A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
هذا الفيديو يشرح الإجراءات اللازمة لتوصيف البنكرياس الجزر الإنسان باستخدام الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) والمناعية (IHC). وملطخة أقسام البنكرياس من الرأس والجسم، ومنطقة الذيل من جانب كل من H & E وIHC لتحديد جزيرة تكوين الغدد الصماء (الأنسولين، الجلوكاجون، والبنكرياس ببتيد)، والنسخ الخلية (Ki67)، وتتسرب التهابات (H & E، CD3). يكون موضعيا في المنطقة الكلابي باستخدام IHC للببتيد البنكرياس.
تقديرات لمنطقة جزيرة وأرقام والغدد الصماء في البنكرياس تكوين الخلية البشرية الكبار تختلف من مائة ألف إلى عدة نطاقات الشامل عدة ملايين وبيتا من 500 إلى 1-3 ملغ 1500. مع هذا التباين المعروفة، وقد وضعت لتجهيز قياسي، وتلطيخ الاجراء بحيث حددت بوضوح مناطق البنكرياس والجزر تتميز باستخدام التشريح المرضي الدقيق والفحص immunolocalization.
وصفت إجراءات موحدة لمعالجة البنكرياس الإنسان تعافى من المتبرعين في الجزء 1 من هذه السلسلة. تتم معالجة البنكرياس إلى 3 مناطق رئيسية (رأس والجسم، والذيل)، يليه قطاعات عرضية. وتنقسم مزيد من المقاطع العرضية من رأس البنكرياس، كما هو مبين على أساس الحجم، ومرقمة حسب الترتيب الأبجدي للدلالة على الفروع. هذا التوحيد القياسي يسمح للتحليل كامل المقطعية في المنطقة بما في ذلك منطقة رأس الكلابي الذي يحتوي على الجزر تتكونفي المقام الأول من خلايا البنكرياس ببتيد للمنطقة الذيل.
التقرير الحالي يضم الجزء 2 من هذه السلسلة، ويصف الإجراءات المستخدمة لباجتزاء مسلسل وتوصيف الأنسجة من المقاطع البارافين البنكرياس مع التركيز على خلايا الغدد الصماء جزيرة، والنسخ، وتتسرب تي خلية. ويهدف علم الأمراض من الأقسام البنكرياس لتوصيف كل من إفرازات، ductular، ومكونات الغدد الصماء. يتم تقييم مقصورة الاكسوكرين عن وجود التهاب البنكرياس (النشطة أو المزمنة)، وضمور، والتليف، والدهون، فضلا عن نظام لاصق، وخصوصا في العلاقة مع وجود ورم البنكرياس ينترادوكتال 4. يتم تقييم الجزر لمورفولوجيا والحجم والكثافة، وخلايا الغدد الصماء، والتهاب، والتليف، اميلويد، ووجود خلايا تكرار أو أفكارك باستخدام H & E والبقع IHC.
العنصر الأخير هو موضح في الجزء 2 هو توفير الشريحة الملونالصورة الرقمية والصور الشريحة بأكملها. ويتم تنظيم الشرائح الرقمية على حدة والمنطقة البنكرياس في قاعدة بيانات على الانترنت علم الأمراض إنشاء البنك الحيوي الظاهري. ويجري حاليا توفير إمكانية الوصول إلى هذه المجموعة على الانترنت لأكثر من 200 الأطباء والعلماء المشاركين في البحث السكري من النوع 1. قاعدة البيانات على الانترنت يوفر وسيلة لتبادل البيانات السريع والكامل، وعلى المحققين تحديد كتل لالبارافين أو مقاطع المسلسل المجمدة.
