İnsan Pankreas Adacıklar için boyama Protokoller

Özet

Bu video hematoksilen ve eosin (H & E) ve immunohistokimyasal (İHK) kullanarak insan pankreas adacık karakterizasyonu için prosedürleri göstermektedir. Baş, gövde ve kuyruk bölgelerinden Pankreas bölümleri adacık endokrin kompozisyon (insülin, glukagon ve pankreatik polipeptit), hücre çoğaltma (Ki67) ve inflamatuar infiltrasyon (H & E, CD3) belirlemek için H & E ve İHK her ikisi tarafından boyanmış. Unsinat bölge pankreatik polipeptid için İHK kullanarak yerelleştirilmiştir.

Özet

Adacık alanı ve numaraları ve yetişkin insan pankreas endokrin hücre kompozisyon tahminleri birkaç yüz bin 500 ile 1500 mg ^1-3 birkaç milyon ve beta kitle aralıkları değişir. Bu bilinen heterojenite ile, bir standart işleme ve boyama işlemi pankreas bölgelerinde açıkça tanımlanmış ve adacıklar titiz histopatoloji ve immunolocalization muayene kullanılarak karakterize edilmiştir böylece geliştirilmiştir.

Organ bağışında kurtarıldı insan pankreas işlenmesi için standart bir prosedür bu serinin ikinci bölümünde 1 de açıklanmıştır. Pankreas enine kesitler izledi 3 ana bölgede (baş, gövde, kuyruk) içine işlenir. Pankreas başından transversal kesitler daha ayrılır gibi büyüklüğüne göre belirtilen ve alt belirtmek için alfabetik sayılı. Bu standardizasyon oluşan adacıklar içerir unsinat bölgesi içeren kafa bölgesinde tam bir kesit analizi için olanakesas olarak kuyruğa bölgeye pankreatik polipeptid hücre.

Mevcut rapor, bu serinin parçası 2 oluşur ve adacık endokrin hücreleri, çoğaltma ve T-hücre infiltrasyonlar bir vurgu ile pankreas parafin kesitlerin seri kesit ve histopatolojik karakterizasyonu için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır. Pankreatik bölümlerinin her iki patolojinin ekzokrin, ductular, ve endokrin bileşenleri karakterize etmek için tasarlanmıştır. Ekzokrin bölmesi özellikle pankreas intraduktal neoplasia ⁴ varlığı ile ilişkili olarak, pankreatit varlığında (aktif veya kronik), atrofi, fibroz, ve yağ gibi kanalı sistemi için değerlendirilir. Adacıklar morfolojisi, boyutu ve yoğunluğu, endokrin hücreleri, inflamasyon, fibrozis, amiloid, ve H & E ve İHK lekeleri kullanarak çoğaltan veya apoptotik hücrelerin varlığı açısından değerlendirilmiştir.

2. bölümünde tarif edilen nihai komponent lekeli sürgünün temin edilmesidirsayısallaştırılmış Tüm slayt görüntüleri olarak s. Sayısallaştırılmış slaytlar sanal bir biobank oluştururken bir online patoloji veritabanında durumunda pankreas ve bölgeye göre düzenlenir. Bu online toplama Erişim henüz tip 1 diyabet araştırmaya katılan 200'den fazla klinisyen ve bilim adamlarına verilmektedir. Online veritabanı parafin veya dondurulmuş seri bölümleri için blok seçmek için hızlı ve eksiksiz veri paylaşımı ve araştırmacılar için bir yol sağlar.

