Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Özet

Nematod koruma ve yayma kolaylığı C. elegans Onunla çalışmak çok güzel bir model organizma olun. Senkronize solucanların olasılığı çok hayvanlarda belirli bir işlem çalışma kolaylaştırır, ne de aynı gelişim aşamasında deneklerin önemli bir miktarda çalışma sağlar.

Özet

Nematod Caenorhabditis elegans moleküler ve gelişim biyolojisi üzerine araştırmalar Sydney Brenner tarafından Yetmişli yılların başında başladığını ve o zamandan beri bir model organizma ¹ olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. C. elegans gibi uzun yıllar ² temel biyolojik çalışmalar için uygun bir deneysel sistem yaptık sadelik, şeffaflık ve kısa yaşam döngüsü gibi önemli özelliğe sahip. Birçok hücresel ve moleküler süreçlerin kontrolü hayvan gelişimi evrimsel korunmuş ³ olduğunu, çünkü bu nematod Keşifler geniş etkileri vardır.

Hayvanlar yetişkinliğe ulaşmadan C. elegans yaşam döngüsünün bir embriyonik evre ve dört larval evreden geçer. Kalkınma sıcaklığa bağlı olarak 2 ila 4 gün sürebilir. Aşamaların her birkaç karakteristik özelliklerini görülebilir. Derin annotat ile birlikte ^4,5 komple hücre soyunun bilgigenom iyon ^7,8 yaşlanma nörobiyoloji ^6, kök hücre biyolojisi ⁹ ve germ line biyoloji ¹⁰ gibi çok farklı alanlarda büyük bir modelin içine bu nematod açın.

C. kılan ek bir özelliği çalışmak için cazip bir model elegans nispeten kolay bir protokol ile belirli bir aşamada senkronize solucanlar nüfus alma imkanı vardır. Bu nematod sürdürmek ve yayma kolaylığı gibi RNAi ekranlar, mikroarrayler, masif sıralama gibi küçük ya da yüksek verim denemeleri çeşitli için kullanılabilir solucanlar büyük miktarda elde etmek için güçlü bir araç sağlar senkronizasyon imkanı eklendi diğerleri arasında immunoblotting veya in situ hibridizasyon,.

Şeffaflığı, C. nedeniyle elegans yapıların da Nomarski micros olarak bilinen, Diferansiyel Girişim Kontrast mikroskobu kullanılarak mikroskop altında ayırt edilebilirkopyalayın. Bir floresan DNA bağlayıcı, DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) kullanımı, örneğin, belirli bir tanımlama ve Lokalizasyon tek tek hücrelerin yanı sıra, hücre içi yapıları / bunlara eşlik bozukluklara yol açabilir.

Protokol

1. Protokol A: ¹¹ Kasar için Kültüre Worms

C. Büyük popülasyonları elegans sıvı ortam içinde veya plakaların katı ortam üzerine ya kültürleme bunlardan elde edilebilir. Bunlar genellikle E ile katı NGM (Nematodu Büyüme Media) ve beslenen yetiştirilmektedir coli (ısı ¹³ veya soğuk ^14, UV ¹² tarafından öldürüldü), canlı veya ölü ya plakaları eklenir bakteriler. En sık uygulanan cerrahi canlı OP50 E. kullanır urasil sentezinde arızalı bozabilir ve solucanlar olur kalın bir tabaka haline Sığmamak olamaz coli,.

1. NaCl 3 g, 17 g agar ve pepton, 2.5 g karıştırın ve H ₂ O ve 975 mL 50 dk için otoklava.
2. 55 ° C'ye kadar soğumaya şişeye
3. 1 M _CaCI2 ve 1 ml etanol içinde 5 mg / ml kolesterol 1 ml 1 M MgSO ₄ ve 1 ml 1 M KPO ₄ tamponu, 25 mL (hepsi aynı kolesterol önceden autoclav eklemeed).
4. Steril prosedürleri kullanarak Petri kapları içine NGM solüsyonu dağıtmak; kendi hacminin 2/3 tabak kadar doldurun.
5. Kuruduktan sonra, kirletici maddelerin tespiti için kullanımdan önce 2-3 gün için oda sıcaklığında plakaları bırakmak için tavsiye edilir. OP50 E. bir çizgi hazırlayın Bir gliserol stoktan coli (OP50 Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden temin edilebilir).
6. Tek bir koloni seçin ve ajitasyon ile 37 ° C de bir gece LB içinde büyür.
7. Laminar akış kapağı kaldırarak plakalardan buharlaşması ve steril bir Pasteur pipetle plakaların merkezine OP50 eklemek için neme aşan izin verir.
8. OP50 E. İzin coli çim 8 saat boyunca oda sıcaklığında ya da 37 ° C de bir gece boyunca büyümesi.
9. Plakalar (37 inkübe halinde ° C plakalar kullanılmadan önce oda-sıcaklığında soğutulur edilmelidir) ile solucanların istenen miktarda ekleyin.

