a ambos lados con un poco de esmalte de uñas o de silicona. Las diapositivas estará listo para la observación de aproximadamente 5 minutos después de la adición de DAPI.

CONSEJOS:

• El montaje de medicinaentre otras cosas contiene glicerol, por lo que una pequeña cantidad es suficiente para cubrir toda la preparación.
• Existe una amplia variedad de medios de comunicación comerciales de montaje (Fluoromount o prolongar, por ejemplo), su calidad y el precio dependerá de cuánto tiempo desea almacenar la muestra.
• Tenga cuidado, DAPI es un mutágeno conocido que se une fuertemente a regiones ricas en AT en el ADN.

Recetas

Nematodo medio de crecimiento (NGM)

1,7% (w / v) de agar
50 mM de NaCl
0,25% (w / v) peptona
1 mM de CaCl ₂
5 ug / ml de colesterol
25 mM de KPO ₄
1 mM de MgSO ₄

M9 de amortiguación

22mm KH ₂ PO ₄
42 mM Na ₂ HPO ₄
86 mM de NaCl
1 mM de MgSO ₄

Soluciones para blanquear a prueba

	Receta # 1	Receta # 2	Receta # 3	Receta # 4	Receta # 5
agua (ml)	2,75	3.5	0.5	0.5	1.5
hidróxido de sodio (ml)	1,25 (1M)	0,5 (5M)	2,5 (1M)	2,5 (2M)	2,5 (1M)
~ de hipoclorito de sodio al 4% (ml)	1	1	1	2	1
total (ml)	5	5	4	5	5

Tabla I. Diferentes recetas de blanqueo de soluciones probadas para este artículo. Recetas # 3 y # 4 son 2x, y debe ser añadido al mismo volumen de M9. Recetas para el # 1, # 2 y # 5 han sido previamente reportados ^{2, 11, 19.} Las concentraciones finales: # 1 de NaOH 0,25 M, ~ de hipoclorito de sodio al 0,8% , N º 2 de NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, n º 3 de NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, n º 4 de NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, n º 5 de NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%.

5. Los resultados representativos

Figura 1. Comparación de los cinco diferentes soluciones de blanqueo en dos diferentes tiempos de incubación. Gusanos N2 se lavó dos veces con M9 se dividieron en cinco tubos de 15 ml cónicos que contienen cada una solución de blanqueo. Los tubos se agitaron vigorosamente y 1 ml transfirió a un tubo nuevo con M9 para detener la reacción después de que el tiempo especificado. Después de decoloración de los gusanos procedimiento se incubaron con 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. En cada caso, inferior fotografía fue tomada justo después del blanqueo, fotografía superior 24 horas después.

_upload/4019/4019fig2.jpg "alt =" Figura 2 "/>
Figura 2. Temperatura de solución de blanqueo afecta a la eficacia del tratamiento. Volúmenes iguales de gusanos N2 se blanquearon con la misma solución de blanqueo ya sea previamente enfriada en hielo durante 20 minutos o se mantiene a 25 ° C durante el mismo tiempo. Las dos columnas de las imágenes muestran a la izquierda justo después del blanqueamiento. Después de gusanos de tratamiento se incubaron en tubos cónicos de 15 ml con 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Las columnas en los cuadros de la exhibición correctas las 24 horas posteriores.

Figura 3. El gusano relación sedimento: tiempo de incubación hipoclorito alcalino afecta a la eficacia del tratamiento l 50, 100, 250 y 500 de gusano sedimento se incubaron con 2 ml de solución de blanqueo # 3 minutos para 3, 6 y 9.. Sombreadas L1, embriones muertos y restos de fragmentos adultos fueron cuantificados después de incubación a 20 ° C durante 2 4 horas en tubos de 15 ml cónicos con 1 ml de tampón de M9. Aproximadamente tres placas confluentes de 55 mm con gusanos adultos son necesarias para obtener una pastilla 100 l gusano.

Figura 4. Ventilación adecuada es necesaria para la eclosión y la supervivencia de C. embriones elegans. Un pellets 100 l de gusanos N2 se blanquearon durante 6 minutos y se incubaron en tubos cónicos de 15 ml con 1 ml, 5 o 10, según se especifica, de M9 a 20 ° C durante 24 horas. La parte superior de la figura muestra fotografías de los cultivos después de 24 horas, donde las flechas indican los huevos que no eclosionan. En la parte inferior, hay un gráfico que representa la cantidad de larvas (gris claro) y los embriones muertos (gris oscuro) 48 horas después de la decoloración en las condiciones establecidas.

tp_upload/4019/4019fig5.jpg "alt =" Figura 5 "/>
Figura 5. Ciclo de vida de C. elegans. una. Duración aproximada de los gusanos en las diferentes etapas. Horas requerida para alcanzar cada etapa en función de la temperatura (modificado de ^20). B. Nomarski (arriba) y DAPI (hacia abajo) imágenes de gusanos diferentes en las etapas de desarrollo indicadas. Las características más significativas de cada fase se multiplican L1: la flecha indica que los precursores de la gónada somáticas y la línea germinal temprana L4: negro flecha (Nomarski) indica que el desarrollo de la vulva; flechas blancas (DAPI) indican que los dos brazos gonadales Medio... finales de L4: La flecha indica la vulva en desarrollo en la etapa de árbol de los llamados jóvenes adultos: la Navidad. flecha de color negro indica un embrión dentro del útero, punta de flecha apunta a la espermateca, flecha blanca indica un ovocito grávidas adultos:. punta de flecha (DAPI) señala embriones fecundados. Flecha en DAPI imagen indica espermateca.

Figura 6. Vulva morfología en L3, L4 y etapas adultas. En la etapa L3 sólo un lumen pequeño donde se forma la vulva puede ser observado. En L4, esta luz se expande formando el llamado "árbol de Navidad". En el adulto la vulva ya está cerrado. Las líneas amarillas indican la localización de la vulva en estas tres etapas.

Figura 7. DAPI en L3, L4 temprana, las etapas finales de L4 y adultos. En L3, línea germinal es alargada. A nivel L4, las gónadas de armas presentes en forma de U morfología. En los espermatozoides última etapa-L4 se puede observar en la parte distal de la gónada. Los adultos jóvenes presentan ovocitos. La línea germinal de adultos presenta ovocitos y embriones. Las líneas amarillas delimitar las líneas germinales en THe las distintas etapas establecidas.

Figura 8. C. desarrollo elegans a los 15 y 25 ° C. gusanos N2 se blanquearon, se incubaron durante la noche en M9 y agitación a 15 ° C, se transfirió a placas y se cultivaron los tiempos indicados en las temperaturas indicadas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Sincronización de los nematodos

Varias soluciones de blanqueo se han descrito. Probamos cinco recetas diferentes (Tabla I) y, en nuestras manos, no muestran diferencias significativas en la sincronización de las poblaciones de gusano (Fig. 1). Sin embargo, nuestros experimentos mostraron que los parámetros tales como temperatura (Fig. 2), la solución de blanqueo relación: volumen de gusanos (Fig. 3) y el volumen de M9 con ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.