Protokol

1. Boyanmamış Bölümler için Microtomy

1. Standart parafin microtomy için su banyosu ve mikrotom ayarlayın. Vaka sayısı, pankreas bölgesi (örnek) ve slayt numarası ile pozitif yüklü slaytlar ve ön etiketi kullanın. Sol tarafta kaset etiketi ile mikrotom ayna yerleştirin parafin blok.
2. Doku eşit rastlayana kadar blok içine Normal microtomy prosedürleri, bölüm izleyin. Seri bölümler (4 mikron kalınlığında, ilk gerekli lekeler sayısına bağlı olarak 3-6 (Olgu Teslim Formu, Ek 1'e bakınız)) bir şerit üretmek. Şerit ayrı bölümler, kalemle sayılı emri ile slaytlar üzerinde sırayla her pick up ve yer. Bir bölüm tam sırası bölümleri numaralandırma kullanılmayan olup olmadığını gösterelim. Sola yönelik slayt etiketi ile kaset bulunan gibi slaytta aynı yönde koruyun. Gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya sonra araştırmacılara boyama veya dağıtımı ile devam edin.
3. Resoda sıcaklığında veya -20 ° C'de doku ve arşiv korumak için parafin ince bir tabaka ile parafin blok eal yüzey
4. Sonraki microtomy için, yukarıdaki gibi her seviyede seri bölümler için numaralandırma korumak. 1 ek slayt edinin ve her blok içinde her ~ 100 uM düzeyi için H & E slayt tarafından leke.

2. H & E Boyama

1. Autostainer ilk tepside sonra slayt rafa her bloğunun ilk seri kesitler slayt yerleştirin.
2. Standart H & E boyama programı seçin ve her zamanki gibi devam edin.
3. Boyama bittiğinde coverslipping için kaputu Autostainer ve yerden slaytları çıkarın.
4. Standart tekniğini kullanarak Coverslip. Basılı bir etiket (bölüm 12) ile iyice ve etiket kurulayın.

3. IHC Set-up

1. Çift lekeleri ve slaytların giriş numaraları için Dako programı seçin. TBST ve sitrat tampon, antikorlar, ve diğer Reag hazırlamakbelirtilen hacimleri (Tablo 1) 'e göre Ent. Reaktif tepsisi ve slaytlar yükleyin. Temiz ve atık hatları Dönme üretici tavsiyelerine göre programlanır.
2. Elle bu testlerin yapılması halinde, tahmini hacimleri hazırlamak. Herhangi bir adım dışarı kurutma slaytlar önlemek için nemlendirilmiş bir odasında slaytlar inkübe edin. Autostainer için kullanıldığında her reaktifler için aynı işlemi uygulayın.

4. IHC Deparaffinization ve Antigen Alma

1. 5 dakika ksilen slaytlar koyun. Kez tekrarlayın. Bu aşırı arka plan ve zayıf boyanma neden olacak gibi gösterene kadar slaytlar sonraki herhangi bir noktada kurumasına izin vermeyin.
2. 2 dakika süreyle% 100 etanol slaytlar aktarın. Kez tekrarlayın.
3. 10 dakika boyunca metanol içinde taze hazırlanmış% 3 H ₂ O ₂ slaytların koydu.
4. % 90 Etanol ve sonra Dip slaytlar 3 dakika boyunca% 90 Etanol yerleştirmek.
5. Transfer slaytlar1 dakika boyunca% 70 Etanol.
6. De-iyonize su kaydırağı durulayın.
7. Onceden vapur ve 5 dakika buharlı sitrat tamponu.
8. 30 dakika buharlı ve buhar tampon sitrat için slayt ekleyin.
9. Derhal su kaydırağı aktarmak ve oda sıcaklığında (~ 20 dakika) için serin çıkana kadar basılı tutun.
10. Dizisi (Şekil 1) leke göre Dako Autostainer raflara slaytlar aktarın ve ikili boyama programı çalıştırın. Autostainer programın temel aşamalar elle çalıştırılır çoğaltmak böylece listelenmiştir.

