Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Zusammenfassung

Die Einfachheit in der Pflege und Verbreitung des Nematoden C elegans Machen es zu einem schönen Modell-Organismus zu arbeiten. Die Möglichkeit zum Synchronisieren von Würmern ermöglicht die Arbeit mit einer signifikanten Menge an Themen gleichzeitig Entwicklungsstadium, was erleichtert die Untersuchung eines bestimmten Prozesses in vielen Tieren.

Zusammenfassung

Die Erforschung der Molekular-und Entwicklungsbiologie der Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde in den frühen Siebzigern von Sydney Brenner begonnen und es wurde seither als Modellorganismus ¹ verwendet. C. elegans besitzt wichtige Eigenschaften wie Einfachheit, Transparenz und kurze Lebensdauer, die es ein geeignetes experimentelles System für die biologische Grundlagenforschung seit vielen Jahren ² haben. Entdeckungen in diesem Nematoden weitreichende Auswirkungen haben, da viele zelluläre und molekulare Prozesse, die Kontrolle tierischer Entwicklung evolutionär konservierte ³ sind.

C. elegans Lebenszyklus durchläuft einem embryonalen Stadium und vier Larvenstadien, bevor die Tiere das Erwachsenenalter erreichen. Die Entwicklung kann dauern 2 bis 4 Tage je nach Temperatur. In jeder der Stufen mehrere charakteristische Züge beobachtet werden kann. Das Wissen um seine komplette Zelllinie ^4,5 zusammen mit dem tiefen annotatIon seines Genoms machen diese Nematoden in ein großes Modell in so unterschiedlichen Bereichen wie der Neurobiologie ^6, Alterung ^7,8, Stammzellbiologie ⁹ und ¹⁰ Biologie Keimbahn.

Ein zusätzliches Feature, das macht C. elegans ein attraktives Modell, mit zu arbeiten ist die Möglichkeit der Erlangung Populationen von Würmern in einem bestimmten Stadium durch einen relativ einfachen Protokoll synchronisiert. Die einfache Wartung und Verbreitung dieser Nematoden zugegeben, um die Möglichkeit der Synchronisation ein mächtiges Werkzeug, um große Mengen von Würmern, die für eine Vielzahl von kleinen oder High-Throughput-Experimente wie RNAi-Screens, Mikroarrays, massiven Sequenzierung verwendet werden können, zu erhalten, Immunoblot oder in situ Hybridisierung, unter anderem.

Wegen seiner Transparenz, C. elegans Strukturen können unter dem Mikroskop nach Differential Interference Contrast Mikroskopie unterschieden werden, die auch als Nomarski micros bekanntzu kopieren. Verwendung einer fluoreszierenden DNA-Bindemittel, DAPI (4 ',6-Diamidino-2-phenylindol), zum Beispiel, auf die spezifische Erkennung und Lokalisierung von einzelnen Zellen sowie subzellulären Strukturen / Defekte der sie zu führen.

Protokoll

1. Ein Protokoll: Kultivieren Worms zum Bleichen ¹¹

Große Populationen von C. elegans durch Kultivierung von ihnen gewonnen werden, entweder in flüssigen Medien oder auf festen Medien in Platten. Sie sind meist auf festem NGM (Nematode Growth Media) und gefüttert mit E. gewachsen coli-Bakterien, die zu den Platten entweder lebend oder tot (getötet von UV ^{12, 13} oder durch Hitze durch Kälte ¹⁴⁾ hinzugefügt wird. Das häufigste Verfahren nutzt Live-OP50 E. coli, die einen Defekt in der Synthese von Uracil ist und nicht in eine dicke Schicht, die Würmer verschleiern würden überwachsen.

1. Mix 3 g NaCl, 17 g Agar-Agar und 2,5 g Pepton und fügen Sie 975 ml H ₂ O. Autoklavieren für 50 min.
2. Kühlen Sie den Kolben auf 55 ° C
3. 1 ml 1 M CaCl _2, 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol, 1 ml 1 M MgSO ₄ und 25 ml 1 M KPO _4-Puffer (alle von ihnen aber zuvor Cholesterin Autoklaved).
4. Mit einer sterilen Verfahren verzichten die NGM-Lösung in Petrischalen, füllen Platten bis zu 2/3 ihres Volumens.
5. Nach dem Trocknen ist es ratsam, Platten bei Raumtemperatur stehen lassen für 2-3 Tage vor der Verwendung zum Nachweis von Verunreinigungen. Bereiten Sie einen Streifen von OP50 E. coli aus einem Glycerin-Lager (OP50 kann aus dem Caenorhabditis Genetics Center bezogen werden).
6. Wählen Sie eine einzelne Kolonie wachsen und es in LB über Nacht bei 37 ° C unter Rühren.
7. Überschüssige Feuchtigkeit von den Platten durch Entfernen des Deckels in der laminaren Strömung eingedampft, und OP50 zum Zentrum der Platten mit einer sterilen Pasteur-Pipette.
8. Lassen Sie das OP50 E. coli Rasen wachsen bei Raumtemperatur oder bei 37 ° C über Nacht für 8 Stunden.
9. Fügen Sie die gewünschte Menge der Würmer an den Platten (wenn bei 37 ° C Platten sollten bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch gekühlt werden).

