Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Riepilogo

La facilità di mantenere e diffondere il nematode C. elegans Ne fanno un organismo modello bello lavorare con. La possibilità di vermi sincronizzazione consente di lavorare con una quantità significativa di soggetti alla stessa fase di sviluppo, che facilita lo studio di un processo particolare in molti animali.

Abstract

La ricerca sulla biologia molecolare e dello sviluppo del nematode Caenorhabditis elegans è iniziata nei primi anni settanta da Sydney Brenner e da allora è stato ampiamente utilizzato come organismo modello ^1. C. elegans possiede attributi chiave come la semplicità, la trasparenza e il breve ciclo di vita che ne hanno fatto un adeguato sistema sperimentale per studi biologici di base per molti anni ^2. Scoperte di questo nematode avere vaste implicazioni, perché molti processi cellulari e molecolari che controllano lo sviluppo degli animali sono soggetti ad evoluzione conservate ^3.

C. elegans ciclo di vita passa attraverso uno stadio embrionale e quattro stadi larvali prima che l'animale raggiunge l'età adulta. Lo sviluppo può prendere da 2 a 4 giorni a seconda della temperatura. In ciascuno dei diversi stadi tratti caratteristici possono essere osservati. La conoscenza della sua linea cellulare completo di ^4,5 insieme al annotat profondaione del suo genoma trasformare questo nematode in un grande modello in campi diversi come la neurobiologia ^6, l'invecchiamento ^7,8, biologia delle cellule staminali ⁹ e biologia linea germinale ^10.

Una caratteristica aggiuntiva che rende C. elegans un modello attraente per lavorare con la possibilità di ottenere popolazioni di vermi sincronizzati in una fase specifica attraverso un protocollo di relativamente facile. La facilità di manutenzione e di moltiplicazione questo nematode aggiunta alla possibilità di sincronizzazione fornire un potente strumento per ottenere grandi quantità di vermi, che possono essere utilizzati per una varietà di piccoli esperimenti o ad alta resa come schermi RNAi, microarrays, sequenziamento di massa, immunoblot o ibridazione in situ, tra gli altri.

A causa della sua trasparenza, C. elegans strutture possono essere distinti sotto il microscopio usando microscopia interferenza differenziale contrasto, noto anche come micro Nomarskicopiare. L'impiego di un legante DNA fluorescente, DAPI (4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo), per esempio, può portare alla identificazione specifica e la localizzazione delle singole celle, così come le strutture subcellulari / difetti ad essi associati.

Protocollo

1. Protocollo A: Worms coltura per Bleaching ¹¹

Popolazioni di C. elegans può essere ottenuto coltivando loro o in terreni liquidi o su supporti solidi in piastre. Di solito sono cresciuti su un solido NGM (Media crescita nematodi) e alimentate con E. coli, che si aggiungono alle piastre sia vivo o morto (ucciso da UV ^12, dal calore o dal freddo ^{13 14).} La procedura più comune utilizza dal vivo OP50 E. coli, che è carente nella sintesi di uracile e non possono proliferare in uno strato spesso che oscurerebbe i vermi.

1. Mescolare 3 g di NaCl, 17 g di agar e 2,5 g di peptone e aggiungere 975 ml di H ₂ O. Autoclave per 50 min.
2. Raffreddare il pallone a 55 ° C.
3. Aggiungere 1 ml di 1 M CaCl _2, 1 ml di 5 mg / ml in etanolo colesterolo, 1 ml di 1 M MgSO ₄ e 25 ml di 1 M KPO ₄ tampone (tutti ma colesterolo precedentemente autoclavabilendr).
4. Utilizzando procedure sterili erogare la soluzione NGM in piastre di Petri; riempire piastre fino a 2/3 del loro volume.
5. Una volta asciutto, è opportuno lasciare le piastre a temperatura ambiente per 2-3 giorni prima dell'uso per la rilevazione di contaminanti. Preparare una striscia di OP50 E. coli provenienti da uno stock di glicerolo (OP50 possono essere ottenute presso il Caenorhabditis Genetics Center).
6. Scegliere una singola colonia e crescere in LB notte a 37 ° C con agitazione.
7. Consentire eccesso di evaporazione dalle piastre rimuovendo il coperchio nel flusso laminare e aggiungere OP50 al centro delle piastre con una pipetta Pasteur sterile.
8. Lasciare che il E. OP50 prato coli di crescere durante la notte a temperatura ambiente oa 37 ° C per 8 ore.
9. Aggiungere la quantità desiderata di vermi alle piastre (se incubate a 37 ° C le piastre devono essere raffreddati a temperatura ambiente prima dell'uso).

