הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם

Summary

סרט הווידאו הזה מדגים נהלים ואפיון של איים הלבלב אדם באמצעות hematoxylin ו eosin (H & E) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC). סעיפים הלבלב מן הראש, הגוף, באזורים הזנב מוכתמות על ידי שני H & E ו-IHC לקבוע הרכב האנדוקרינית איון (אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד), שכפול תאים (Ki67), וכן מחלחל דלקתיות (H & E, CD3). האזור אונקלי הוא מקומי באמצעות IHC של הלבלב פוליפפטיד.

Abstract

אומדני השטח מספרים איון ותא האנדוקרינית הרכב בלבלב אדם מבוגר נע בין כמה מאות אלפים על טווחים המונים כמה מיליוני ובטא מ 500 עד 1500 מ"ג ^1-3. עם ההטרוגניות זה ידוע, עיבוד רגיל הליך מכתים פותחה על כך אזורים הלבלב הוגדרו בצורה ברורה איים מאופיין באמצעות אנליזה פתולוגית בכליה קפדני בדיקות immunolocalization.

נהלים אחידים לעיבוד הלבלב האנושי התאושש תורמים איברים מתוארים בחלק זה של סדרה 1. הלבלב מעובד ל 3 אזורים עיקריים (ראש, גוף, זנב) ואחריו חלקים רוחביים. חלקים רוחביים של ראש הלבלב מחולקים עוד יותר, כפי שמצוין על פי גודל, ממוספרות לפי סדר אלפביתי לציון קטנים. סטנדרטיזציה זו מאפשרת ניתוח מלא חתך רוחב של אזור הראש כולל אזור אונקלי המכיל איים המורכביםבעיקר של תאים בלבלב פוליפפטיד לאזור הזנב.

הדו"ח הנוכחי מהווה חלק 2 מתוך סדרה זו ומתאר את הנהלים המשמשים חתך סדרתי ואפיון histopathological של פרפין סעיפים הלבלב עם דגש על תאים אנדוקריניים איון, שכפול, T-cell המחלחל. פתולוגיה של הלבלב סעיפים נועד לאפיין גם אקסוקרינית, ductular, ורכיבים אנדוקריניות. תא אקסוקרינית מוערך נוכחות של דלקת הלבלב (פעיל או כרוני), ניוון, סיסטיק, שומן, כמו גם מערכת צינורות, בעיקר ביחס לנוכחות של neoplasia הלבלב intraductal ^4. איי מוערכים על מורפולוגיה, גודל, צפיפות, תאים אנדוקריניים, דלקת, פיברוזיס, עמילואיד, ואת הנוכחות של תאים אפופטוטיים משכפלים או באמצעות H & E ו-IHC כתמים.

המרכיב האחרון המתואר חלק 2 הוא מתן שקופית צבעוניתכמו דיגיטציה של תמונות שקופיות שלמים. השקופיות דיגיטציה מסודרים לפי המקרה באזור הלבלב במסד נתונים של הפתולוגיה מקוון ליצירת biobank וירטואלי. גישה לאוסף מקוון זה מספק כיום יותר מ -200 רופאים ומדענים העוסקים במחקר סוכרת מסוג 1. מסד הנתונים המקוון מספק אמצעי לשיתוף נתונים מהירה מלאה לחוקרים בחר אבני פרפין או חלקים סדרתיים קפואים.

