Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Резюме

Легкость поддержания и распространения нематоды С. Элеганс Сделать хорошую модель организма для работы. Возможность синхронизации червей позволяет работа со значительным количеством субъектов, в то же стадии развития, что способствует изучению одного конкретного процесса у многих животных.

Аннотация

Исследования в области молекулярной и эволюционной биологии из Элеганс нематоды Caenorhabditis было начато в начале семидесятых годов Сидней Бреннер и с тех пор он широко используется в качестве модельного организма ^1. C. Элеганс имеет основные атрибуты, такие как простота, прозрачность и коротким жизненным циклом, которые сделали его подходящим экспериментальной системы для фундаментальных биологических исследований на протяжении многих лет ^2. Открытия в этой нематоды имеют далеко идущие последствия, так как многие клеточные и молекулярные процессы, контроль за развитием животного эволюционного консервативных ^3.

C. Элеганс жизненный цикл проходит через зачаточном состоянии и четыре личиночной стадии до животных в зрелом возрасте. Развитие может занять от 2 до 4 дней в зависимости от температуры. В каждом из этапов несколько характерных черт можно наблюдать. Знание его полного линии ячейки ^4,5 с глубоким annotatионных его генома превратить эту нематоду в большой модели в таких областях как нейробиология ^{6, 7,8} старения, стволовых клеток, биология ⁹ и зародышевой линии биологии ^10.

Дополнительной функцией, которая делает C. Элеганс привлекательная модель для работы с является возможность получения популяции червей синхронизированы на определенном этапе в относительно легкий протокол. Простота обслуживания и распространяется эта нематода добавлена ​​возможность синхронизации обеспечивает мощный инструмент для получения большого количества червей, которые могут быть использованы для широкого круга малых и высокой пропускной экспериментов, таких как экраны RNAi, микрочипы, массивные последовательности, иммуноблот или гибридизация, среди других.

Благодаря своей прозрачности, C. Элеганс структур можно выделить под микроскопом с помощью дифференциальных помех контрастной микроскопии, также известный как Nomarski микроскопиископировать. Использование флуоресцентных связующего ДНК DAPI (4 ',6-диамидино-2-фенилиндола), например, может привести к конкретной идентификации и локализации отдельных клеток, а также внутриклеточных структур / дефекты, связанные с ними.

протокол

1. Протокол: Выращивание червей для отбеливания ¹¹

Большие популяции C. Элеганс может быть получен путем культивирования их либо в жидкой среде или в твердой среде в виде пластин. Они, как правило, выращенных на твердых NGM (Media нематода роста) и подается с Е. бактерии кишечной палочки, которая добавляется к пластинам либо жив, либо мертв (убит ^УФ-12, по ¹³ или тепло холодным ^14). Наиболее распространенные процедуры используются живые OP50 E. палочка, которая повреждена в синтезе урацила и не может перерасти в толстый слой, что бы скрыть червей.

1. Смешайте 3 г NaCl, 17 г агара и 2,5 г пептона и добавить 975 мл H ₂ O. Автоклав для 50 мин.
2. Охладите колбу до 55 ° C.
3. Добавьте 1 мл 1 М CaCl _2, 5 мл 1 мг / мл холестерина в этаноле, 1 мл 1 М MgSO ₄ и 25 мл 1 М КПО ₄ буфера (все из них, но холестерин ранее autoclavред.)
4. Использование процедур стерилизации обойтись NGM решение в чашках Петри, и наполняйте пластин до 2/3 их объема.
5. После высыхания, желательно оставить пластины при комнатной температуре в течение 2-3 дней перед использованием для обнаружения загрязняющих веществ. Подготовить полосу OP50 E. палочки из глицерина акций (OP50 может быть получен из Caenorhabditis генетический центр).
6. Выберите одну колонию и вырастить его в LB ночи при 37 ° С при перемешивании.
7. Позвольте избытку влаги испаряется из пластин снять крышку в ламинарный поток и добавить OP50 к центру пластины стерильной пипеткой Пастера.
8. Позвольте OP50 E. палочки газон расти ночь при комнатной температуре или при температуре 37 ° С в течение 8 часов.
9. Добавьте необходимое количество червей на пластины (если инкубировали при 37 ° C плит следует охлаждать при комнатной температуре перед использованием).

СОВЕТЫ:

• Заливки такое же количество средств массовой информациив пластинах с помощью пипетки или дозатор обеспечивает тот же объем агар для пластин и облегчает перемещение пластины без необходимости переориентировать стереомикроскопа.
• Плиты (как семена и unseeded с бактериями) может быть использована несколько недель после того, как подготовленный при хранении в контейнере при комнатной температуре или 4 ° C.
• Избегайте посеве бактерий к краю тарелки. Если газон распространяется на краях пластины черви могут ползти стороны, высыхают и умирают.
• Черви живут дольше, если бактерии высевают на пластины уже мертвы ^15.