TIPPS:

• Das Ausgießen der gleichen Anzahl der Medienin den Platten mit einer Pipette oder einem Pumpspender sorgt für die gleiche Menge an Agar zu den Platten und erleichtert die Verlagerung der Platte ohne Notwendigkeit, die Stereomikroskop neu auszurichten.
• Die Platten (beide entkernt und ungesetzte mit Bakterien) können mehrere Wochen nach der Zubereitung verwendet werden, wenn in einem Behälter bei Raumtemperatur oder 4 ° C gelagert
• Vermeiden Ausplattieren der Bakterien an die Kante der Platte. Wenn der Rasen erstreckt sich auf die Kanten der Platte die Würmer kriechen können die Seiten, trocknen aus und sterben.
• Würmer leben länger, wenn die Bakterien auf den Platten ausgesät bereits tot sind ^15.

2. Protokoll B: Behandlung mit alkalischem Natriumhypochlorit-Lösung ("Bleaching") ¹¹

Das Bleichen Technik wird für die Synchronisierung verwendet C. elegans Kulturen an der ersten Larvenstadium (L1). Das Prinzip der Methode liegt in der Tatsache, dass Würmer empfindlich auf Bleichmittel sind, während die Eischale schützt Embryos davon. Nach der Behandlung mit alkalischen Hypochlorit-Lösung werden die Embryonen in flüssigen Medien ohne Nahrung, die dem Schlüpfen erlaubt, verhindert aber die weitere Entwicklung inkubiert.

1. Erlauben Würmer bis erwachsenen Stadium wachsen.
2. Recover graviden Erwachsenen in 15 ml Röhrchen durch Waschen Platten mit M9-Puffer.
3. Pellet-Würmer durch Zentrifugieren für 2 Minuten bei 400 × g (~ 1500 rpm auf einem Standard-Tischzentrifuge) bei Raumtemperatur und Überstand verwerfen.
4. Führen Sie 1-3 Wäschen, bis der Puffer erscheint klar von Bakterien.
5. Fügen Sie die gewünschten Bleichlösung (Tabelle I) und agitieren für einige Minuten (Zerstörung des adulten Gewebe sollte unter dem Binokular beobachtet werden und die Reaktion gestoppt, wenn Spuren von Erwachsenen noch sichtbar sind, das dauert in der Regel zwischen 3 und 9 Minuten, abhängig von mehreren Bull., wie das Volumen der Schnecke Pellet, in der Diskussion erwähnt) (Abb. 3).
6. Die Reaktion durch Zugabe M9 buffer, um den Schlauch zu füllen.
7. Schnell zentrifugieren (seit Behandlung kann immer noch aktiv sein) für 1 Minute bei 400 xg und Überstand verwerfen.
8. Waschen Pellet dreimal durch Füllen des Röhrchens mit M9-Puffer.
9. 1 ml M9-Puffer zu dem Pellet, oder legen die Eier zu ungesetzte NGM-Platten, und inkubieren Sie bei der gewünschten Temperatur unter leichtem Schütteln. Die richtige Belüftung sollte zur Verfügung gestellt (Abb. 4) werden.

TIPPS:

• Es gibt verschiedene Bleich-Lösungen, wählen Sie diejenige, die besser funktioniert in Ihren Händen (Tabelle 1, Abb. 1).
• Eier bereits auf den Platten vorgesehene aus der Entsorgung der Oberfläche des Agar mit einem weichen Material wie beispielsweise ein Stück eines Röntgenfilms gewonnen werden.
• Zu viele Überreste von erwachsenen Tieren beeinträchtigen können Synchronisation, da sie eine Versorgung mit Lebensmitteln für die frisch geschlüpften Larven bilden.
• Höhere Temperaturen leicht beschleunigen die Entwicklung, die unbequem ist if jede Schnecke überspringt Synchronisierung, weil der Unterschied in der Entwicklung zwischen synchronisiert und synchronisiert Würmern wird bei höheren Temperaturen größer.
• Bleichbad erst kurz vor seiner Verwendung durchgeführt werden. Außerdem verliert Bleichmittel Potenz nach offen für eine Weile wurde, teilweise aufgrund der Lichtempfindlichkeit. Wir schlagen vor, Aliquot jeder neuen Flasche in kleine bernsteinfarbenen Flaschen, einen solchen Schaden zu verhindern und zu minimieren Lichtquelle ausgesetzt haben.