Protocol

1. Microtomy על סעיפים בלא כתם

1. הגדרת אמבט מים microtome באשר microtomy פרפין סטנדרטי. השתמש שקופיות בעלי מטען חשמלי חיובי ושל מראש תווית עם מספר התיק, באזור הלבלב (לדוגמה) ואת מספר שקופיות. פרפין במקום לחסום צ'אק microtome עם תווית את הקלטת בצד שמאל.
2. בצע את ההליכים microtomy רגילים, סעיף לבלוק עד רקמת הוא נתקל באופן אחיד. לייצר סרט של חלקים סדרתיים (4 מיקרומטר עבים, 3-6, תלוי כמה כתמים הנדרשים הראשונים (ראה מקרה הגשת טופס, נספח 1)). חלקים נפרדים סרט, לקחת את זה לפי הסדר, ומניחים על שקופיות עם סדר ספורים בעיפרון. לציין אם סעיף זה מנוצל על ידי מספור הסעיפים לפי סדר מדויק. לשמור על הכיוון אותו בשקופית כמו למצוא קלטת עם תווית שקופיות בכיוון שמאלה. יבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להמשיך עם כתמים או הפצה החוקרים.
3. מילמשטח EAL של גוש פרפין עם שכבה דקה של פרפין לשמר רקמות ארכיון בטמפרטורת החדר או -20 ° C.
4. עבור microtomy לאחר מכן, לשמור על מספור הסעיפים סדרתיים בכל רמה לעיל. קבל 1 שקופית נוספת על ידי כתם שקופיות H & E עבור כל רמה ~ 100 מיקרומטר בתוך כל בלוק.

2. H & E מכתים

1. מניחים את השקופית הראשונה מחולק הסידורי של כל בלוק במעמד שקופית ואז במגש הראשון autostainer.
2. בחר את התוכנית תקן H & E כתם ולהמשיך כרגיל.
3. בסיום מכתים, להסיר את השקופיות מן autostainer ומניחים מכסה המנוע של coverslipping.
4. Coverslip באמצעות טכניקה סטנדרטית. לייבש היטב את התווית עם תווית מודפס (ראה סעיף 12).

3. IHC Set-up

1. בחר את התוכנית Dako עבור כתמים כפולים ומספרים קלט של שקופיות. הכן TBST ו ציטראט מאגרים, נוגדנים, reag אחרלהורים על פי כרכים שצוין (טבלה 1). טען את מגש מגיב שקופיות. הסיבוב של קווים נקיים פסולת מתוכנתים על פי המלצות היצרן.
2. אם מבצעים את מבחני ידני, להכין כרכים כ. דגירה שקופיות חדר humidified להימנע שקופיות ייבוש החוצה בשלב כלשהו. בצע את אותו תהליך עבור כל ריאגנטים כמו בעת שימוש עבור autostainer.

4. IHC Deparaffinization ואחזור Antigen

1. שים שקופיות קסילן במשך 5 דקות. חזור פעם אחת. אל תאפשר השקופיות להתייבש בכל שלב שלאחר מכן עד כמצוין זה יביא ברקע מוגזם מכתים עניים.
2. העברת שקופיות אתנול 100% במשך 2 דקות. חזור פעם אחת.
3. שים שקופיות מוכן טרי 3% H ₂ O ₂ ב מתנול במשך 10 דקות.
4. טובלים שקופיות באתנול 90% ולאחר מכן למקם באתנול 90% במשך 3 דקות.
5. העברת שקופיותאתנול 70% למשך דקה 1.
6. יש לשטוף במים שקופיות דה מיונן.
7. מחממים הספינה ואת מאגר ציטראט על הספינה במשך 5 דקות.
8. הוסף שקופיות ציטראט חיץ קיטור ואדים במשך 30 דקות.
9. מיד להעביר שקופיות מים ממושכת עד מחליק מצננים לטמפרטורת החדר (~ 20 דקות).
10. העברת שקופיות מדפי autostainer Dako על פי כתם רצף (איור 1) ולהפעיל את תוכנית צביעה כפולה. הצעדים העיקריים של התוכנית autostainer מפורטים כך פועל ידניים יכול לשכפל.