TIPS:

• La colata della stessa quantità di mezzile piastre con una pipetta o un erogatore pompa assicura lo stesso volume di agar alle piastre e facilita lo spostamento della piastra, senza necessità di reindirizzare il stereomicroscopio.
• Piastre (sia semi e non seminata con batteri) può essere utilizzato diverse settimane dopo preparata se conservata in un contenitore a temperatura ambiente o 4 ° C.
• Evitare placcatura i batteri al bordo della piastra. Se il prato estende fino ai bordi della piastra dei vermi può strisciare i lati, asciugare e muoiono.
• Worms vivono più a lungo se i batteri seminati sulle piastre sono già morti ^15.

2. Protocollo B: Il trattamento con soluzione di ipoclorito alcalino ("bleaching") ¹¹

La tecnica sbiancante viene utilizzato per sincronizzare C. culture elegans nella prima fase larvale (L1). Il principio del metodo risiede nel fatto che i vermi sono sensibili alla candeggina mentre il guscio dell'uovo e proteggembryos da esso. Dopo il trattamento con soluzione di ipoclorito alcalino, gli embrioni vengono incubati in mezzi liquidi senza cibo, che permette la schiusa, ma impedisce l'ulteriore sviluppo.

1. Lasciare vermi a crescere fino a stadio adulto.
2. Recupera adulti gravide a provette da 15 ml lavando piatti con tampone M9.
3. Vermi pellet mediante centrifugazione per 2 minuti a 400xg (~ 1500 rpm in una centrifuga da tavolo standard) a temperatura ambiente il surnatante.
4. Eseguire lavaggi 1-3 finché il buffer appare chiaro di batteri.
5. Aggiungere la soluzione desiderata sbianca (Tabella I) e agitare per alcuni minuti (distruzione del tessuto adulto devono essere monitorati sotto il microscopio da dissezione e la reazione ferma quando le tracce di adulti sono ancora visibili, che richiede in genere tra 3 e 9 minuti a seconda delle diverse questioni, come il volume del verme pellet, menzionato nella discussione) (Fig. 3).
6. Fermare la reazione aggiungendo M9 buffer per riempire il tubo.
7. Rapidamente centrifugare (poiché il trattamento può essere ancora attivo) per 1 minuto a 400 xg ed eliminare il surnatante.
8. Lavare a pellet altre tre volte riempiendo la provetta con il tampone M9.
9. Aggiungere 1 ml di tampone M9 al pellet, o mettere le uova a piastre NGM non teste di serie, e incubare alla temperatura desiderata con leggera agitazione. Aerazione adeguata dovrebbe essere fornita (Fig. 4).

TIPS:

• Ci sono diverse soluzioni sbiancanti, scegliere quello che funziona meglio nelle vostre mani (Tabella 1, fig. 1).
• Uova già previste sulle piastre possono essere recuperati dalla demolizione la superficie del agar con un materiale morbido, come un pezzo di una pellicola a raggi X.
• Troppi resti di animali adulti, può compromettere la sincronizzazione poiché costituiscono un approvvigionamento di cibo per le larve di recente tratteggiato.
• L'aumento delle temperature un po 'accelerare lo sviluppo, che è scomodo if qualsiasi verme salta sincronizzazione perché la differenza di sviluppo tra vermi sincronizzate e sincronizzati sarà maggiore a temperature più elevate.
• Soluzione di sbianca deve essere effettuata appena prima della sua utilizzazione. Inoltre, candeggina perde potenza dopo che è stato aperto per un po ', in parte a causa della sua fotosensibilità. Si consiglia di aliquota ogni bottiglia nuovo in otri ambra piccoli per evitare la perdita e ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