5.. İlk Primer Antikorlar (Ki-67, CD3, Pankreatik Polipeptid)

1. 15 dakika boyunca Sniper çözeltisi ile slaytlar bloke eder. TBST ile iki kez yıkayın.
2. 30 dakika için primer antikor slaytlar inkübe. TBST ile iki kez yıkayın.
3. 30 m için Mach2 keçi anti-fare (Ki-67) ya da anti-tavşan (CD3, pankreatik polipeptid) turbu peroksidaz (HRP) polimer ile inkübeinutes. TBST ile iki kez yıkayın.
4. 4 dakika slaytların 3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB) uygulayın. Su ile iki kez yıkayın.
5. Pankreatik polipeptid ile inkübe Slaytlar eşzamanlı olarak tahlil edilen Dako üzerinde tutulur ve geriye kalan slaytlar Primer antikor ikinci küme ile inkübe edilir ise tüm sonraki adım için kullanılan TBST. Alternatif olarak, manuel deneyleri için, bölüm 6 geçin.

6. İkinci Primer Antikorlar (İnsülin, Glukagon)

1. 20 dakika Deeb slaytlar inkübe edin. TBST ile iki kez yıkayın.
2. 20 dakika TBST (insülin) veya TBST içinde Sniper (glukagon)% 20 avidin engelleyici% 10 normal keçi serumu ile Blok. TBST ile iki kez yıkayın.
3. 15 dakika için insülin veya glukagon Primer antikor ile inkübe edilir. TBST ile iki kez yıkayın.
4. İnsülin: 30 dakika 1:300 titrede biotinlenmiş goat anti-kobay olarak inkübe slaytlar. TBST ile iki kez yıkayın. Standart ve ile inkübe30 dakika boyunca ctor ABC-AP reaktifi. TBST ile iki kez yıkayın.
5. Glukagon: 30 dakika boyunca keçi anti-fare alkalin fosfataz (AP) polimer takiben 30 dakika süreyle inkübe sırasında tampon içinde kayar. TBST ile iki kez yıkayın.
6. Slaytlar konjugatları inkübe edilir ise, oda sıcaklığına kadar ısınmaya LPR tamponu. Dako reaktif rafa kullanımı ve yer öncesi acil 3 mL tampon başına sıvı kalıcı kırmızı 1 damla (LPR) ekleyin. 4 dakika LPC slaytlar inkübe edin. Su ile iki kez yıkayın.
7. 1 dakika hematoksilen slaytlar inkübe edin. Su ile iki kere durulanır.
8. 1 dakika TBS pH 7.6 slaytlar inkübe edin. Su ile iki kere durulanır.
9. DAKO Autostainer slaytları Unload.
10. Hemen pankreatik polipeptid için boyandı slaytları kurutmak. Tüm çift boyalı kesitler için, en az 1 saat süreyle kuru sonra kurutmak.

7. Kurutma

1. Yeri 1 dakika boyunca% 80 etanol içinde kayar.
2. % 95 etanol içinde slaytlar eğimlidir.
3. 30 saniye boyunca% 95 etanol slaytlar tutun.
4. % 100 etanol slaytlar aktarın ve 1 dakika tutun. Tekrarlayın.
5. Ksilen Dip slaytlar.
6. 1 dakika ksilen slaytlar tutun. Tekrarlayın.
7. Hemen cytoseal kullanarak slaytlara lamelleri monte edin.

8. Slayt Etiketleme

1. Organ ve blok numarası, leke ve tarih ve yazdırma dahil durumda tanımlama bilgilerini girin. Seri numarası bölümüne her bloğun ilk slayt lekeler için isteğe bağlıdır. Sonraki seviyeleri numaralandırma ile gösterilir.
2. Slaytlarda etiketler yerleştirin.

9. Slayt Tarama

1. Tarayıcı tepsiye lekeli slaytlar yerleştirin ve enstrümantasyon göre tarayın.
2. Donör ve doku tipi (pankreas baş, gövde, kuyruk, dalak) tarafından slaytlar düzenleyin.
3. -20 ° C'de, oda sıcaklığında ve kalan boyanmamış slaytlar azından Arşiv boyalı kesitler kullanılmıştır kadar.