2. Протокол B: Лечение щелочным раствором гипохлорита ("отбеливания") ¹¹

Отбеливание техника используется для синхронизации C. Элеганс культур на первом личиночной стадии (L1). Принцип метода заключается в том, что черви являются чувствительными для отбеливания, а яичная скорлупа защищает электроннойmbryos от него. После обработки щелочным раствором гипохлорита, эмбрионы инкубировали в жидкой среде без пищи, который позволяет штриховки, но предотвращает дальнейшее развитие.

1. Позвольте червям расти до взрослой стадии.
2. Восстановление беременных взрослых в 15 мл труб промывка пластин с буфером M9.
3. Гранул червей путем центрифугирования в течение 2 минут на 400xg (~ 1500 оборотов в минуту на стандартной центрифуге таблицу) при комнатной температуре и отбросить супернатант.
4. Выполните 1-3 мойки, пока буфер становится ясно, бактерий.
5. Добавьте необходимый отбеливающий раствор (табл. I) и агитировать за несколько минут (разрушение тканей взрослого должны быть проверены в соответствии с рассечения микроскопа и реакция прекращается, когда следы взрослых все еще ​​видны, который обычно занимает от 3 ​​до 9 минут в зависимости от нескольких вопросов, таких как объем червь гранул, указанных в обсуждении) (рис. 3).
6. Остановить реакцию добавлением M9 buffeт для заполнения трубы.
7. Быстро центрифуги (так как лечение еще может быть активна) в течение 1 минуты при 400 мкг и отбросить супернатант.
8. Вымойте гранул три раза заполнить трубу с буфером M9.
9. Добавьте 1 мл буфера M9 в гранулах, или разместить яйца unseeded пластин НГО и инкубировать на желаемую температуру с нежным агитации. Правильная вентиляция должна быть предоставлена ​​(рис. 4).

СОВЕТЫ:

• Есть разные отбеливание решения, выбрать тот, который работает лучше в твоих руках (табл. 1, рис. 1).
• Яйца уже заложены на пластинах может быть восстановлен, избавляясь от поверхности агара с мягким материалом, таким как часть рентгеновской пленки.
• Слишком много остатков взрослого животного может привести к нарушению синхронизации, поскольку они являются продуктами питания для недавно вылупившихся личинок.
• Более высокие температуры немного ускорить развитие, которое неудобно яе для синхронизации червь пропускает, потому что разница в развитии между синхронизированы и синхронизированных червей будет больше при более высоких температурах.
• Отбеливание решение должно быть выполнено непосредственно перед ее использованием. Кроме того, отбеливание теряет эффективность после того, как были открыты в течение некоторого времени, в частности, из-за его светочувствительность. Мы предлагаем аликвоту каждой новой бутылки в бутылочки янтаря, чтобы предотвратить такие потери и свести к минимуму воздействие света.

3. Протокол C: червь покрытие

1. Подождите от 12 до 24 часов (время для завершения эмбрионального развития зависит от температуры) после отбеливания была выполнена и восстановить червей путем центрифугирования (2 мин при 400 мкг).
2. Удалить супернатант, семена червей на необходимые пластины и пусть оставшуюся жидкость сухим.
3. Установите плиты при требуемой температуре.

СОВЕТЫ:

• L1 личинок M9 буфера можно хранить при температуре 15 ° C качания по крайней мере в течение одной недели шthout очевидные изменения.
• будьте осторожны при расчете червей вы будете семена, потому что слишком много может исчерпать пищу быстрее, чем ожидалось, и разрушить ваш эксперимент. Около 500 L1 может достигать взрослой жизни в 55 мм пластины, не хватает еды.

4. Протокол D: C. Элеганс наблюдения

D.1 Nomarski наблюдения

Дифференциальная помеха контрастной микроскопии является оптический метод освещения микроскопия используется для повышения контраста в прозрачных неокрашенных образцов. Слово Nomarski относится к призме используются, названный в честь его изобретателя. Наблюдая за животными в живых, мы можем изучить физиологию животных, с той лишь изменениями на основе иммобилизации. Кроме того, в качестве фиксатора не добавляется, флуоресцентные маркеры можно наблюдать в естественных условиях. Этот факт, а также возможность слияния флуоресцентные маркеры гена делает возможным следовать процессам в соакие белка исследования могут быть вовлечены. Используя технику, описанную в данном протоколе, не только живых червей можно наблюдать, но они также могут быть восстановлены и покрыты заново.