1. Microtomy لأقسام غير ملوثين
2. H & E تلطيخ
3. IHC مجموعة المتابعة
4. IHC Deparaffinization واسترجاع مستضد
5. الأجسام المضادة الأولية الأول (كي-67، CD3، البنكرياس ببتيد)
6. الأجسام المضادة الابتدائية الثانية (الأنسولين، الجلوكاجون)
7. جفاف
8. شريحة وصفها
9. الشريحة المسح الضوئي
10. Representative النتائج
وقد وضعت هذه الإجراءات تلطيخ لشبكة JDRF للمانحين الجهاز البنكرياس مع مرض السكري (nPOD) لتوفير توصيف خط الأساس من البارافين وكتل الطازجة والمجمدة. كل جهة مانحة لديها خصائص أساسية يؤديها تتألف من تلطيخ 2 قطعة من كل منطقة البنكرياس (رأس والجسم والذيل) والطحال (الشكل 1، وانظر أيضا قضية استمارة التقديم، الملحق 1). ويجري في تلطيخ H & E باستخدام autostainer المبرمجة بالنسبة للمنشأة الطبية السريرية مع الصف الحلول المستخدمة في جميع أنحاء. كما كتل إضافية من الجهات المانحة هي مقطوع، لكل منها شريحة المتخذة لH & E لاظهار مورفولوجيا الأنسجة. عندما كتل هي مقطوع مرة أخرى، كما لتوزيعها على المحققين، وسوف يكون أيضا مستويات أعمق الشرائح التي اتخذت لH ممثل والشرائح الإلكترونية لتوثيق مورفولوجيا كتلة بأكمله الأنسجة وكذلك ترقيم المقاطع المسلسل على كل مستوى. وصفت الشرائح ملطخةتحديد الحالة، منطقة البنكرياس، وعدد الكتلة، وصمة عار التاريخ (الشكل 2) وفحصها في علم الأمراض على الانترنت نظام إدارة المعلومات. وتظهر الصور ممثل من إحدى الجهات المانحة تحكم في الشكل (3) في كلا تكبير المنخفضة والعالية لإظهار النتائج المتوقعة بعد هذا الإجراء. وكان يعاير والملون الشريحة مع البنكرياس ببتيد (D، H) في يوم آخر مع فحص بشكل يدوي ويظهر انخفاض كثافة تلطيخ من ملون مباين الهيماتوكسيلين. الاختلافات في تلطيخ كثافة الأجسام المضادة الأولية أو ملون مباين بين المقايسات التي ينبغي تجنبها لا سيما إذا كان استخدام تحليل الصور الشرائح خلاف مع شخص تتطلب تصحيح الألوان لتحقيق مجالات نفس الخلية أو التهم الموجهة إليه.
يجب على كل مختبر نتوقع لتحسين تركيز الأجسام المضادة كما الكثير إلى الكثير اختلاف والكواشف وشروط أخرى يمكن أن تؤثر على شدة تلطيخ والتحديد. مع اكتساب الجرمية جديدأيها السادة، يتم التحقق من صحة إجراءات تلطيخ مع عينات معروفة السيطرة الإيجابية والسلبية لتحقيق نفس الدرجة من الحدة وصمة عار كما هو الحال مع الكواشف السابقة. وتقدم الأضداد إضافية الأمثل في صميم علم الأمراض nPOD في الجدول رقم 2 كمصدر مرجعي واستخدمت لmultilabeling المقايسات المناعي للمتحد البؤر المجهري.
الشكل 1. داكو شبكة تلطيخ. هذا تخطيطي يصور تحليل روتيني من البنكرياس المانحة nPOD يقوم على autostainer داكو. وتصنف الدول المانحة nPOD مع رقم الهوية المكون من 4 أرقام. وتظهر الشريحة اثنين من الصواني مع الشرائح التي نظمتها وصمة عار. ومن المتوقع أن تكوينات الشريحة بديلة اعتمادا على عدد من الشرائح المانحة. وتشمل الضوابط الإيجابية إدراج المانحة إيجابية معروفة للبقع 2 المزدوجة والطحال من الجهات المانحة لكي 67 و CD3. ضوابط السلبية هي ذات شقين وتشمل اثنين سليقصر من إحدى الجهات المانحة كتلة البنكرياس حضنت مع الغلوبولين المناعي (IG) من الأنواع المضيفة من الأجسام المضادة الأولية والشرائح اثنين من الطحال المانحة لالانسولين والجلوكاجون.
الشكل 2. ويرد ممثل الشريحة الملون المزدوج. شريحة النهائي نموذجي مع معلمات إنشاء العلامات الشريحة ووضع الأنسجة قبل تنفيذ المسح الضوئي الرقمي.