3. Protocollo C: Placcatura Worm

1. Attendere tra 12 e 24 ore (tempo per completare sviluppo embrionale dipende dalla temperatura) è stata eseguita dopo sbiancamento e recuperare vermi mediante centrifugazione (2 minuti a 400 xg).
2. Gettare il surnatante, worm seme sulle tavole che sono necessarie e lasciare asciugare il liquido restante.
3. Posizionare le piastre alla temperatura richiesta.

TIPS:

• Larve L1 in M9 tampone può essere mantenuto a 15 ° C a dondolo almeno per una settimana wiThout alterazioni evidenti.
• fare attenzione nel calcolo i vermi si seme perché troppi può esaurire il cibo più velocemente del previsto e rovinare il vostro esperimento. Circa 500 L1 può raggiungere l'età adulta in una piastra 55 mm, senza rimanere a corto di cibo.

4. Protocollo D: C. elegans osservazione

D.1 Nomarski osservazione

Interferenza differenziale microscopia ottica di contrasto è una tecnica di microscopia di illuminazione utilizzati per migliorare il contrasto non colorati in campioni trasparenti. Il Nomarski parola si riferisce al prisma utilizzato, il nome del suo inventore. Osservando gli animali vivi, siamo in grado di esaminare la fisiologia dell'animale con le alterazioni soli derivati ​​da immobilizzazione. Inoltre, poiché non viene aggiunto fissativo, marcatori fluorescenti possono essere osservato in vivo. Questo fatto e la possibilità di marcatori fluorescenti fusione ad un gene di interesse perché sia ​​possibile seguire processi which la proteina di studio possono essere coinvolti. Utilizzando la tecnica descritta in questo protocollo, non solo i vermi vivi può essere osservato, ma possono anche essere recuperato e piastrate nuovamente.

Agar preparazione pad (appena prima dell'uso):

1. Preparare agarosio 2% in acqua e si fondono. Mantenere fuso a 65 ° C.
2. Posizionare due vetrini con un pezzo di nastro su di essi su entrambi i lati di un terzo, vetrino pulito.
3. Usando una pipetta Pasteur luogo una goccia di agar sulla superficie pulita.
4. Coprire il agar con un altro vetrino pulito collocato su tre slitte perpendicolarmente.
5. Premere tal modo, l'agar goccia è appiattita allo spessore dei distanziali a nastro.
6. Una volta che l'agar si solidifica, estrarre delicatamente i vetrini nastrate e separare le due rimanenti diapositive facendo scorrere uno rispetto all'altro.

Montaggio animali vivi

7. Porre una goccia (10 ul) di levamisole 1mm o di sodio azide 10-30 mm su tha centro del pad.
8. Di trasferire gli animali in calo con un pick worm.
9. Posizionare delicatamente il coprioggetto sugli animali e fissarlo su entrambi i lati con un po 'smalto o silicone.

TIPS:

• Mantenere aliquote di agarosio 2% a 4 ° C.
• Agarosio fuso può essere mantenuta a 65 ° C per almeno un giorno.
• Nota: Levamisole è un agonista del recettore nicotinico che provoca la paralisi spastica dei muscoli ^16.
• Siate cauti, sodio azide è estremamente tossico!

D.2 Etanolo fissazione e colorazione DAPI

Il protocollo qui descritto rappresenta un modo veloce di tintura vermi con DAPI, tuttavia a causa della dissecation del worm alcune strutture possono presentare qualche alterazione. Ci sono molti altri metodi per fissare i vermi precedenti colorazione DAPI come la fissazione con la soluzione di Carnoy o formaldeide che meglio preservare l'integrità del worm ¹⁷.