Агар площадку подготовки (перед использованием):

1. Подготовить агарозы 2% в воде и тает. Держите плавится при 65 ° C.
2. Поместите два слайда с липкой лентой на них с обеих сторон на треть, чистый слайд.
3. С помощью пипетки Пастера место капли агара на чистую поверхность.
4. Накройте агар с другой чистый слайд размещены на верхней из трех слайдов перпендикулярно.
5. Нажмите аккуратно, чтобы агар падение плоской с толщиной ленты прокладки.
6. После того, агар застывает, осторожно вытащите выявляется слайды и разделить эти две оставшиеся слайды путем перемещения по отношению к другим.

Монтаж животных

7. Место одной капле (10 мкл) левамизол 1 мМ азид натрия или 10-30 мм на тОн центре площадки.
8. Передача животных в капле помощью червя выбор.
9. Аккуратно поместите покровное над животными и исправить ее с обеих сторон с некоторыми лак для ногтей или силикона.

СОВЕТЫ:

• Держите аликвоты агарозы 2% при температуре 4 ° C.
• Расплавленный агарозы можно хранить при температуре 65 ° C, по крайней мере один день.
• Примечание: Левамизол является агонистом никотиновых рецепторов который вызывает спастические параличи мышц ^16.
• Будьте осторожны, азид натрия очень токсичен!

D.2 фиксации этанола и DAPI окрашивания

Протокол, описанный здесь, представляет собой быстрый способ крашения червей DAPI, однако из-за dissecation от червя некоторые структуры могут представить некоторые изменения. Есть несколько других методов, чтобы исправить червей до окрашивания DAPI, таких как фиксация решение Карнуа или формальдегид, которые сохраняют лучшие целостности червь ¹⁷.

Этанол фиксации (модифицированный из ¹⁸⁾

1. Место ~ 10 мкл буфера M9 (или воды) на предметном стекле микроскопа.
2. Использование червя Пик тщательно передавать 10-25 червей капли.
3. Использование фильтровальную бумагу или микро-пипетки удалить как можно больше M9 буфера возможно без удаления червей или давая им высохнуть.
4. Добавить ~ 10 мкл 90% этанола и дайте ему высохнуть.
5. Повторите шаг 4 раз или два.

4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) окрашивание

6. Смешайте DAPI с желаемой установки средств массовой информации до конечной концентрации 2 нг / мкл.
7. После того, этанол не испарится полностью, добавить 7 мкл DAPI: монтаж смесь СМИ.
8. Поместите покровное и исправить ее с обеих сторон с некоторыми лак для ногтей или силикона. Слайды будут готовы для наблюдения примерно через 5 минут после добавления DAPI.

СОВЕТЫ:

• Монтаж медИА содержит глицерин, поэтому небольшое количество достаточно, чтобы покрыть всю подготовку.
• Там существует большое разнообразие коммерческой монтаж средств массовой информации (Fluoromount или продлить, например), их качество и цена зависит от того, сколько вы хотите сохранить ваш образец.
• Будьте осторожны, DAPI известный мутаген который прочно связывается с AT богатыми регионами в ДНК.

Рецепты

Нематоды Рост средний (НГО)

1,7% (вес / объем) Агар
50 мМ NaCl
0,25% (вес / объем) Пептон
1 мМ CaCl ₂
5 мкг / мл Холестерин
25 мМ КПО ₄
1 мМ MgSO ₄

M9 буфер

22мм KH ₂ PO ₄
42 мМ Na ₂ HPO ₄
86 мм NaCl
1 мМ MgSO ₄

Отбеливание решений, апробированных

	Рецепт № 1	Рецепт № 2	Рецепт № 3	Рецепт № 4	Рецепт № 5
воды (мл)	2,75	3,5	0,5	0,5	1,5
гидроксида натрия (мл)	1.25 (1M)	0,5 (5M)	2.5 (1M)	2.5 (2M)	2.5 (1M)
гипохлорита натрия ~~~V 4% (мл)	1	1	1	2	1
Всего (мл)	5	5	4	5	5

Таблица I. Различные рецепты отбеливания решения проверены на эту статью. Рецепты № 3 и № 4, 2x, и должны быть добавлены к тем же объемом M9. Рецепты № 1, № 2 и № 5, ранее сообщалось ^{2, 11, 19.} Окончательные концентрации: # 1 NaOH 0,25, NaOCl ~~~V 0,8% , № 2 NaOH 0,5 м, NaOCl ~ 0,8%, № 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, № 4 1 М NaOH, NaOCl ~ 1,6%, № 5 NaOH 0,5 м, NaOCl ~ 0,8%.