10. Hukntative Sonuçlar

Bu boyama işlemleri parafin ve taze donmuş blok temel karakterizasyonu sağlamak için Diyabet (nPOD) ile Pankreas Organ bağış için JDRF Ağı için geliştirilmiştir. Her verici bir temel karakterizasyon sahip 2 adet pankreas bölgeden blokları (baş, gövde ve kuyruk) ve dalak (Şekil 1, ayrıca vaka başvuru formu, Ek 1), leke oluşur yapıldı. H & E boyama boyunca kullanılan klinik dereceli çözümleri ile klinik bir tesis için de programlanmış bir Autostainer kullanılarak yapılır. Ek bağış bloklar kesitli olduğundan, her doku morfolojisini göstermek için H & E için alınan bir slayt vardır. Bloklar tekrar kesitli olduğunda, araştırmacılar dağıtım gibi, derin düzeyleri de hem de her düzeyde seri kesitler numaralandırma olarak tüm bloğun doku morfolojisi belgelemek temsilcisi H & E slaytlar için alınan slaytlar olacaktır. Vitray slaytlar etiketlidurumda, tanımlama, pankreas bölge, blok numarası, leke ve tarih (Şekil 2) ve çevrimiçi patoloji bilgi yönetim sistemi taranır. Bir kontrol donörden temsili görüntü Bu prosedür izlenerek beklenen sonuçlar göstermek için düşük ve yüksek büyütmelerde hem de Şekil 3 'de gösterilmiştir. Tahlil elle yapıldı ve hematoksilen counterstain azaltılmış lekelenme yoğunluğunu göstermektedir ile pankreatik polipeptid (D, H) ile slayt lekeli farklı bir günde ölçüldü. Primer antikor yoğunluğu boyama farklılıklar veya testler arasında counterstain özellikle bireysel renk düzeltme aynı hücre alanları veya sayıları elde etmek için gerekli olan görüntü analizi kullanılarak aksi slaytlar halinde kaçınılmalıdır.

Her laboratuvar sürü-için-pek çok varyasyon ve diğer reaktifler ve koşulları boyanma yoğunluğu ve özgüllük etkileyebilir olarak antikor konsantrasyonları optimize bekleyebilirsiniz. Yeni rea edinimi ilebeyler, boyama işlemleri eski reaktifleri gibi leke yoğunluğu aynı derecede ulaşmak için bilinen pozitif ve negatif kontrol örnekleri ile doğrulanır. NPOD patolojisi optimize çekirdekte Ek antikorlar bir referans kaynağı olarak Tablo 2'de verilmektedir ve konfokal mikroskopi için imünoflüoresan deneylerinde multilabeling için kullanılmıştır.

Şekil 1.. Dako boyama ızgara. Bu şematik bir Dako Autostainer üzerinde yapılan bir nPOD Donör pankreasın bir rutin analizler gösteriyor. NPOD donörler 4 haneli bir kimlik numarası ile kodlanır. İki slayt tepsiler leke tarafından düzenlenen slaytlar gösterilir. Alternatif slayt yapılandırmaları donör slaytların numaraları bağlı olarak beklenmektedir. Pozitif kontroller iki çift lekeleri ve Ki-67 ve CD3 için donör dalak için bilinen bir pozitif verici dahil edilmesi yer alıyor. Negatif kontroller iki yönlüdür ve iki SLI dahildes insülin ve glukagon için donör dalak primer antikorlar ve iki slaytların ana türlerden immünglobulin (Ig) ile inkübe bir donör pankreas blok.

Şekil 2. Dijital tarama yapılmadan önce Temsilcisi çift lekeli slayt. Tipik bitmiş slayt slayt etiketleme parametreleri ve doku yerleştirme ile gösterilir.