5. נוגדנים הראשוניות (Ki-67, CD3, הלבלב פוליפפטיד)

1. חסום שקופיות עם פתרון צלף במשך 15 דקות. שטפו פעמיים עם TBST.
2. דגירה שקופיות הנוגדן העיקרי במשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם TBST.
3. דגירה עם עז Mach2 אנטי עכבר (Ki-67) או ארנבת אנטי (CD3, הלבלב פוליפפטיד) צנון סוס peroxidase (HRP) פולימר של 30 מ 'inutes. שטפו פעמיים עם TBST.
4. החל 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) לשקופיות עבור 4 דקות. לשטוף פעמיים במים.
5. שקופיות מודגרות עם הלבלב פוליפפטיד מוחזקים על Dako בזמן הטיפול ושם ישקלו לו ויעריכו במקביל ו TBST המשמש את כל הצעדים הבאים תוך בשקופיות שנותרו מודגרת עם סט של 2 נוגדנים ראשוניים. לחלופין, עבור מבחני ידניים, המשך לסעיף 6.

6. נוגדנים ראשיים השני (אינסולין, גלוקגון)

1. דגירה שקופיות דיב 20 דקות. שטפו פעמיים עם TBST.
2. בלוק עם סרום 10% עיזים רגיל חוסם avidin 20% TBST (אינסולין) או צלף (גלוקגון) ב TBST במשך 20 דקות. שטפו פעמיים עם TBST.
3. דגירה עם אינסולין או נוגדנים גלוקגון העיקרי במשך 15 דקות. שטפו פעמיים עם TBST.
4. אינסולין: שקופיות דגירה של חזיר biotinylated עז נגד גינאה בדילול 1:300 במשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. דגירה עם יש תקןctor ABC-AP מגיב במשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם TBST.
5. גלוקגון: שקופיות דגירה של חיץ במהלך 30 דקות ואחריו נגד העכבר עז אלקליין phosphatase (AP) פולימרי במשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם TBST.
6. בעוד שקופיות מודגרת ב conjugates, לחמם את מאגר LPR לטמפרטורת החדר. הוסף 1 טיפה של נוזל אדום קבע (LPR) לכל מאגר מ"ל 3 מיידית לפני השימוש במקום במעמד מגיב Dako. דגירה שקופיות LPC במשך 4 דקות. לשטוף פעמיים במים.
7. דגירה שקופיות hematoxylin דקה 1. יש לשטוף פעמיים במים.
8. דגירה שקופיות כפות pH 7.6 דקה 1. יש לשטוף פעמיים במים.
9. לפרוק שקופיות מ DAKO Autostainer.
10. מיד מייבשים שקופיות מוכתמים על הלבלב פוליפפטיד. עבור כל השקופיות מוכתמים כפולות, יבש לפחות שעה 1 ואז מייבשים.

7. התייבשות

1. במקום שקופיות באתנול 80% למשך דקה 1.
2. טובלים שקופיות באתנול 95%.
3. החזק שקופיות באתנול 95% למשך 30 שניות.
4. העברת שקופיות אתנול 100% והחזק 1 דקה. חזור.
5. טובלים שקופיות קסילן.
6. החזק שקופיות קסילן דקה 1. חזור.
7. מיד לעלות coverslips בשקופיות באמצעות cytoseal.

8. Slide סימון

1. הזן את זיהוי המקרה המידע כולל מספר איברים אבן, כתם, ותאריך ולהדפיס. בסעיף מספר סידורי הוא אופציונלי על הכתמים השקופית הראשונה של כל בלוק. רמות הבאים מסומנים על ידי מספור.
2. מניחים תוויות בשקופיות.

9. שקופיות סריקה

1. מניחים במגש שקופיות צבעונית, סורק לסרוק פי מכשור.
2. לארגן שקופיות לפי סוג התורם ורקמות (ראש הלבלב, גוף, זנב, טחול).
3. שקופיות ארכיון מוכתמים בטמפרטורת החדר וכל שקופיות בלא כתם הנותרים ב -20 ° C עד בשימוש.