5. Представитель результаты

Рисунок 1. Сравнение пяти разных отбеливания решений в разные моменты времени инкубации. N2 червей дважды промывают M9 были разделены на пять 15 мл конические пробирки, содержащие каждый отбеливающий раствор. Трубы были потрясены энергично и 1 мл переданы в новую пробирку с М9, чтобы остановить реакцию после указанного времени. После процедуры отбеливания червей инкубировали с 1 мл M9 при 20 ° С в течение 24 часов. В каждом случае нижняя фотография была сделана сразу после отбеливания, верхняя картинка через 24 часа.

_upload/4019/4019fig2.jpg "ALT =" 2 "/>
Рисунок 2. Температура отбеливающий раствор влияет на эффективность лечения. Равные объемы червей N2 были отбеливать с тем же отбеливающий раствор либо предварительно охлажденные на льду в течение 20 минут при 25 ° C за то же время. Две колонки на левой фотографии шоу сразу после отбеливания. После лечения червями инкубировали в 15 мл конические пробирки с 1 мл M9 при 20 ° С в течение 24 часов. Столбцы на правой фотографии дисплей через 24 часа.

Рисунок 3. Отношение червь гранул: время инкубации гипохлорита щелочного влияет на эффективность лечения 50, 100, 250 и 500 мкл червь гранул инкубировали с 2 мл отбеливающий раствор № 3 на 3, 6 и 9 минут.. Появившиеся L1, мертвых эмбрионов и остатков взрослого фрагменты количественно после инкубации при температуре 20 ° С в течение 2 4 часа в 15 мл конические пробирки с 1 мл буфера M9. Около трех сливной 55 мм пластин с взрослых червей, необходимые для получения 100 мкл червь гранул.

Рисунок 4. Правильная вентиляция необходима для выведения и выживания С. Элеганс эмбрионов. 100 мкл гранул червей N2 были отбеливаются в течение 6 минут и инкубируют в 15 мл конические пробирки с мл 1, 5 или 10, как указано, в M9 при 20 ° С в течение 24 часов. Верхняя часть рисунка показывает фотографии культур после 24 часов, где стрелки показывают, что яйца не вылупится. В нижней части, есть график, иллюстрирующий количество личинок (светло-серый) и мертвых эмбрионов (темно-серый) 48 часов после отбеливания в указанных условиях.

tp_upload/4019/4019fig5.jpg "ALT =" Рисунок 5 "/>
Рисунок 5. Жизненный цикл C. Элеганс. . Приблизительная длина червей на различных стадиях. Часы, достаточную для каждого этапа в зависимости от температуры (с изменениями от ^20). Б. Nomarski (вверх) и DAPI (вниз) фотографии различных червей в указанных стадиях развития. Наиболее значимые особенности на каждом этапе усиливаются L1: стрелка указывает на предшественников гонад соматических и зародышевой линии раннего L4: черная стрелка (Nomarski) указывает на развивающихся вульвы, белые стрелки (DAPI) указывают на два половых оружия среднего... конце L4: стрелка указывает на развивающихся вульвы в так называемом этапе елку молодых взрослых. черная стрелка указывает на эмбрион в матке, стрелка указывает на сперматеки, белая стрелка указывает яйцеклетки Беременные взрослых. стрелки (DAPI) указывает на оплодотворенных эмбрионов. Стрелка в DAPI изображение указывает сперматеки.

Рисунок 6. Вульва в морфология L3, L4 и взрослых стадий. На стадии L3 лишь небольшой просвет, где формируется вульвы можно наблюдать. На L4, эта полость расширяется образуя так называемые "Рождественская елка". У взрослых вульвы уже закрыт. Желтые линии указать местоположение вульвы на эти три этапа.

Рисунок 7. DAPI окрашивания в L3, L4 рано, поздно L4 и взрослых стадий. На L3, зародышевой линии вытянута. На L4, гонад оружие настоящее U-образной морфологии. В конце-L4 этап спермы можно наблюдать в дистальной части гонад. Молодежь представляет ооцитов. Взрослые линии зародыша представляет ооцитов и эмбрионов. Желтые линии разграничения зародыш линий йэлектронной различных заявил этапов.

Рисунок 8. C. Элеганс развития на 15 и 25 ° C. червей N2 были отбеленные, инкубировали в течение ночи в М9 и агитации при 15 ° С, передается пластин и вырос указанных раза в указанных температурах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Нематоды Синхронизация

Несколько отбеливания решения были описаны. Мы пытались пять различных рецептов (см. таблицу), а в наших руках, они не показывают существенные различия в синхронизации червь населения (рис. 1). Однако наши эксперименты показывают, ч...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.