3. Protokoll C: Worm Plating

1. Warten Sie zwischen 12 und 24 Stunden (time to Embryonalentwicklung, hängt von der Temperatur) nach dem Bleichen wurde durchgeführt und erholen Würmer durch Zentrifugation (2 Minuten bei 400 xg).
2. Überstand verwerfen, Saatgut Würmer auf den erforderlichen Platten und lassen Sie die restliche Flüssigkeit trocken.
3. Zeigen Platten bei der erforderlichen Temperatur.

TIPPS:

• L1-Larven in M9-Puffer bei 15 ° C Schütteln bei mindestens eine Woche aufbewahrt werden wiThout offensichtlichen Veränderungen.
• seien Sie vorsichtig bei der Berechnung der Würmer man so will, weil zu viele Samen kann das Essen schneller als erwartet ausschöpfen und ruinieren Ihr Experiment. Rund 500 L1 kann im Erwachsenenalter in einem 55 mm-Platte erreichen, ohne Ihr Essen.

4. Protokoll D: C elegans Observation

D.1 Nomarski Beobachtung

Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie ist eine optische Mikroskopie Beleuchtung Technik verwendet, um den Kontrast in ungefärbten transparenten Proben zu erhöhen. Das Wort bezieht sich auf das Nomarski Prisma verwendet, nach seinem Erfinder benannt. Durch die Beobachtung Tiere am Leben sind wir in der Lage, die Physiologie des Tieres mit den Änderungen nur von Immobilisierung ableiten zu untersuchen. Darüber hinaus, da kein Fixiermittel zugesetzt wird, können fluoreszierende Marker in vivo beobachtet werden. Diese Tatsache und die Möglichkeit des Schmelzens Fluoreszenzmarker um ein Gen von Interesse machen es möglich, die Prozesse in w folgendermaßenelche das Protein des Studiums beteiligt sein können. Durch Verwendung der Technik in diesem Protokoll beschrieben wurde, kann nicht nur lebende Würmer beobachtet werden, aber sie können auch gewonnen und wieder ausplattiert.

Agar-Pad Vorbereitung (kurz vor der Verwendung):

1. Planen 2% Agarose in Wasser und schmelzen. Halten Sie schmolz bei 65 ° C
2. Legen Sie zwei Objektträger mit einem Stück Klebeband auf sie an beiden Seiten eines dritten, sauberen Objektträger.
3. Mit Hilfe einer Pasteurpipette einen Tropfen Agar auf die saubere Oberfläche.
4. Decken Sie die Agar mit einem anderen sauberen Objektträger auf der Oberseite der drei Schlitten senkrecht gestellt.
5. Drücken Sie vorsichtig, damit der Agar Drop auf die Dicke des Bandes Abstandshalter abgeflacht.
6. Nachdem der Agar erstarrt, ziehen Sie vorsichtig die verschweißte Folien und trennen Sie die zwei übrigen Folien, indem ein relativ zu dem anderen.

Montage lebenden Tieren

7. Geben Sie einen Tropfen (10 ul) von 1 mM Levamisol oder Natriumazid 10-30 mm auf ter Mitte des Pads.
8. Übertragen Sie Tiere in der Dropdown-Wurm mit Hilfe eines Pick.
9. Vorsichtig einen Deckglas über die Tiere und befestigen Sie es an beiden Seiten mit etwas Nagellack oder Silikon.

TIPPS:

• Halten Aliquots 2% Agarose bei 4 ° C
• Geschmolzener Agarose auf 65 ° C für mindestens einen Tag aufbewahrt werden.
• Hinweis: Levamisol ist ein Nikotinsäure-Rezeptor-Agonisten, die spastischen Lähmung hervorruft ^16.
• Seien Sie vorsichtig, ist Natriumazid extrem giftig!