10. Representative תוצאות

נהלים אלה צביעה פותחו עבור רשת JDRF לעוגב תורמים הלבלב עם סוכרת (nPOD) כדי לספק אפיון בסיסי של פרפין בלוקים קפואים טריים. תורם לכל אחד מהם יש אפיון המחקר ביצע מורכב מכתים 2 בלוקים כל אזור הלבלב (ראש, גוף, זנב) ואת הטחול (איור 1, ראו גם טופס הגשת התיק, נספח 1). צביעת H & E נעשה באמצעות autostainer מתוכנת כמו מתקן קלינית קליני כיתה פתרונות המשמשים לאורך כל הדרך. כמו אבני התורמות נוספים הם מחולק, לכל שקופית מובנת H & E להראות מורפולוגיה רקמות. כאשר הם אבני מחולק שוב, כמו להפצה החוקרים, רמות עמוקות יותר יהיה גם שקופיות שצולמו עבור נציג H & שקופיות ה לתעד את המורפולוגיה של הרקמה בלוק שלם כמו גם מספור הסעיפים סדרתיים בכל רמה. שקופיות ויטראז מסומנים עםזיהוי מקרה, באזור הלבלב, מספר בלוק, כתם ותאריך (איור 2) וסקר את מערכת ניהול מידע באינטרנט הפתולוגיה. תמונות מייצגות מתורם השליטה מוצגות באיור 3 בשני בהגדלה נמוך וגבוה להראות התוצאות הצפויות בעקבות הליך זה. מוכתם שקופית עם הלבלב פוליפפטיד (D, H) ושם ישקלו לו ויעריכו היה ביום אחר עם assay באופן ידני ומראה עוצמת מכתים מופחת של counterstain hematoxylin. הבדלים מכתים עוצמת נוגדנים ראשוניים או counterstain בין מבחני יש להימנע במיוחד אם באמצעות ניתוח תמונה אחרת עם מחליק דורשים תיקון צבע הפרט כדי להשיג את אותו התא או אזורים ספירות.

כל מעבדה צריך לצפות כדי לייעל את ריכוזי הנוגדנים כמו הרבה אל הווריאציה הרבה חומרים כימיים אחרים ותנאים יכול להשפיע בעוצמה מכתים וספציפיות. עם הרכישה של ניו ריאהרבותי, נהלים מכתים מאומתים עם דגימות הידועות בקרה חיוביים ושליליים כדי להשיג את אותה מידה של עוצמת הכתם כמו ריאגנטים לשעבר. נוגדנים נוספים אופטימיזציה בליבת nPOD הפתולוגיה ניתנים בטבלה 2 כמקור התייחסות שימשו במשך multilabeling מבחני immunofluorescence עבור מיקרוסקופיה confocal.

באיור 1. רשת Dako מכתים. סכמטית זה מתאר ניתוח שגרתי מהלבלב התורם nPOD שבוצעה על autostainer Dako. התורמים nPOD מוצפנים עם מספר בן 4 ספרות זיהוי. שני מגשי שקופיות מוצגים עם שקופיות מאורגנות על ידי כתם. תצורות חלופיות שקופיות צפויים תלוי במספר שקופיות התורמות. בקרות חיוביות כוללים הכללת תורם חיובית ידוע על שני כתמים כפולים הטחול התורם עבור Ki-67 ו CD3. בקרות שליליות הן כפולה וכוללים 2 SLIדה מבלוק אחד תורם הלבלב מודגרות עם אימונוגלובולינים (איג) מן המין המארחות של נוגדנים ראשוניים שתי שקופיות של הטחול התורם עבור אינסולין גלוקגון.

איור 2. נציג שקופית צבעונית כפולה. שקופיות המוגמר טיפוסי מוצג עם תיוג פרמטרים שקופיות השמה רקמות לפני סריקה דיגיטלית מבוצעת.