İPUÇLARI:

• Medya aynı miktarda dökmebir pipetle veya pompa ile dağıtıcı plakalarda agar plakaları, aynı hacim sağlar ve stereomikroskop yönlendirmesi gerek olmadan plakanın vites kolaylaştırır.
• Oda sıcaklığında veya 4 ° C'de bir kapta saklandığında Levhalar (seribaşı ve bakteri ile dereceye giremeyen iki) birkaç hafta Hazırlanan sonra kullanılabilir
• Plaka kenarına bakteri kaplama kaçının. Çim solucanlar tarafı yukarı tarama olabilir plakanın kenarlarına kadar uzanır ise, dışarı kurur ve ölür.
• Plakalar üzerinde tohumlanıyor bakteriler zaten ¹⁵ ölü varsa Worms daha uzun yaşıyor.

2. Protokol B: Alkali Hipoklorit Çözüm tedavisi ("Bleaching") ¹¹

Ağartma yöntemi C. senkronizasyonu için kullanılır İlk larva aşamasında elegans kültürleri (L1). Yumurta kabuğu e korur yöntemin prensibi solucanlar ağartıcıya duyarlı olduğunu yatmaktadırbundan mbryos. Alkalin hipoklorit solüsyonu ile tedaviden sonra, embriyolar kuluçka verir fakat daha fazla gelişimini engeller, gıda, sıvı olmadan medyada inkübe edilir.

1. Solucanlar erişkin aşamasına kadar büyümesine izin verin.
2. M9 tamponu ile tabak yıkama ile 15 ml tüpler içinde gebe yetişkin kurtarın.
3. Oda sıcaklığında 400xg (standart bir tablo santrifüj üzerine ~ 1500 rpm) 2 dakika santrifüj ve süpernatan atmak tarafından Pelet solucanlar.
4. Tampon bakteri net görünene kadar 1-3 yıkama yapın.
5. Istenilen beyazlatma solüsyonu (Tablo I) ekleyin ve (yetişkin doku yıkımı mikroskop altında izlenen ve yetişkinlerin izleri hala görünür olduğunda reaksiyon genellikle birkaç bağlı olarak 3 ila 9 dakika sürer, durdurulması gerektiğini bazı dakika için kışkırtıcılık Bu tür tartışma bahsedilen solucanı pelet hacim) (Şekil 3) gibi sorunları,.
6. M9 Buffe ekleyerek reaksiyonu durdurunr tüpü doldurmak için.
7. Hızla 400 xg 1 dakika için (tedavisi hala aktif olabilir beri) santrifüj ve supernatant atın.
8. M9 tamponu ile tüp doldurarak pelet daha üç kez yıkanır.
9. Pelet için M9 tampon 1 ml ekleyin, ya da dereceye giremeyen NGM plakalarına yumurta yerleştirin ve yavaşça sallanarak ile istenilen sıcaklıkta inkübe edin. Uygun havalandırma (Şekil 4) temin edilmelidir.

İPUÇLARI:

• Farklı beyazlatma çözümü vardır, (Tablo 1, Şekil 1). Elinizde daha iyi çalışır birini seçin.
• Zaten plakalar üzerine serilir yumurtaları, böyle bir X-ışını filmine bir parça gibi yumuşak bir malzeme ile agar yüzeyi kazıma ile geri kazanılabilir.
• Onlar yakın zamanda yumurtadan larva için bir gıda kaynağı teşkil gibi yetişkin hayvanların çok fazla kalıntı senkronizasyonu bozabilir.
• Yüksek sıcaklıklar biraz rahatsız edici olduğunu gelişimini hızlandırmak isenkronize ve eşitlenmemiş solucanlar arasındaki gelişmişlik farkının daha yüksek sıcaklıklarda daha fazla olacaktır, çünkü f herhangi bir solucan atlar senkronizasyonu.
• Ağartma çözeltisi ile kullanımdan hemen önce gerçekleştirilmesi gerekir. Bir süre açık olmuştur sonra ek olarak, bu ağartıcı fotosensitivite bağlı, kısmen potensi kaybeder. Biz kaybını önlemek ve ışık maruziyeti en aza indirmek için küçük sarı şişeler içine tablet, her yeni şişe öneririz.