D.2 Ethanol Fixierung und DAPI-Färbung

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine schnelle Möglichkeit, Färben Würmer mit DAPI jedoch wegen der dissecation der Wurm einige Strukturen kann einige Veränderung zu präsentieren. Es gibt einige andere Methoden, um Würmer zu vorangegangenen DAPI-Färbung wie die Fixierung mit Carnoy-Lösung oder Formaldehyd, die eine bessere Erhaltung der Integrität des Wurms ¹⁷ fix.

Ethanol Fixierung (modifiziert nach ¹⁸⁾

1. Platz ~ 10 ul M9-Puffer (oder Wasser) auf einen Objektträger.
2. Mit einem Pick-Wurm sorgfältig übertragen 10-25 Würmer auf den Rückgang.
3. Mit Filterpapier oder eine Mikro-Pipette entfernen Sie so viel wie möglich M9-Puffer ohne Entfernen der Würmer oder lassen sie trocknen.
4. Fügen Sie ~ 10 ul 90% Ethanol und trocknen lassen.
5. Wiederholen Sie Schritt 4 ein-oder zweimal.

4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung

6. Mischen Sie DAPI mit den gewünschten Montage Medien bis zu einer Endkonzentration von 2 ng / ul.
7. Sobald das Ethanol vollständig verdunstet ist, 7 ul des DAPI: Montiermedium Mischung.
8. Legen Sie ein Deckglas und befestigen Sie es an beiden Seiten mit etwas Nagellack oder Silikon. Folien bereit sein wird für die Beobachtung etwa 5 min nach der Zugabe von DAPI.

TIPPS:

• Die Montage medIA enthält Glycerin, so eine kleine Menge genügt, um die ganze Vorbereitung zu decken.
• Es gibt eine breite Palette an kommerziellen Montage Medien (Fluoromount oder zu verlängern, zum Beispiel), hängen ihre Qualität und Preis, wie lange Sie wollen Ihre Probe zu speichern.
• Seien Sie vorsichtig, ist ein bekanntes Mutagen DAPI, die stark bindet an AT-reiche Regionen in der DNA.

Rezepte

Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)

1,7% (w / v) Agar
50 mM NaCl
0,25% (w / v) Pepton
1 mM CaCl ₂
5 pg / ml Cholesterin
25 mM KPO ₄
1 mM MgSO ₄

M9-Puffer

22mm KH ₂ PO ₄
42 mM Na ₂ HPO ₄
86 mM NaCl
1 mM MgSO ₄

Bleich-Lösungen getestet

	Rezept Nr. 1	Rezept Nr. 2	Rezept # 3	Rezept Nr. 4	Rezept Nr. 5
Wasser (ml)	2,75	3,5	0,5	0,5	1,5
Natriumhydroxid (ml)	1,25 (1M)	0,5 (5M)	2,5 (1M)	2,5 (2M)	2,5 (1M)
Natriumhypochlorit ~~~V 4% (ml)	1	1	1	2	1
insgesamt (ml)	5	5	4	5	5

Tabelle I. Verschiedene Bleichlösung Rezepte für diesen Artikel getestet. Rezepte # 3 und # 4 sind 2x, und sollte auf dem gleichen Volumen M9 hinzugefügt werden. Rezepte für # 1, # 2 und # 5 wurden bereits ^{2, 11, 19} berichtet. Endkonzentrationen: # 1 0,25 M NaOH, ~~~V NaOCl 0,8% , # 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, ~ 1,6% NaOCl, Nr. 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%.

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Vergleich von fünf verschiedenen Bleichlösungen bei zwei verschiedenen Inkubationszeiten. N2 Würmer zweimal mit M9 wurden in fünf 15 ml konischen Röhrchen mit jeweils Bleichlösung aufgeteilt. Die Röhrchen wurden kräftig geschüttelt und 1 ml in ein neues Röhrchen mit M9, um die Reaktion nach der angegebenen Zeit zu stoppen übertragen. Nach dem Bleichen Verfahren Würmer wurden mit 1 ml M9 bei 20 ° C für 24 Stunden inkubiert. In jedem Fall wurde unteres Bild nur nach dem Bleichen, oberes Bild 24 Stunden später genommen.

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Abbildung 2. Die Temperatur der Bleichlösung beeinflusst die Wirksamkeit der Behandlung. Gleiche Volumina von N2 Viren mit dem gleichen Bleichlösung entweder vorher auf Eis für 20 Minuten gekühlt oder gehalten bei 25 ° C für die gleiche Zeit wurden gebleicht. Die beiden Spalten auf der linken Bilder zeigen gerade nach dem Bleichen. Nach der Behandlung Würmer wurden in 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml M9 bei 20 ° C für 24 Stunden inkubiert. Spalten auf der rechten Display-Bilder 24 Stunden später.