איור 3. נציג H & E וכתמים IHC בסעיפים הלבלב. סעיפים מהלבלב של תורם האיבר הנשי הבוגר (6096-04 PanHead) היו מוכתמות סריקות דיגיטליות שבוצעו כמפורט בפרוטוקול. התמונות התקבלו באמצעות תוכנית ImageScope ההצגה של סעיף שלם (AD) ומ איון 1 (EH). את עוצמות איון צפוי כתם של אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד הםציין עבור חלקים BD כמו משרטטת פרק ד ', כי זה בלוק בראש הלבלב מכיל חלק קטן של האזור אונקלי או באונה הלבלב הגחון כמו איים כולם מכילים בעיקר פוליפפטיד חיובי בתאי הלבלב. שים לב counterstain hematoxylin בלוח D הוא קל מדי בזמן hematoxylin counterstain עוצמות ב B ו-C הם אופטימליים. לוחות EH להראות איון מהאונה הגב עם ההפצה מצופה מתאי בטא ו α-תאים. התאים בלבלב כמה פוליפפטיד נמצאים בחלק השמאלי התחתון של איון (H). , E-H &E; B, F-Ki67 + אינסולין, C, G-CD3 + גלוקגון, D, H-הלבלב פוליפפטיד. לספירה, 0.2X, EH-12.8x.

Discussion

סטנדרטיזציה של תהליכי IHC הוא קריטי לניתוח תמונה, במיוחד בעת שימוש במחשב מבוסס אלגוריתמים על פני מספר גדול של שקופיות לאורך זמן. הליך מכתים IHC המתואר בדוח זה יאפשר ניתוח סדרה של דגימות של תורמים ניתן באמצעות autostainer תוך יום 8 שעות עבודה משתנים מן הדו"ח הקודם ^5. דיג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
מי חמצן 30% (H 2 O 2)	FisherScientific	H325-500	Peroxidase אנדוגני חסימת
ABC-phosphatase אלקליין (AP)	וקטור	AK-5000	AP המצומד
נוגדנים diluent	Invitrogen	003218	ראשי נוגדן
Avidin חוסם	וקטור	SP-2001	חסום ביוטין אנדוגני
עיזים Biotinylated נגד חזיר ים	וקטור	BA-7000	משני הנוגדנים
Bluing מגיב	FisherScientific	7301	לייקה autostainer
מאגר ציטראט, ה-pH 6.0	BioGenex	HK086-9K	Antigen אחזור
Clarifier 1	FisherScientific	7401	לייקה autostainer
Cytoseal XYL	FisherScientific	8312-4	Coverslip mountant
DAB	וקטור	SK-4100	HRP אב צבע
דיב	DAKO	S2003	AP אנדוגני חסימת מגיב
Eosin אלכוהולי Y	FisherScientific	71204	לייקה autostainer
Ethanols-100%, 95%, 90%, 70%	FisherScientific	שונים	Deparaffinization ו coverslipping
Hematoxylin	DAKO	S3301	Dako autostainer
Hematoxylin 7211	FisherScientific	7211	לייקה autostainer
IgG (כל המינים המארחות של נוגדנים ראשוניים)	שונים	שונים	בקרות שליליות על הפריימריז
אדום קבע נוזלי (LPR)	DAKO	K0640	AP אב צבע
Mach2 AP	Biocare רפואי	MALP521L	אנטי עכבר עיזים AP המצומד
Mach2 HRP	Biocare רפואי	MHRP520L	אנטי עכבר עיזים HRP המצומד
Mach2 HRP	Biocare רפואי	RHRP520L	אנטי עכבר עיזים HRP המצומד
מתנול	FisherScientific	שונים	H 2 O 2 diluent
עז רגיל סרום	וקטור	S-1000	IHC מגיב חסימת
צלף	Biocare רפואי	BS966M	IHC מגיב חסימת
TBST 20X	ThermoScientific	מדד ת"א 999-TT	IHC חיץ
Triology 20x	תא Marque	920P-06	Antigen אחזור
קסילן	FisherScientific	שונים	Deparaffinization ו coverslipping