Etanolo di fissaggio (modificato da ¹⁸⁾

1. Inserire ~ 10 pl di tampone M9 (o acqua) su un vetrino da microscopio.
2. Utilizzando un worm scegliere attentamente trasferire 10-25 vermi alla goccia.
3. Utilizzando carta da filtro o di una micro-pipetta rimuovere il tampone M9 il più possibile, senza rimuovere i vermi o lasciarli asciugare.
4. Aggiungi ~ 10 pl del 90% di etanolo e lasciare asciugare.
5. Ripetere il punto 4 una o due volte.

4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) colorazione

6. Mescolare DAPI con i mezzi di montaggio desiderata ad una concentrazione finale di 2 ng / pl.
7. Una volta che l'etanolo è completamente evaporato, si aggiungono 7 microlitri della DAPI: montaggio miscela media.
8. Posizionare un vetrino e fissarlo su entrambi i lati con un po 'smalto o silicone. I vetrini sarà pronto per l'osservazione circa 5 minuti dopo l'aggiunta di DAPI.

TIPS:

• Il montaggio media contiene glicerolo, quindi una piccola quantità è sufficiente a coprire l'intera preparazione.
• Esiste una vasta gamma di supporti di montaggio commerciali (Fluoromount o prolungare, per esempio), la loro qualità e il prezzo dipenderà da quanto tempo si desidera memorizzare il vostro campione.
• Attenzione, DAPI è un noto agente mutageno che si lega fortemente ad AT regioni ricche di DNA.

Ricette

Nematode Medio Crescita (NGM)

1,7% (w / v) Agar
50 mM NaCl
0,25% (w / v) Peptone
1 mM CaCl ₂
5 pg / ml Colesterolo
25 mM KPO ₄
1 mM MgSO ₄

M9 tampone

22mm KH ₂ PO ₄
42 mM Na ₂ HPO ₄
86 mM NaCl
1 mM MgSO ₄

Soluzioni di sbianca testato

	Ricetta # 1	Ricetta # 2	Ricetta # 3	Ricetta # 4	Ricetta # 5
acqua (ml)	2,75	3,5	0,5	0,5	1,5
idrossido di sodio (ml)	1,25 (1M)	0,5 (5M)	2,5 (1M)	2,5 (2M)	2,5 (1M)
ipoclorito di sodio ~~~V 4% (ml)	1	1	1	2	1
totale (ml)	5	5	4	5	5

Tabella I. ricette diverse soluzioni sbiancanti testato per questo articolo. Ricette # 3 e # 4 sono 2x, e devono essere aggiunti allo stesso volume di M9. Ricette per # 1, # 2 e # 5 sono stati riportati in precedenza ^{2, 11, 19.} Le concentrazioni finali: # 1 NaOH 0.25M, NaOCl ~~~V 0,8% , # 2 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0,8%.

5. Rappresentativi risultati

Figura 1. Confronto tra cinque diverse soluzioni sbiancanti in due tempi diversi di incubazione. Vermi N2 lavato due volte con M9 sono stati divisi in cinque provette da 15 ml coniche contenenti ciascuna soluzione sbiancante. I tubi sono stati agitati vigorosamente e 1 ml trasferito in una nuova provetta con M9 per arrestare la reazione dopo il tempo specificato. Dopo lo sbiancamento vermi procedura sono stati incubati con 1 ml di M9 a 20 ° C per 24 ore. In ogni caso, inferiore a foto è stata scattata subito dopo il candeggio, figura in alto dopo 24 ore.

_upload/4019/4019fig2.jpg "alt =" Figura 2 "/>
Figura 2. Temperatura di soluzione di sbianca influenza l'efficacia del trattamento. Volumi uguali di vermi N2 sono stati sbiancata con la stessa soluzione sbianca sia precedentemente raffreddata su ghiaccio per 20 minuti e mantenuta a 25 ° C per lo stesso tempo. Le due colonne sulla sinistra mostrano le immagini subito dopo lo sbiancamento. Dopo trattamento vermi sono state incubate in provette da 15 ml coniche con 1 ml di M9 a 20 ° C per 24 ore. Colonne sulle immagini sul display di destra 24 ore dopo.