3. Protokol C: Solucan Kaplama

1. Ağartma yapıldı sonra 12 ve 24 saat (embriyonik gelişimi tamamlamak için zaman sıcaklığına bağlıdır) arasında bekleyin ve santrifüj (400 xg'de 2 dakika) solucanlar kurtarabilirsiniz.
2. Gerekli plakalar üzerinde yüzer, tohum solucanlar atın ve kalan sıvı kurumaya bırakın.
3. Gerekli sıcaklıkta tabak yerleştirin.

İPUÇLARI:

• M9 tampon içinde L1 larvaları ° C'de bir hafta boyunca en az bir sallanan Wi 15 tutulabilirbariz değişiklikler thout.
• çok beklenenden daha hızlı gıda tüketmesine ve deneme kalıntısı olabilir çünkü tohum olacak solucanlar hesaplanırken dikkatli olun. Yaklaşık 500 L1 yiyecek tükeniyor olmadan bir 55 mm levha erişkin ulaşabilirsiniz.

4. Protokol D: C. elegans Gözlem

D.1 Nomarski gözlem

Diferansiyel girişim kontrast mikroskopi boyanmamış şeffaf örneklerinde kontrastı artırmak için kullanılan optik mikroskopi aydınlatma tekniğidir. Kelimesi Nomarski Yaratıcısının adını kullanılan prizma, ifade eder. Hayvanları canlı canlı gözlemleyerek, immobilizasyon elde sadece değişikliklerle hayvan fizyolojisi incelemek mümkündür. Herhangi sabitleştirici eklenir Buna ek olarak, flüoresan belirteçler in vivo tespit edilebilir. Bu gerçek bir ilgi ve gen üzerinde ısıtılmadan floresan işaretleri olasılığı bu mümkün w süreçleri takip etmeyi kolaylaştırırÇalışmanın proteini tutulabilir hich. Bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak, canlı solucanlar sadece görülebilir, ama onlar da yine kurtarıldı ve kaplama yapılabilir.

Agar ped hazırlama (sadece kullanımdan önce):

1. Su içinde% 2 agaroz hazırlayın ve eritin. 65 eridi tutun ° C
2. Üçüncü, temiz slayt her iki tarafında onlara bir bant ile iki slayt yerleştirin.
3. Bir Pasteur pipeti yere temiz bir yüzey üzerine agar bir damla.
4. Dik üç slayt üstüne yerleştirilen başka bir temiz slayt agar örtün.
5. Böylece agar damla bandı aralayıcılar kalınlığına düzleştirilir yavaşça basın.
6. Agar katılaşır sonra, yavaşça bantlanmış slaytlar çekin ve birini diğerine göre kaydırarak kalan iki slaytlar ayırın.

Canlı hayvan Montaj

7. T üzerine bir yerde bir levamisole 1mM damla (10 mikrolitre) veya sodyum azid 10-30 mMo yastığı ortalarsınız.
8. Bir solucan seçim kullanarak damla içine hayvanlar aktarın.
9. Yavaşça hayvanlar üzerinde bir coverslip yerleştirmek ve bazı tırnak cilası ya da silikon ile her iki tarafta bunu düzeltmek.

İPUÇLARI:

• 4 ° C de% 2 agaroz hacimde tutun
• Erimiş agaroz, en az bir gün boyunca 65 ° C'de saklanabilir.
• Not: Levamisole spastik kas felci ¹⁶ elicits bir nikotinik reseptör agonistidir.
• Dikkatli olun, Sodyum Azide son derece zehirlidir!

D.2 Etanol fiksasyon ve DAPI boyaması

Burada açıklanan protokol Ancak, çünkü solucanın dissecation bazı yapıları bazı değişiklik ortaya çıkabilir, DAPI ile solucanlar boyama hızlı bir şekilde temsil eder. Böyle daha iyi solucan ¹⁷ bütünlüğünü korumak Carnoy çözümü veya formaldehit ile fiksasyon olarak DAPI boyama önceki solucanlar düzeltmek için birçok yöntem vardır.