Şekil 3. Temsilcisi H & E ve pankreas bölümlerde IHC lekeler. Yetişkin bir dişi organ donör (6096-04 PanHead) ve pankreas Kesitler ve gibi, protokolü açıklanan yapılan dijital taramaları idi. Görüntüler tüm bölümü (AD) ve bir adacık (EH) den ImageScope görüntüleme programı kullanılarak elde edilmiştir. Insülin, glukagon, ve pankreatik polipeptid için tahmin adacık leke yoğunlukları olanBu pankreas kafa bloğu bütün adacıkları esas pankreatik polipeptit-pozitif hücreler içeren olarak unsinat bölge veya ventral pankreas lob küçük bir kısmını içerdiğini D bölümü çizer gibi bölümler BD gözlenmiştir. Hematoksilen B ve C şiddetlerde optimal counterstain iken paneli D hematoksilen counterstain çok açık olduğunu unutmayın. EH paneller β-hücreleri ve α-hücrelerinin beklenen dağılımına sahip dorsal lob bir adacık göstermektedir. Birkaç pankreatik polipeptid hücreleri adacık (H) sol alt kısmı bulunmaktadır. A, E-H izleme ve değerlendirme; B, F-Ki67 + İnsülin, C, G-CD3 + Glukagon D, H-Pankreatik polipeptid. AD, 0.2x, EH-12.8x.

Tartışmalar

Zamanla slaytlar sayıda genelinde bilgisayar tabanlı algoritmaları kullanarak özellikle IHC prosedürlerin standartlaştırılması, görüntü analizi için önemlidir. Bu raporda açıklanan İHK boyama işlemi 8 saatlik bir iş günü içinde bir Autostainer kullanarak belirli bir donörün numunelerin toplu analizi sağlayacak ve bir önceki raporda ⁵ değiştirilir. Her lekeli slayt Sayısallaştırılmış Tüm slayt görüntüleri web tabanlı online patoloji sistemi üzerinden nPOD-bağlı müfett...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 30'luk hidrojen peroksit (H2O 2)	FisherScientific	H325-500	Endojen peroksidaz engelleme
ABC-Alkalen Fosfataz (AP)	Vektör	AK-5000	AP konjugat
Antikor Dilüent	Invitrogen	003218	Primer antikor
Avidin bloker	Vektör	SP-2001	Endojen biotin Blok
Tinile Keçi anti-kobay	Vektör	BA-7000	Sekonder antikor
Reaktif mavileştirme	FisherScientific	7301	Leica autostainer
Sitrat tampon, pH 6.0	BioGenex	HK086-9K	Antijen alma
Clarifier 1	FisherScientific	7401	Leica Autostainer
Cytoseal XYL	FisherScientific	8312-4	Coverslip mountant
DAB	Vektör	SK-4100	HRP kromojen
Deeb	DAKO	S2003	Endojen AP reaktif engelleme
Alkollü Eosin Y	FisherScientific	71204	Leica Autostainer
Ethanols-100,% 95,% 90,% 70%	FisherScientific	Çeşitli	Deparaffinization ve coverslipping
Hematoksilen	DAKO	S3301	Dako Autostainer
Hematoksilen 7211	FisherScientific	7211	Leica Autostainer
IgG (primer antikorlar için tüm ana tür)	Çeşitli	Çeşitli	Primerleri için negatif kontroller
Sıvı Daimi Kırmızı (LPR)	DAKO	K0640	AP kromojen
Mach2 AP	Biocare Tıp	MALP521L	Keçi anti-fare AP konjugat
Mach2 HRP	Biocare Tıp	MHRP520L	Keçi anti-Fare HRP konjugatı
Mach2 HRP	Biocare Tıp	RHRP520L	Keçi anti-Fare HRP konjugatı
Metanol	FisherScientific	Çeşitli	H 2 O 2 seyreltici
Normal keçi serumu	Vektör	S-1000	IHC engelleme reaktif
Keskin Nişancı	Biocare Tıp	BS966M	IHC engelleme reaktif
TBST 20X	ThermoScientific	TA-999-TT	IHC tampon
Triology 20x	Hücre Marque	920P-06	Antijen Alma
Ksilen	FisherScientific	Çeşitli	Deparaffinization ve coverslipping

Primer antikor	Ana türler	Satıcı	Cat. #	Yorum ve Antigen Alma
Parafin
Amilaz	Fare	Santa Cruz	SC-46657	Sitrat
Amilin	Fare	Serotec	MCA11267	Sitrat
Karbonik anhidraz 19.9	Fare	Abcam	ab15146
Kaspaz-3, parçalanabilen	Tavşan	Hücre Sinyali	9961	Sitrat veya Trilogy
CD20	Fare	DAKO	M0755	Sitrat veya Trilogy
CD3	Tavşan	DAKO	A0452	Sitrat
CD34	Fare	Hücre Sinyali	3569	Sitrat
CD4	Fare	DAKO	M7310	Sitrat
CD45	Fare	DAKO	M0754	Sitrat
CD68	Fare	DAKO	M0876	Sitrat
CD8	Fare	DAKO	M7103	Sitrat
Bir kromogranin	Tavşan	DAKO	A0430	Sitrat
CK17	Fare	DAKO	M7046	Sitrat
CK19	Fare	DAKO	M0772	Sitrat
CK7	Fare	DAKO	M7018	Sitrat
C-peptid	Tavşan	Hücre Sinyali	4593	Sitrat
Foxp3	Sıçan	e Bioscience	14-4776-80	Sitrat
Ghrelin	Keçi	Santa Cruz	SC-10386
Ghrelin	Tavşan	Abcam	ab85104
Glukagon	Tavşan	DAKO	A0565
Glukagon	Fare	Abcam	ab10988	Sitrat
Glukagon	Guinea Pig	Bachem	T-5037	Sitrat
Glut-1	Fare	Abcam	ab40084	Trilogy
Glut-2	Tavşan	Santa Cruz	SC-9117	Insan adacıklar olarak ifade değil
Ensülin	Guinea Pig	DAKO	A0564
Ki-67	Fare	DAKO	M7240	Sitrat
Mafa	Tavşan	Novus Biyolojik	NB400-137A	Trilogy
Pankreatik polipeptid	Tavşan	Invitrogen	18-0043	Sitrat
Pdx-1	Guinea Pig	Abcam	ab47308	Sitrat veya Trilogy
Proinsülin	Fare	Novocastra	NCL-proin-1G4
Proinsülin	Fare	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	GS-9A8	Sitrat
Secretagogin	Tavşan	Sigma	HPA 006.641	Sitrat
Düz kas aktini	Tavşan	Abcam	ab5694
Somatostatin	Tavşan	DAKO	A0566
Sinaptofizin	Fare	DAKO	M0776	Sitrat
Dondurulmuş Taze	Ana türler	Satıcı	Cat. #	Yorumlar
CD11b	Sıçan	Abcam	ab6332	% 4 PF ile Fix
CD11c	Tavşan	Serotec	AHP1226
CD25	Fare	Novus Biyolojik	NB 600-564	Parafin bölümler için gece inkübasyon kullanın
CD94	Fare	Abcam	ab61874	Aseton ile Fix
GAD65	Fare	Santa Cruz	SC-130569	% 4 PF ile Fix
HLA-ABC	Fare	DAKO	M0736	Aseton veya% 4 PF ile Fix

Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aperio Scanscope CS	Aperio		Dijital slayt tarayıcı
DAKO Autostainer Plus	DAKO		IHC lekeleri
Etiket Matrix yazdırma yazılımı	BioCarta	LM7UP57	Slayt etiket yazılımı
Leica XL Autostainer	Leica		H & E lekeleri
Premium Coverglass	FisherScientific	12-548-5J	Coverslip
Spektrum Bilgi Yöneticisi	Aperio		Tarayıcı yazılımı
SuperFrost Plus slaytlar	FisherScientific	12-550-15	Pozitif yüklü slaytlar
Sebze vapur	Black & Decker	Çeşitli	Antijen alma
Zebra TLP 3742	CDWG	TLP3742	Slayt etiket yazıcısı