الشكل 3. وكان ممثل H & E والبقع IHC في الفروع البنكرياس. مقاطع من البنكرياس من متبرع البالغات (6096-04 PanHead) الملون وفحص بالاشعة الرقمية يؤديها كما هو موضح في البروتوكول. وقد تم الحصول على الصور باستخدام برنامج ImageScope عرض من الجزء كامل (AD) و من جزيرة (EH). شدة جزيرة المتوقع وصمة عار للأنسولين، الجلوكاجون، والبنكرياس وببتيدولاحظ لأقسام دينار بحريني كما فيصور الفرع دال أن هذه الكتلة رئيس البنكرياس يحتوي على جزء صغير من منطقة الكلابي أو بطني الفص البنكرياس كما تحتوي على جميع الجزر أساسا البنكرياس ببتيد إيجابية الخلايا. نلاحظ أن ملون مباين هيماتوكسيلين في D لوحة فاتح للغاية في حين أن الهيماتوكسيلين ملون مباين في شدة وباء وجيم هي الأمثل. لوحات EH تظهر جزيرة من الفص الظهرية مع التوزيع المتوقع من الخلايا والخلايا β α. يتم العثور على خلايا البنكرياس قليل ببتيد في الجزء السفلي الأيسر من جزيرة (H). A، E-H والتقييم؛ (ب)، F-Ki67 + الأنسولين، C، G-CD3 + الجلوكاجون، D، H-ببتيد البنكرياس. م، 0.2x، EH-12.8x.
توحيد الإجراءات IHC أمر حاسم بالنسبة لتحليل الصور، وخاصة عندما تستخدم الكمبيوتر المستندة إلى خوارزميات عبر عدد كبير من الشرائح مع مرور الوقت. والإجراء تلطيخ IHC المبينة في هذا التقرير تسمح تحليل مجموعة من العينات للمانحين نظرا لاستخدام autostainer ضمن يوم العمل 8 ساعات ويتم...
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
المؤلفان بالشكر عائلات المانحين والمنظمات الحصول على الأعضاء المشاركين في هذا البحث ومونتغومري إيميلي، Pietras روبرت، فو آن، أغاروال ميتالى، وأغاروال روشان للحصول على مساعدة الخبراء التابعة لها. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة أبحاث السكري الأحداث (MC-T.) لدعم الشبكة للمتبرعين بالأعضاء البنكرياس مع مرض السكري.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
30٪ بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) | FisherScientific | H325-500 | البيروكسيديز الذاتية حظر |
ABC-فسفاتاز قلوية (ا ف ب) | ناقلات | AK-5000 | ا ف ب المتقارن |
الأجسام المضادة مخفف | إينفيتروجن | 003218 | الأجسام المضادة الأولية |
أفيدين مانع | ناقلات | SP-2001 | منع البيوتين الذاتية |
المعقدة البيروكسيديز عنزة المضادة للخنزير غينيا | ناقلات | BA-7000 | الجسم المضاد الثانوي |
الصبغة الزرقاء الكاشف | FisherScientific | 7301 | لايكا autostaineص |
العازلة سيترات، 6.0 درجة الحموضة | BioGenex | HK086-9K | مستضد استرجاع |
مروق 1 | FisherScientific | 7401 | لايكا autostainer |
Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | ساترة mountant |
DAB | ناقلات | SK-4100 | HRP مولد اللون |
ديب | DAKO | S2003 | AP الذاتية حجب الكاشف |
يوزين Y الكحولية | FisherScientific | 71204 | لايكا autostainer |
Ethanols-100٪، 95٪، 90٪، 70٪ | FisherScientific | مختلف | Deparaffinization وcoverslipping |
هيماتوكسيلين | DAKO | S3301 | داكو autostainer |
هيماتوكسيلين 7211 | FisherScientific | 7211 | لايكا autostainer |
مفتش (جميع الأنواع المضيفة عن الأجسام المضادة الأولية) | مختلف | مختلف | سلبي ضوابط الانتخابات التمهيدية |
السائل الأحمر الدائم (LPR) | DAKO | K0640 | ا ف ب مولد اللون |
Mach2 AP | بيوكير الطبية | MALP521L | الماعز المضادة للماوس AP المتقارن |
Mach2 HRP | بيوكير الطبية | MHRP520L | الماعز المضادة للماوس HRP المتقارن |
Mach2 HRP | بيوكير الطبية | RHRP520L | الماعز المضادة للماوس HRP المتقارن |
الميثانول | FisherScientific | مختلف | H 2 O 2 مخفف |
طبيعي الماعز المصل | ناقلات | S-1000 | IHC حجب الكاشف |
قناص | بيوكير الطبية | BS966M | IHC حجب الكاشف |
TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC العازلة |
Triology 20X | خلية مارك | 920P-06 | مستضد استرجاع |
الزيلين | FisherScientific | مختلف | Deparaffinization وcoverslipping |
الجدول رقم 1. الكواشف محددة.