Etanol fiksasyon ⁽¹⁸ değiştirilerek)

1. Yeri ~ bir mikroskop lamı üzerine M9 tampon 10 ul (veya su).
2. Bir solucan kullanarak dikkatle damlasına kadar 10-25 solucanlar aktarmak bulmaya başladım.
3. Solucanları kaldırma ya da kuru izin vermeden filtre kağıdı ya da mümkün olduğunca bir mikro-pipet kaldırmak kadar M9 tampon kullanma.
4. % 90 etanol ~ 10 ul ekleyin ve kurumaya bırakın.
5. Bir veya iki kez 4. adımı yineleyin.

4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama

6. 2 ng / ml arasında bir nihai konsantrasyona istenen yarığına sahip DAPI karıştırılır.
7. Yarığına karışımı: etanol tamamen buharlaştırıldı sonra, DAPI 7 ul ekleyin.
8. Bir coverslip yerleştirin ve bazı tırnak cilası ya da silikon ile her iki tarafta bunu düzeltmek. Slaytlar DAPI ilave edildikten sonra gözlem yaklaşık 5 dakika için hazır hale gelecektir.

İPUÇLARI:

• Montaj medİA gliserol içeren, az miktarda bir bütün hazırlanması karşılamak için yeterli olacak şekilde.
• Ticari yarığına geniş bir yelpazede (Fluoromount veya Prolong, örneğin) vardır, bunların kalite ve fiyat sizin örnek saklamak istediğiniz ne kadar bağlıdır.
• Dikkatli olun, DAPI DNA zengin bölgeler AT güçlü bağlar bilinen bir mutajen olduğunu.

Tarifler

Nematod Büyüme Orta (NGM)

% 1.7 (w / v) Agar
50 mM NaCl
% 0.25 (a / h) pepton
1 mM _CaCI2
5 ug / ml Kolesterol
25 mM KPO ₄
1 mM MgSO ₄

M9 tampon

22mm KH ₂ PO ₄
42 mM Na ₂ HPO ₄
86 mM NaCl
1 mM MgSO ₄

Kasar çözümleri test

	tarifi # 1	tarifi # 2	tarifi # 3	tarifi # 4	tarifi # 5
Su (ml)	2.75	3.5	0.5	0.5	1.5
sodyum hidroksit (ml)	1,25 (1M)	0.5 (5M)	2,5 (1M)	2,5 (2M)	2,5 (1M)
sodyum hipoklorit% 4 (ml) Resimler ~	1	1	1	2	1
Toplam (ml)	5	5	4	5	5

Tablo I. Farklı beyazlatma solüsyonu tarifleri Bu yazı için test edilmiştir. Tarifler # # 3 ve 4 2x olup, M9 aynı hacimde ilave edilmelidir. # 1, # # 2 ve 5 tarifleri için daha önceden ^{2, 11, 19} bildirilmiştir. Final konsantrasyonları: # 1 NaOH 0.25M, NaOCl% 0.8 Resimler ~ , # 2 NaOH 0.5M NaOCl ~% 0.8, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~% 1, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~% 1.6, # 5 NaOH 0.5M NaOCl ~% 0.8.

5.. Temsilcisi sonuçları

Şekil 1.. Iki farklı inkübasyon zamanlarda beş farklı beyazlatma çözümler Karşılaştırılması. N2 solucanlar M9 ile iki kere yıkanır, her beyazlatma solüsyonu içeren beş 15 ml konik tüpler içine ayrıldı. Tüpler kuvvetli bir şekilde çalkalandı ve 1 ml belirlenmiş bir süre sonra tepkime durdurma M9 sahip yeni bir tüpe aktarıldı. Ağartma sonra prosedürü solucanlar 24 saat boyunca 20 ° C'de M9 1 ml ile inkübe edildi. Her iki durumda da, daha düşük bir görüntü, sadece 24 saat sonra, üstte resim ağartma sonrası alınmıştır.

_upload/4019/4019fig2.jpg "alt =" Şekil 2 "/>
Şekil 2. Ağartıcı çözeltinin sıcaklığı tedavisinde de etkilidir. N2 solucanlar eşit hacimleri, ya daha önceden 20 dakika boyunca buz üzerinde soğutuldu ve aynı süre için 25 ° C'da muhafaza aynı ağartma çözeltisi ile ağartılmış edildi. Sadece beyazlatma sonrası sol gösteri resimlerin üzerine iki sütun. Tedavi solucanlar 24 saat boyunca 20 ° C'de M9 1 ml ile 15 ml konik bir tüp içinde inkübe edildikten sonra. 24 saat sonra sağ ekranda resimlerin Sütunlar.