ראשי נוגדן	המארחות מינים	מוכר	החתול. #	תגובות ואחזור Antigen
פרפין
עמילאז	עכבר	סנטה קרוז	SC-46657	ציטראט
Amylin	עכבר	Serotec	MCA11267	ציטראט
פחמתית anhydrase 19.9	עכבר	Abcam	ab15146
Caspase-3, ביקע	ארנב	התא איתות	9961	ציטראט או הטרילוגיה
CD20	עכבר	DAKO	M0755	ציטראט או הטרילוגיה
CD3	ארנב	DAKO	A0452	ציטראט
CD34	עכבר	התא איתות	3569	ציטראט
CD4	עכבר	DAKO	M7310	ציטראט
CD45	עכבר	DAKO	M0754	ציטראט
CD68	עכבר	DAKO	M0876	ציטראט
CD8	עכבר	DAKO	M7103	ציטראט
Chromogranin	ארנב	DAKO	A0430	ציטראט
CK17	עכבר	DAKO	M7046	ציטראט
CK19	עכבר	DAKO	M0772	ציטראט
CK7	עכבר	DAKO	M7018	ציטראט
C-peptide	ארנב	התא איתות	4593	ציטראט
Foxp3	עכברוש	Bioscience דואר	14-4776-80	ציטראט
גרלין	עז	סנטה קרוז	SC-10386
גרלין	ארנב	Abcam	ab85104
גלוקגון	ארנב	DAKO	A0565
גלוקגון	עכבר	Abcam	ab10988	ציטראט
גלוקגון	חזיר ים	Bachem	T-5037	ציטראט
שפע-1	עכבר	Abcam	ab40084	טרילוגיה
שפע-2	ארנב	סנטה קרוז	SC-9117	לא באה לידי ביטוי איים אדם
אינסולין	חזיר ים	DAKO	A0564
Ki-67	עכבר	DAKO	M7240	ציטראט
Mafa	ארנב	נובוס ביולוגית	NB400-137A	טרילוגיה
פוליפפטיד הלבלב	ארנב	Invitrogen	18-0043	ציטראט
PDX-1	חזיר ים	Abcam	ab47308	ציטראט או הטרילוגיה
Proinsulin	עכבר	Novocastra	NCL-proin-1G4
Proinsulin	עכבר	התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק	GS-9A8	ציטראט
Secretagogin	ארנב	סיגמא	HPA 006641	ציטראט
שריר חלק אקטין	ארנב	Abcam	ab5694
Somatostatin	ארנב	DAKO	A0566
Synaptophysin	עכבר	DAKO	M0776	ציטראט
טרי קפוא	המארחות מינים	מוכר	החתול. #	תגובות
CD11b	עכברוש	Abcam	ab6332	תקן עם PF 4%
CD11c	ארנב	Serotec	AHP1226
CD25	עכבר	נובוס ביולוגית	נ.ב. 600-564	השתמש הדגירה לילה עבור חלקים פרפין
CD94	עכבר	Abcam	ab61874	תקן עם אצטון
GAD65	עכבר	סנטה קרוז	SC-130569	תקן עם PF 4%
HLA-ABC	עכבר	DAKO	M0736	תקן עם אצטון או PF 4%

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Aperio Scanscope CS	Aperio		שקופית סורק דיגיטלי
DAKO Autostainer פלוס	DAKO		IHC כתמים
מטריקס לייבל הדפסה תוכנה	BioCarta	LM7UP57	התווית שקופיות תוכנה
לייקה XL Autostainer	Leica		H & E כתמים
פרימיום Coverglass	FisherScientific	12-548-5j	Coverslip
מידע קשת Manager	Aperio		סורק תוכנות
Superfrost פלוס מחליק	FisherScientific	12-550-15	מטען חשמלי חיובי שקופיות
ירקות קיטור	שחור דקר	שונים	Antigen אחזור
Zebra TLP 3742	CDWG	TLP3742	התווית שקופיות מדפסת