Figura 3. Il rapporto verme pellet: tempo di incubazione ipoclorito alcalino influenza l'efficacia del trattamento microlitri 50, 100, 250 e 500 della vite senza fine pellet sono stati incubati con 2 ml di soluzione di sbianca # 3 per 3 minuti, 6 e 9.. L1, gli embrioni nati morti e resti di frammenti adulti sono stati quantificati dopo incubazione a 20 ° C per 2 4 ore in 15 ml provette coniche con 1 ml di tampone M9. Circa tre confluenti 55 mm con piastre di vermi adulti sono necessari per ottenere un 100 pl verme pellet.

Figura 4. La corretta aerazione è necessario per la schiusa e la sopravvivenza di C. embrioni elegans. pellet A 100 pl di vermi N2 sono stati sbiancata per 6 minuti e incubate in provette da 15 ml coniche con 1 ml, 5 o 10, come specificato, di M9 a 20 ° C per 24 ore. La parte superiore della figura mostra le immagini delle culture dopo 24 ore, ove le frecce indicano che le uova si schiudono non. Nella parte inferiore, vi è un grafico che illustra la quantità di larve (grigio chiaro) ed embrioni morti (grigio scuro) 48 ore dopo lo sbiancamento alle condizioni indicate.

tp_upload/4019/4019fig5.jpg "alt =" Figura 5 "/>
Figura 5. Ciclo di vita di C. elegans. uno. Durata approssimativa dei vermi nelle diverse fasi. Ore necessarie per raggiungere ogni fase in funzione della temperatura (modificato da ^20). B. Nomarski (in alto) e DAPI (in basso) le immagini di vermi diversi nelle fasi di sviluppo indicati. Caratteristiche più significative di ogni fase vengono ingranditi L1: freccia indica i precursori della gonade somatica e linea germinale precoce L4: freccia nera (Nomarski) indica la vulva di sviluppo; frecce bianche (DAPI) indicano i due bracci Mid-gonadici... tardo L4: freccia indica la vulva sviluppando la cosiddetta fase di albero di Natale adulti giovani:. freccia nera indica un embrione all'interno dell'utero, Arrowhead punti al spermateca, freccia bianca indica un ovocita Gravid adulto:. Arrowhead (DAPI) sottolinea embrioni fecondati. Arrow in DAPI immagine indica spermateca.

Figura 6. Morfologia Vulva a L3, L4 e stadi adulti. Nella fase L3 solo un piccolo lume dove viene formata la vulva può essere osservato. A L4, questo lume espande formando il cosiddetto "albero di Natale". Nell'adulto la vulva è già chiuso. Le linee gialle indicano la posizione della vulva in queste tre fasi.

Figura 7. Colorazione DAPI a L3, L4 precoce, stadi più avanzati L4 e adulti. A L3, linea germinale è allungata. A L4, gonadi armi presenti a forma di U morfologia. Al fine-L4 spermatozoi stadio può essere osservato nella parte distale della gonade. Giovani Adulti presenti ovociti. La linea germinale Adult presenta ovociti ed embrioni. Le linee gialle delimitano linee germinali a thle e diverse fasi indicate.

Figura 8. C. sviluppo elegans a 15 e 25 ° C. I vermi N2 erano sbiancata, incubate per una notte in M9 e agitazione a 15 ° C, trasferito a piatti e coltivate i tempi indicati alle temperature indicate.

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Discussione

Nematode sincronizzazione

Varie soluzioni sono state descritte sbianca. Abbiamo provato cinque diverse ricette (Tabella I) e, nelle nostre mani, non hanno mostrato differenze significative nella sincronizzazione delle popolazioni a vite senza fine (Fig. 1). Tuttavia, i nostri esperimenti ha dimostrato che parametri quali la temperatura (Fig. 2), la soluzione rapporto di sbianca: volume di vermi (Fig. 3) e il volume di M9 con cu...

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