Abbildung 3. Das Verhältnis Wurm Pellet: Zeit des alkalischen Hypochlorit Inkubation beeinflusst die Wirksamkeit der Behandlung 50, 100, 250 und 500 ul der Wurm Pellet mit 2 ml Bleichlösung # 3 für 3, 6 und 9 Minuten inkubiert wurden.. Geschlüpften L1, tote Embryonen und Überreste von Erwachsenen-Fragmente wurden nach der Inkubation bei 20 ° C für 2 quantifiziert 4 Stunden in 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml M9-Puffer. Etwa drei konfluenten 55 mm Platten mit erwachsenen Würmer sind nötig, um eine 100 mu l Pellet Wurm zu bekommen.

Abbildung 4. Die richtige Belüftung ist für das Ausbrüten und das Überleben von C. erforderlich elegans Embryonen. A 100 ul Pellet N2 Würmer wurden für 6 Minuten gebleicht und inkubiert in 15 ml konischen Röhrchen mit 1, 5 oder 10 ml, wie angegeben, M9, bei 20 ° C für 24 Stunden. Der obere Teil der Abbildung zeigt Bilder der Kulturen nach 24 Stunden, in denen Pfeile, die Eier nicht ausbrüten wollte zeigen. Am unteren Rand gibt es eine graphische Darstellung, die Menge der Larven (hellgrau) und toten Embryonen (dunkelgrau) 48 Stunden nach dem Bleichen an den angegebenen Bedingungen.

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Abbildung 5. Lebenszyklus von C. elegans. ein. Ungefähre Länge der Würmer in verschiedenen Stadien. Stunden benötigt, um jede Phase in Abhängigkeit von der Temperatur (modifiziert nach ^20). B. Nomarski (up) und DAPI (unten) Bilder von verschiedenen Würmern zu den angegebenen Entwicklungsstadien zu erreichen. Wichtigsten Merkmale in jeder Phase werden vergrößert L1: Pfeil zeigt die Vorstufen der somatischen Gonade und der Keimbahn Frühe L4: Black Arrow (Nomarski) zeigt die Entwicklung Vulva; weiße Pfeile (DAPI) zeigen die beiden Arme Mid-Gonaden... Ende der L4: Pfeil zeigt die Entwicklung Vulva an der sogenannten Weihnachtsbaum Bühne Junger Erwachsener:. schwarze Pfeil zeigt einen Embryo in der Gebärmutter, Punkte Pfeilspitze auf der Samenblase, weißer Pfeil zeigt eine Eizelle Gravid Erwachsenen:. Pfeilspitze (DAPI) weist darauf hin, befruchteten Embryonen. Arrow in DAPI-Bild zeigt Spermatheka.

Abbildung 6. Vulva Morphologie bei L3, L4 und adulte Stadien. Im L3-Stadium nur ein kleines Lumen, wo die Vulva gebildet beobachtet werden kann. Bei L4, dehnt sich dieses Lumen bilden die so genannten "Weihnachtsbaum". Beim Erwachsenen die Vulva ist bereits geschlossen. Gelbe Linien zeigen die Position der Vulva diese drei Stufen.

Abbildung 7. DAPI-Färbung bei L3, L4 früh, spät L4 und adulte Stadien. Bei L3, wird Keimbahn verlängert. Bei L4, Arme Gonade vorhanden U-Form Morphologie. Am späten L4-Stadium Spermien können im distalen Teil der Gonade beobachtet werden. Jugendliche präsentieren Oozyten. Die Adult Keimbahn präsentiert Eizellen und Embryonen. Gelbe Linien Abgrenzung Keimbahnen an the verschiedenen Stufen angegeben.

8. C elegans Entwicklung bei 15 und 25 ° C N2 Würmer wurden gebleicht, Übernachtung in M9 und Rühren bei 15 ° C, übertragen, um Platten gewachsen und die angegebenen Zeiten bei den angegebenen Temperaturen inkubiert.

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Diskussion

Nematoden-Synchronisation

Mehrere Bleichlösungen beschrieben worden. Wir haben versucht, fünf verschiedene Rezepte (Tabelle I) und, in unseren Händen, sie zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Synchronisation der Wurm Populationen (Abb. 1). Allerdings haben unsere Experimente zeigen, dass Parameter wie Temperatur (Abb. 2), das Verhältnis Bleichlösung: Volumen von Würmern (Abb. 3) und dem Volumen der M9, mit dene...

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