الأضداد الابتدائي | مضيف الأنواع | بائع | القط. # | تعليقات واسترجاع مستضد |
البارافين | ||||
الأميليز | فأر | سانتا كروز | SC-46657 | سترات ليمونات |
أميلين | فأر | Serotec | MCA11267 | سترات ليمونات |
الأنهيداز الكربونية 19،9 | فأر | Abcam | ab15146 | |
كاسباس-3، المشقوق | أرنب | خلية اشارة | 9961 | سيترات أو ثلاثية |
CD20 | فأر | DAKO | M0755 | سيترات أو ثلاثية |
CD3 | أرنب | DAKO | A0452 | سترات ليمونات |
CD34 | فأر | خلية اشارة | 3569 | سترات ليمونات |
CD4 | فأر | DAKO | M7310 | سترات ليمونات |
CD45 | فأر | DAKO | M0754 | سترات ليمونات |
CD68 | فأر | DAKO | M0876 | سترات ليمونات |
CD8 | فأر | DAKO | M7103 | سترات ليمونات |
كروموغرانين A | أرنب | DAKO | A0430 | سترات ليمونات |
CK17 | فأر | DAKO | M7046 | سترات ليمونات |
CK19 | فأر | DAKO | M0772 | سترات ليمونات |
CK7 | فأر | DAKO | M7018 | سترات ليمونات |
C-الببتيد | أرنب | خلية اشارة | 4593 | سترات ليمونات |
Foxp3 | فأر | العلوم البيولوجية ه | 14-4776-80 | سترات ليمونات |
جريلين | ماعز | سانتا كروز | SC-10386 | |
جريلين | أرنب | Abcam | ab85104 | |
الجلوكاجون | أرنب | DAKO | A0565 | |
الجلوكاجون | فأر | Abcam | ab10988 | سترات ليمونات |
الجلوكاجون | حقل التجارب | Bachem | T-5037 | سترات ليمونات |
تخمة-1 | فأر | Abcam | ab40084 | ثلاثية |
تخمة-2 | أرنب | سانتا كروز | SC-9117 | ليس المعبر عنها في الجزر الإنسان |
الانسولين | حقل التجارب | DAKO | A0564 | |
كي-67 | فأر | DAKO | M7240 | سترات ليمونات |
مافا | أرنب | نوفوس البيولوجي | NB400-137A | ثلاثية |
ببتيد البنكرياس | أرنب | إينفيتروجن | 18-0043 | سترات ليمونات |
PDX-1 | حقل التجارب | Abcam | ab47308 | سيترات أو ثلاثية |
طليعة الأنسولين | فأر | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
طليعة الأنسولين | فأر | الدراسات التنموية ورم هجين البنك | GS-9A8 | سترات ليمونات |
Secretagogin | أرنب | سيغما | HPA 006641 | سترات ليمونات |
العضلات الملساء الأكتين | أرنب | Abcam | ab5694 | |
السوماتوستاتين | أرنب | DAKO | A0566 | |
Synaptophysin | فأر | DAKO | M0776 | سترات ليمونات |
المثلج | مضيف الأنواع | بائع | القط. # | تعليقات |
CD11b | فأر | Abcam | ab6332 | إصلاح مع PF 4٪ |
CD11c | أرنب | Serotec | AHP1226 | |
CD25 | فأر | نوفوس البيولوجي | ملاحظة: 600-564 | استخدم حضانة بين عشية وضحاها لأقسام البارافين |
CD94 | فأر | Abcam | ab61874 | إصلاح مع الأسيتون |
GAD65 | فأر | سانتا كروز | SC-130569 | إصلاح مع PF 4٪ |
HLA-ABC | فأر | DAKO | M0736 | إصلاح مع الأسيتون أو PF 4٪ |
الجدول 2. الأجسام المضادة الأولية.
اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
Aperio Scanscope CS | Aperio | الشريحة الرقمية الماسحة الضوئية | |
DAKO Autostainer زائد | DAKO | البقع IHC | |
برنامج تسمية مصفوفة الطباعة | BioCarta | LM7UP57 | الشريحة تسمية البرنامج |
لايكا XL Autostainer | لايكا | H & E البقع | |
علاوة ساترة | FisherScientific | 12-548-5J | ساترة |
طيف مدير المعلومات | Aperio | ماسحة البرمجيات | |
Superfrost زائد الشرائح | FisherScientific | 12-550-15 | موجبة الشرائح |
الخضروات باخرة | والأسود ديكر | مختلف | مستضد استرجاع |
حمار وحشي TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | الشريحة تسمية الطابعة |
الجدول رقم 3. لوازم ومعدات معينة.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved