Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung von humanen Langerhans-Inseln mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Immunhistochemie (IHC). Pankreas-Abschnitten von Kopf, Körper und Schwanz Regionen werden sowohl von H & E und IHC gefärbt, um Inselzellen endokrinen Zusammensetzung (Insulin, Glukagon und pankreatische Polypeptid), Zell-Replikation (Ki67) und entzündlichen Infiltraten (H & E, CD3) zu bestimmen. Die uncinatus Region lokalisiert ist mit IHC für pankreatische Polypeptid.

Zusammenfassung

Die Schätzungen der Insel Bereich und Zahlen und endokrine Zelle Zusammensetzung im erwachsenen menschlichen Bauchspeicheldrüse variieren von mehreren hunderttausend bis zu mehreren Millionen und Beta Masse reicht von 500 bis 1500 mg ^1-3. Mit dieser bekannten Heterogenität wurde ein Standard-Verarbeitung und Färbeverfahren entwickelt, so dass der Bauchspeicheldrüse Regionen klar definiert waren und Inselchen gekennzeichnet mit rigorosen Histopathologie und Immunolokalisation Untersuchungen.

Standardisierte Verfahren für die Verarbeitung von menschlichen Bauchspeicheldrüse von Organspendern gewonnen werden, in Teil 1 dieser Serie beschrieben. Die Bauchspeicheldrüse ist in 3 Regionen (Kopf, Körper, Schwanz) von Querschnitten gefolgt verarbeitet. Querschnitte aus der Bauchspeicheldrüse Kopf weiter unterteilt sind, wie angegeben basierend auf Größe, alphabetisch und nummeriert, um Unterabschnitte bezeichnen. Diese Standardisierung ermöglicht einen kompletten Querschnitt Analyse der Kopfbereich einschließlich der uncinatus Region, die Inselchen enthältin erster Linie aus Pankreas-Polypeptid Zellen Schwanzbereich.

Der vorliegende Bericht umfasst Teil 2 dieser Serie und beschreibt die Verfahren für die serielle Schnitt-und histopathologischen Charakterisierung der Bauchspeicheldrüse Paraffinschnitten mit einem Schwerpunkt auf Inselchen endokrinen Zellen, Replikation und T-Zell-Infiltrate verwendet. Pathologie des Pankreas Sektionen soll sowohl exokrinen, ductularen und endokrinen Komponenten zu charakterisieren. Das exokrine Kammer wird auf das Vorhandensein von Pankreatitis (aktiv oder chronisch), Atrophie, Fibrose und Fett sowie der Leitung ausgewertet, insbesondere in Beziehung auf das Vorhandensein von Pankreas intraduktalen Neoplasie ^4. Inseln sind für Morphologie, Größe und Dichte, endokrine Zellen, Entzündung, Fibrose, Amyloid, und die Anwesenheit von replizierenden oder apoptotischen Zellen mit H & E und IHC Flecken ausgewertet.

Die letzte Komponente in Teil 2 beschrieben ist die Bereitstellung der gefärbten Objektträgers als digitalisierte Bilder gesamte Folie. Die digitalisierten Dias werden von Fall und Bauchspeicheldrüse Region in einer Online-Datenbank Pathologie Erstellung eines virtuellen Biobank organisiert. Der Zugang zu dieser Online-Sammlung ist derzeit auf über 200 Kliniker und Wissenschaftler beim Typ 1 Diabetes Forschung beteiligt sind. Die Online-Datenbank stellt ein Mittel für eine rasche und vollständige gemeinsame Nutzung von Daten und für die Ermittler, um Blöcke für Paraffin oder gefrorenen Schnittserien wählen.

Protokoll

1. Mikrotomie für ungefärbte Schnitte

1. Richten Sie Wasserbad und Mikrotom für Standard-Paraffin Mikrotomie. Verwenden Sie positiv geladene Objektträger und Pre-Etikett mit der Nummer, des Pankreas Region (Probe) und Foliennummer. Ort Paraffinblock im Mikrotom Spannfutter mit der Kassette Etikett auf der linken Seite.
2. Folgen Sie den normalen Mikrotomie Verfahren, Abschnitt in den Block, bis Gewebe einheitlich auftritt. Produzieren Sie ein Band von Serienschnitten (4 um dick, 3-6 je nach Anzahl der erforderlichen anfänglichen Flecken (Vgl. Urteil Kontaktformular, Anhang 1)). Separate Abschnitte in der Band, nehmen Sie jeweils in Ordnung, und auf Objektträger mit um mit Bleistift nummeriert. Bezeichnen, wenn ein Abschnitt ungenutzt durch Nummerierung Abschnitte in genau dieser Reihenfolge. Pflegen Sie die gleiche Orientierung auf der Folie, wie in der Kassette mit dem Schlitten Label orientiert sich an der linken Seite gefunden. Trocknen über Nacht bei Raumtemperatur dann mit färbenden oder Verteilung der Ermittler gehen.
3. Res.EAL Oberfläche des Paraffin-Block mit dünnen Schicht aus Paraffin, um Gewebe-und Archiv bei Raumtemperatur oder bei -20 ° C zu erhalten
4. Für die anschließende Mikrotomie, pflegen Nummerierung für serielle werden auf jeder Ebene wie oben. Besorgen Sie ein zusätzliches Dia-und färben von H & E-Rutsche für jeden ~ 100 pM Ebene in jedem Block.

2. H & E Färbung

1. Platzieren Sie die erste serielle geschnittene Folie aus jedem Block in einer Objektträgergestell dann in dem ersten Fach auf der automatischen Färbevorrichtung.
2. Wählen Sie den Standard H & E Färbung Programm und wie gewohnt fortfahren.
3. Wenn Sie fertig Färbung, entfernen Sie die Folien aus Autostainer und Ort in der Kapuze für Eindecken.
4. Deckglas mit Standard-Technik. Gründlich abtrocknen und Etikett mit einem bedruckten Etikett (siehe Abschnitt 12).

3. IHC Set-up

1. Wählen Sie den Dako-Programm für Doppel-Flecken und Eingabe von Zahlen von Dias. Planen TBST und Citrat-Puffer, Antikörper und andere REAGEltern nach vorgegebenen Volumina (Tabelle 1). Laden Sie das Reagenzträgers und Dias. Die Drehung des sauberen und Entsorgungsleitungen werden nach den Empfehlungen des Herstellers programmiert.
2. Wenn die Durchführung dieser Tests manuell, bereiten geschätzten Volumina. Die Objektträger in einer befeuchteten Kammer zu Folien Trocknung bei jedem Schritt zu vermeiden. Folgen Sie dem gleichen Vorgang für jede Reagenzien als wenn für den Autostainer verwendet.

4. IHC Entparaffinierung und Antigen-Retrieval

1. Legen Sie Dias in Xylol für 5 Minuten. Wiederholen Sie einmal. Lassen Sie die Dias zum Austrocknen zu einem späteren Zeitpunkt, bis angezeigt, da dies zu einer übermäßigen Hintergrund und schlechte Färbung führt.
2. Die Objektträger bis 100% Ethanol für 2 Minuten. Wiederholen Sie einmal.
3. Legen Sie Folien in frisch zubereitete 3% H ₂ O ₂ in Methanol für 10 Minuten.
4. Dip Slides in 90% Ethanol und dann in 90% Ethanol Platz für 3 Minuten.
5. Die Objektträger zu70% Ethanol für 1 Minute.
6. Die Objektträger in entionisiertem Wasser.
7. Combidämpfer und Citratpuffer in Dampfer für 5 Minuten.
8. Hinzufügen von Folien auf Puffer, in dem Dampfer und Dampf für 30 Minuten Citrat.
9. Sofortüberweisung Dias zu Wasser und zu halten, bis gleitet auf Zimmertemperatur abkühlen lassen (~ 20 Minuten).
10. Die Objektträger mit den Dako Autostainer Racks nach Sequenz (Abbildung 1) und führen Sie den Fleck Doppelfärbung Programm. Die wichtigsten Schritte des automatischen Färbevorrichtung Programm so dass die manuelle läuft nachvollziehen können aufgeführt.

5. Erste primäre Antikörper (Ki-67, CD3, Pankreaspolypeptid)

1. Blockieren Sie Dias mit Sniper-Lösung für 15 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
2. Die Objektträger in primärem Antikörper für 30 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
3. Inkubieren mit Mach2 Ziege anti-Maus (Ki-67) oder Anti-Kaninchen-(CD3-, Pankreas-Polypeptid) Meerrettichperoxidase (HRP)-Polymer für 30 minuten. Waschen zweimal mit TBST.
4. Bewerben 3,3-Diaminobenzidin (DAB) zu Folien für 4 Minuten. Zweimal mit Wasser waschen.
5. Folien mit Pankreas-Polypeptid inkubiert werden, wenn der Dako, die gleichzeitig getestet gehalten und für alle nachfolgenden Schritte verwendet TBST während die übrigen Dias mit dem zweiten Satz von primären Antikörpern inkubiert werden. Alternativ zur manuellen Tests, § 6 fortfahren.

6. Zweite primäre Antikörper (Insulin, Glukagon)

1. Die Objektträger in Deeb für 20 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
2. Block mit 10% normalem Ziegenserum in 20% Avidin-Blocker in TBST (Insulin) oder Sniper (Glucagon) in TBST für 20 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
3. Inkubation mit Insulin oder Glucagon primären Antikörper für 15 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
4. Insulin: inkubieren in biotinylierter Ziege-Anti-Meerschweinchen bei 1:300-Verdünnung für 30 Minuten. Waschen zweimal mit TBST. Inkubieren mit Standard-vector ABC-AP Reagenz für 30 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
5. Glucagon: inkubieren im Puffer während 30 Minuten, gefolgt von Ziegen Anti-Maus-alkalische Phosphatase (AP) Polymer für 30 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
6. Während die Folien in der Konjugate inkubiert werden, wärmen die LPR-Puffer auf Raumtemperatur. 1 Tropfen der Flüssigkeit permanent rot (LPR) pro 3 mL Puffer sofort vor dem Gebrauch und in Dako Reagenzhalter. Die Objektträger in LPC für 4 Minuten. Zweimal mit Wasser waschen.
7. Die Objektträger in Hämatoxylin für 1 Minute. Spülen Sie zweimal mit Wasser.
8. Die Objektträger in TBS pH 7,6 für 1 Minute. Spülen Sie zweimal mit Wasser.
9. Entladen von Folien aus Dako Autostainer.
10. Unmittelbar dehydrieren Folien für pankreatische Polypeptid gefärbt. Für alle doppelt gefärbten Schnitten, trocken für mindestens 1 Stunde dann dehydrieren.

7. Austrocknung

1. Die Objektträger in 80% igem Ethanol für 1 Minute.
2. Dip Slides in 95% Ethanol.
3. Halten Sie Folien in 95% Ethanol für 30 Sekunden.
4. Übertragen Dias zu 100% Ethanol und halten Sie 1 Minute. Wiederholen.
5. Dip Slides in Xylol.
6. Halten Sie Folien in Xylol für 1 Minute. Wiederholen.
7. Unmittelbar montieren Deckgläser auf Objektträger mit Cytoseal.

8. Slide Labeling

1. Geben Sie den Fall Identifikationsinformationen einschließlich Organ-und Blocknummer, Fleck, und das Datum und Print. Serielle Schnitt-Nummer ist für die erste Folie Flecken von jedem Block optional. Nachfolgenden Ebenen werden durch Nummerierung bezeichnet.
2. Legen Sie Etiketten auf Folien.

9. Slide-Scanning

1. Platzieren Sie gefärbten Schnitten in Scanner und scannen Tablett nach Instrumentierung.
2. Organisieren Sie Dias von Geber-und Gewebe-Typ (Pankreas Kopf, Körper, Schwanz, Milz).
3. Archiv gefärbten Objektträger bei Raumtemperatur und alle verbleibenden ungefärbten Objektträger bei -20 ° C bis zur Verwendung.

10. Representative Ergebnisse

Diese Färbung Verfahren wurden für die JDRF Netzwerk für Bauchspeicheldrüsenkrebs Organspendern mit Diabetes (nPOD) zum Ausgangswert Charakterisierung von Paraffin und frisch gefrorene Blöcke liefern entwickelt. Jeder Spender hat einen Ausgangswert Charakterisierung durchgeführt umfasste der Färbung 2 Blocks von jeder Region der Bauchspeicheldrüse (Kopf, Körper und Schwanz) und die Milz (Abbildung 1, siehe auch Fall Formular, Anhang 1). Die H & E Färbung wird unter Verwendung einer Autostainer als für eine klinische Einrichtung mit klinisch-Grade-Lösungen verwendet, während programmiert. Als zusätzliche Spender Blöcke geschnitten sind, hat jeder eine Folie für H & E getroffen werden, um Gewebe-Morphologie zeigen. Wenn Blöcke geschnitten sind sie wieder, als zur Ausschüttung an Forscher, werden tiefere Ebenen haben auch Folien für repräsentative H & E Dias unternommen, um den gesamten Block der Gewebemorphologie sowie Nummerierung Seriennummer werden auf jeder Ebene zu dokumentieren. Eindecken werden die Objektträger mit markiertenBei Identifizierung, Bauchspeicheldrüse Region, Blocknummer, Fleck und Datum (Abbildung 2) und gescannt in den Online-Pathologie Information-Management-System. Repräsentative Bilder von einem Kontrollraum Spender sind in Abbildung 3 bei niedrigen und hohen Vergrößerungen gezeigt, dass die erwarteten Ergebnisse nach diesem Verfahren zeigen. Der Schlitten gebeizt mit Pankreas-Polypeptid (D, H) wurde an einem anderen Tag getestet mit dem Assay manuell durchgeführt und zeigt, reduziert Färbeintensität des Hämatoxylin Gegenfärbung. Unterschiede in der Färbeintensität der primäre Antikörper oder Gegenfärbung zwischen Assays ist die Insbesondere, wenn mittels Bildanalyse sonst gleitet mit individuellen Farbkorrektur zu der gleichen Zelle oder zählt Bereichen zu erreichen müssen vermieden werden.

Jedes Labor sollte erwarten, dass Antikörper-Konzentrationen als viel-zu-viel Variation und andere Reagenzien und Bedingungen können Färbeintensität und Spezifität Wirkung zu optimieren. Mit Erwerb der neuen REAHerren, sind Färbeverfahren mit bekannten positiven und negativen Kontrollproben, den gleichen Grad der Färbeintensität als mit dem ehemaligen Reagenzien zu erreichen validiert. Weitere Antikörper in der Pathologie nPOD Kern optimiert sind in Tabelle 2 als Referenz bereitgestellt und sind für multilabeling Immunfluoreszenz für konfokale Mikroskopie verwendet.

Abbildung 1. Dako Färbung Gitter. Dieses Schema zeigt eine Routine-Analyse von einem Spender nPOD Bauchspeicheldrüse auf einem Dako Autostainer durchgeführt. Die nPOD Spender werden mit einem 4-stelligen Identifikationsnummer codiert. Zwei-Magazine sind mit Dias von Fleck organisiert dargestellt. Alternate Dia-Konfigurationen werden voraussichtlich je nach Zahl der Spender Dias. Positive Kontrollen umfassen die Aufnahme eines bekannten positiven Spender für die beiden Doppel-Flecken und Milz Spender für Ki-67 und CD3. Negative Kontrollen sind zweifach und beinhalten zwei SLIdes von einem Spender Pankreas-Block mit Immunglobulin (Ig) aus den Host-Spezies des primären Antikörper und zwei Schlitten vom Spender Milz für Insulin und Glukagon inkubiert.

Abbildung 2. Vertreter doppelt gefärbten Folie. Eine typische fertige Folie wird mit Folie Kennzeichnung Parameter und Gewebe Platzierung gezeigt, bevor digitale Abtastung erfolgt.

Abbildung 3. Vertreter von H & E und IHC Flecken in der Bauchspeicheldrüse Abschnitten. Abschnitte aus der Bauchspeicheldrüse von einer erwachsenen Frau Organspender (6096-04 Panhead) waren fleckig und digitale Scans durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Bilder wurden mit dem Programm ImageScope Betrachtung des gesamten Abschnitt (AD) und von einer kleinen Insel (EH). Die zu erwartenden Inselchen Fleck Intensitäten für Insulin, Glukagon und Pankreaspolypeptid sindbeobachtet Abschnitte BD als Abschnitt D skizziert, dass diese Pankreas Kopfblock einen kleinen Teil des hakenförmigen Region oder ventralen Pankreas Lappen da alle Inseln vor allem Polypeptid aus der Bauchspeicheldrüse-positive Zellen enthalten enthält. Beachten Sie, dass die Hämatoxylin-Gegenfärbung in D Panel zu hell ist, während der Hämatoxylin Gegenfärbung Intensitäten in B und C sind optimal. EH Panels zeigen eine kleine Insel aus dem dorsalen Lappen mit der erwarteten Verteilung der β-Zellen und α-Zellen. Einige Polypeptid aus der Bauchspeicheldrüse Zellen werden in der linken unteren Teil der Insel (H) vorhanden. A, E-H &E; B, F-Ki67 + Insulin, C, G-CD3 + Glucagon, D, H-Pankreas-Polypeptid. AD, 0.2x, EH-12,8 X.

Diskussion

Die Standardisierung der immunhistochemischen Verfahren ist von entscheidender Bedeutung für die Bildanalyse, insbesondere bei Verwendung von Computer-basierten Algorithmen über eine große Anzahl von Dias über die Zeit. Der IHC-Färbung Verfahren in diesem Bericht beschrieben wird es Batch-Analyse einer gegebenen Spenders Proben mit einem Autostainer innerhalb einer 8-stündigen Arbeitstag und werden von einem früheren Bericht ⁵ modifiziert. Digitalisierte Bilder gesamten Objektträger eines jeden gefär...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
30% igem Wasserstoffperoxid (H 2 O 2)	FisherScientific	H325-500	Endogene Peroxidase Blocking
ABC-alkalische Phosphatase (AP)	Vektor	AK-5000	AP-Konjugat
Antibody Diluent	Invitrogen	003218	Der primäre Antikörper
Avidin-Blocker	Vektor	SP-2001	Blockieren Sie endogenes Biotin
Biotinylierten Ziegen-anti-Meerschweinchen	Vektor	BA-7000	Sekundärer Antikörper
Bläuungsreagenz	FisherScientific	7301	Leica autostainer
Citratpuffer, pH 6,0	BioGenex	HK086-9K	Antigen-Retrieval
Clarifier 1	FisherScientific	7401	Leica Autostainer
Cytoseal XYL	FisherScientific	8312-4	Coverslip Deckfluessigkeit
DAB	Vektor	SK-4100	HRP Chromogen
Deeb	DAKO	S2003	Endogene AP Blockierungsreagenz
Eosin Y Alkoholische	FisherScientific	71204	Leica Autostainer
Ethanole-100%, 95%, 90%, 70%	FisherScientific	Verschiedene	Entparaffinierung und Eindecken
Hämatoxylin	DAKO	S3301	Dako Autostainer
Hämatoxylin 7211	FisherScientific	7211	Leica Autostainer
IgG (alle Wirtsarten für Primär-Antikörper)	Verschiedene	Verschiedene	Negative Kontrollen für Vorwahlen
Flüssige Permanent Red (LPR)	DAKO	K0640	AP Chromogen
Mach2 AP	Biocare Medical	MALP521L	Ziege anti-Maus AP-Konjugat
Mach2 HRP	Biocare Medical	MHRP520L	Ziege anti-Maus-HRP-Konjugat
Mach2 HRP	Biocare Medical	RHRP520L	Ziege anti-Maus-HRP-Konjugat
Methanol	FisherScientific	Verschiedene	H 2 O 2 Verdünnungsmittel
Normalem Ziegenserum	Vektor	S-1000	IHC Blockierungsreagenz
Heckenschütze	Biocare Medical	BS966M	IHC Blockierungsreagenz
TBST 20X	ThermoScientific	TA-999-TT	IHC-Puffer
Triology 20x	Cell Marque	920P-06	Antigen-Retrieval
Xylol	FisherScientific	Verschiedene	Entparaffinierung und Eindecken

Primärer Antikörper	Wirtsarten	Verkäufer	Cat. #	Kommentare und Antigen-Retrieval
Paraffin
Amylase	Maus	Santa Cruz	SC-46657	Zitrat
Amylin	Maus	Serotec	MCA11267	Zitrat
Carboanhydrase 19,9	Maus	Abcam	ab15146
Caspase-3, gespalten	Kaninchen	Cell Signaling	9961	Citrat oder Trilogy
CD20	Maus	DAKO	M0755	Citrat oder Trilogy
CD3	Kaninchen	DAKO	A0452	Zitrat
CD34	Maus	Cell Signaling	3569	Zitrat
CD4	Maus	DAKO	M7310	Zitrat
CD45	Maus	DAKO	M0754	Zitrat
CD68	Maus	DAKO	M0876	Zitrat
CD8	Maus	DAKO	M7103	Zitrat
Chromogranin A	Kaninchen	DAKO	A0430	Zitrat
CK17	Maus	DAKO	M7046	Zitrat
CK19	Maus	DAKO	M0772	Zitrat
CK7	Maus	DAKO	M7018	Zitrat
C-Peptid	Kaninchen	Cell Signaling	4593	Zitrat
Foxp3	Ratte	e Bioscience	14-4776-80	Zitrat
Ghrelin	Ziege	Santa Cruz	SC-10.386
Ghrelin	Kaninchen	Abcam	ab85104
Glucagon	Kaninchen	DAKO	A0565
Glucagon	Maus	Abcam	ab10988	Zitrat
Glucagon	Guinea Pig	Bachem	T-5037	Zitrat
Glut-1	Maus	Abcam	ab40084	Trilogie
Glut-2	Kaninchen	Santa Cruz	SC-9117	Nicht in menschlichen Inseln ausgedrückt
Insulin	Guinea Pig	DAKO	A0564
Ki-67	Maus	DAKO	M7240	Zitrat
Mafa	Kaninchen	Novus Biologische	NB400-137A	Trilogie
Pankreaspolypeptid	Kaninchen	Invitrogen	18-0043	Zitrat
PDX-1	Guinea Pig	Abcam	ab47308	Citrat oder Trilogy
Proinsulin	Maus	Novocastra	NCL-Proin-1G4
Proinsulin	Maus	Developmental Studies Hybridoma der Bank	GS-9A8	Zitrat
Secretagogin	Kaninchen	Sigma	HPA 006641	Zitrat
Glattmuskelaktin	Kaninchen	Abcam	ab5694
Somatostatin	Kaninchen	DAKO	A0566
Synaptophysin	Maus	DAKO	M0776	Zitrat
Fresh Frozen	Wirtsarten	Verkäufer	Cat. #	Kommentare
CD11b	Ratte	Abcam	ab6332	Fix mit 4% PF
CD11c	Kaninchen	Serotec	AHP1226
CD25	Maus	Novus Biologische	NB 600-564	Verwenden Sie Inkubation über Nacht für Paraffinschnitte
CD94	Maus	Abcam	ab61874	Fix mit Aceton
GAD65	Maus	Santa Cruz	SC-130.569	Fix mit 4% PF
HLA-ABC	Maus	DAKO	M0736	Fix mit Aceton oder 4% PF

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Aperio ScanScope CS	Aperio		Digitale Dia-Scanner
DAKO Autostainer Plus	DAKO		IHC Flecken
Label Matrix-Druck-Software	BioCarta	LM7UP57	Slide-Label-Software
Leica Autostainer XL	Leica		H & E Flecken
Premium-Deckglas	FisherScientific	12 bis 548-5J	Coverslip
Spectrum Information Manager	Aperio		Scanner-Software
Superfrost Plus Objektträger	FisherScientific	12-550-15	Positiv geladene Objektträger
Gemüsedämpfer	Black und Decker	Verschiedene	Antigen-Retrieval
Zebra TLP 3742	CDWG	TLP3742	Slide-Etikettendrucker