Şekil 3. Oranı solucanı pelet: alkalin hipoklorit inkübasyon süresi tedavisinde de etkilidir solucanı pelet 50, 100, 250 ve 500 ul 3, 6 ve 9 saat için çözelti içinden 3 ağartma 2 ml ile inkübe edildi.. Taranmış L1, ölü embriyo ve yetişkin parçalarının kalıntıları 2 için 20 ° C'de inkübasyondan sonra ölçüldü 4 M9 tamponu 1 ml olan 15 ml'lik tüplere konik saat. Erişkin solucanlar ile yaklaşık üç konfluent 55 mm levha 100 ul solucan pelet almak için gereklidir.

Şekil 4. Uygun havalandırma kuluçkalık ve C. yaşaması için gereklidir elegans embriyosu. N2 solucanların A 100 ul topağı 6 dakika süreyle ağartılan ve 24 saat boyunca 20 ° C'de M9 arasında, belirtildiği gibi, 1, 5 ya da 10 ml ile 15 ml konik bir tüp içinde kuluçkalanmağa devam etmiştir. Oklar yumurtadan vermedi yumurta işaret nerede rakam üst kısmı, 24 saat sonra kültürlerin resimleri görüntüler. En altta belirtilen şartlarda beyazlatma sonrası larvalar (açık gri) ve ölü embriyo (koyu gri) 48 saat miktarını gösteren bir grafik var.

tp_upload/4019/4019fig5.jpg "alt =" Şekil 5 "/>
Şekil 5. C. yaşam döngüsü elegans. Bir. Farklı aşamalarda solucanlar yaklaşık uzunluğu. Saat sıcaklığı ⁽²⁰ değiştirilerek) Belirtilen gelişim aşamalarında farklı solucan. B. Nomarski (yukarı) ve DAPI (aşağı) resimler bağlı olarak her bir aşamaya ulaşmak için gerekli. Her aşamada en önemli özelliği büyütülmüş L1: ok gonad somatik ve germ hattı öncüleri gösterir L4 Erken: siyah ok (Nomarski) gelişmekte olan vulva gösterir; beyaz oklar (DAPI) iki gonadal silah işaret Orta... L4 geç: ok sözde Noel ağacı aşamada gelişen vulva gösterir Genç Yetişkin:. siyah ok rahim içinde embriyo gösterir, ok ucu noktaları spermateka için, beyaz ok Yumurta gösterir Hamile olan yetişkin:. ok (DAPI) puan Döllenen embriyolar. DAPI görüntü Ok spermateka gösterir.

6 Şekil. L3, L4 ve Yetişkin aşamalarında vulva morfolojisi. L3 aşamada vulvada oluşan küçük bir lümen görülebilir. L4 anda bu lümen sözde "Noel ağacı" oluşturan genişler. Erişkin vulva zaten kapalıdır. Sarı çizgiler bu üç aşamada vulva yerini gösterir.

Şekil 7. L3 DAPI lekelenme, erken L4, L4 geç ve Yetişkin aşamaları. L3 anda, germ line uzamıştır. L4, gonad silah mevcut U-şekil morfolojileri. Geç-L4 aşamada spermin az gonad distalinde görülebilir. Genç Yetişkinler oosit sunuyoruz. Yetişkin germ line oosit ve embriyolar sunuyor. Sarı çizgiler th germ hatları sınırlandırmake farklı belirtilen aşamaları.

Şekil 8. C. 15 ve 25 ° C N2 solucanlar az elegans gelişimi 15 M9 ve ajitasyon ° C, tabak transfer ve belirtilen sıcaklıklarda belirtilen sürelerin yetiştirilen bir gece inkübe, ağartılmış edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Nematod Senkronizasyon

Çeşitli çözümler ağartma tarif edilmiştir. Biz beş farklı tarifler (Tablo I) çalıştı ve bizim ellerimizde, onlar solucan nüfus senkronizasyon önemli farklılıklar (Şekil 1) göstermemiştir. Solucanların hacmi (Şekil 3) ve embriyo (Şekil 4) kuluçka inkübe edilir hangi ile M9 hacmi etkide: Bununla birlikte, bu tür deneyler sıcaklığında (Şekil 2), ağartıcı ç?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.