Protocoles de coloration pour des îlots pancréatiques humains

Résumé

Cette vidéo montre des procédures pour la caractérisation des îlots pancréatiques humains en utilisant l'hématoxyline et l'éosine (H & E) et l'immunohistochimie (IHC). Sections du pancréas, de la tête, le corps et les régions de la queue sont colorées à la fois par H & E et IHC pour déterminer la composition du système endocrinien îlot (insuline, le glucagon, et le polypeptide pancréatique), la réplication des cellules (Ki67), et des infiltrats inflammatoires (H & E, CD3). La région est localisée à l'aide unciforme IHC pour le polypeptide pancréatique.

Résumé

Estimations de la superficie des îlots et les numéros et la composition des cellules endocrines dans le pancréas humain adulte varie de plusieurs centaines de milliers à plusieurs millions de gammes de masse et bêta à partir de 500 à 1500 ^1-3 mg. Avec cette hétérogénéité connue, un traitement standard et procédure de coloration a été développé afin que les régions du pancréas ont été clairement définis et îlots caractérisés par l'histopathologie et rigoureuse des examens immunolocalisation.

Des procédures normalisées pour le traitement de pancréas humain récupéré à partir de donneurs d'organes sont décrites dans la partie 1 de cette série. Le pancréas est transformé en 3 grandes régions (tête, corps, queue), suivis par les sections transversales. Des coupes transversales de la tête du pancréas sont encore divisés, comme indiqué sur la base de la taille, et numérotées par ordre alphabétique pour désigner paragraphes. Cette standardisation permet une analyse complète de la section transversale de la région de la tête, y compris la région unciforme qui contient des îlots composésprincipalement de cellules pancréatiques polypeptidiques à la région de la queue.

Le présent rapport comprend une partie 2 de cette série et décrit les procédures utilisées pour les coupes sériées et la caractérisation histopathologique des coupes en paraffine pancréatiques en mettant l'accent sur les cellules endocrines des îlots de Langerhans, la réplication et de cellules T des infiltrats. Pathologie des sections du pancréas est destiné à caractériser à la fois exocrine, ductulaire, et composants du système endocrinien. Le compartiment exocrine est évalué pour détecter la présence de la pancréatite (actif ou chronique), l'atrophie, la fibrose, et la graisse, ainsi que le système de conduits, en particulier en relation avec la présence d'une néoplasie pancréatique intracanalaire ^4. Les îlots sont évalués pour la morphologie, la taille et la densité, les cellules endocrines, l'inflammation, la fibrose, l'amyloïde, et la présence de cellules en réplication ou apoptotiques en utilisant H & E et les taches IHC.

Le dernier élément décrit dans la partie 2 est la disposition de la lame colorées comme images numérisées de diapositives entières. Les diapositives numérisées sont organisées au cas par cas et dans la région du pancréas dans une base de données en ligne la création d'une pathologie virtuelle biobanque. L'accès à cette collection en ligne est actuellement fourni à plus de 200 cliniciens et les scientifiques impliqués dans la recherche du diabète de type 1. La base de données en ligne fournit un moyen de partage des données rapide et complète et pour les enquêteurs de sélectionner des blocs de paraffine ou congelés pour des coupes sériées.

Protocole

1. Microtomie pour les sections non colorées

1. Mettre en place bain d'eau et microtome que pour microtomie paraffine standard. Utilisez des lames chargées positivement et pré-étiquette avec le numéro de dossier, la région du pancréas (l'échantillon) et le numéro de diapositive. Bloc de paraffine place dans le mandrin microtome avec l'étiquette de cassette sur le côté gauche.
2. Suivre les procédures normales, Microtomie section dans le bloc jusqu'à ce que le tissu est uniformément rencontrés. Produire un ruban de coupes sériées (4 m d'épaisseur, 3-6 selon le nombre de taches initiales requises (voir formulaire de soumission de cas, l'annexe 1)). Des sections distinctes dans le ruban, ramasser chacun dans l'ordre, et le lieu sur des lames à l'ordre numéroté au crayon. Notons si une section est utilisé par la numérotation des sections dans l'ordre exact. Maintenir la même orientation sur la diapositive que l'on trouve dans la cassette avec le label diapositive orienté vers la gauche. Sécher toute la nuit à température ambiante puis procéder à la coloration ou la distribution aux enquêteurs.
3. Ressurface eal de bloc de paraffine d'une fine couche de paraffine à préserver les tissus et d'archivage à la température ambiante ou à -20 ° C.
4. Pour microtomie ultérieure, de maintenir de numérotation pour les coupes en série à chaque niveau comme ci-dessus. Obtenez 1 chariot supplémentaire et tacher par diapositive H & E pour chaque niveau de ~ 100 pM au sein de chaque bloc.

2. H & E coloration

1. Placer le premier coulisseau série une coupe de chaque bloc dans une grille coulissante puis dans le premier plateau sur la coloration automatique.
2. Sélectionnez la norme H & E du programme tache et procéder comme d'habitude.
3. Lorsque vous avez terminé la coloration, retirez les lames de coloration automatique et le lieu dans la hotte pour lamelles.
4. Lamelle en utilisant la technique standard. Séchez soigneusement et l'étiquette avec une étiquette imprimée (voir section 12).

3. IHC Set-up

1. Sélectionnez le programme de Dako pour les taches et les numéros doubles d'entrée de diapositives. Préparation des tampons TBST et le citrate, des anticorps, et d'autres Reagents en fonction des volumes spécifiés (tableau 1). Chargez le plateau des réactifs et des diapositives. Rotation des lignes propres et des déchets sont programmés selon les recommandations du fabricant.
2. Si l'exécution de ces tests manuellement, préparer les volumes estimés. Incuber les lames dans une chambre humide pour éviter le dessèchement des diapositives à n'importe quelle étape. Suivez la même procédure pour chaque réactifs que lorsqu'il est utilisé pour la coloration automatique.

4. Déparaffinage IHC et de restauration des antigènes

1. Mettre les lames dans le xylène pendant 5 minutes. Répéter une fois. Ne pas laisser les lames sécher à tout moment ultérieur jusqu'à ce que a indiqué que cela se traduira par de fond excessif et coloration pauvres.
2. Transfert diapositives à l'éthanol à 100% pendant 2 minutes. Répéter une fois.
3. Mettre les lames dans fraîchement préparée 3% H ₂ O ₂ dans le méthanol pendant 10 minutes.
4. Tremper les lames dans l'éthanol 90% puis placez-le dans l'éthanol 90% pendant 3 minutes.
5. Transfert de glisseL'éthanol à 70% pendant 1 minute.
6. Rincer les lames dans de l'eau déminéralisée.
7. Préchauffer le paquebot et un tampon de citrate dans une marguerite pendant 5 minutes.
8. Ajouter des diapositives avec du citrate de mémoire tampon dans le bateau à vapeur et de la vapeur pendant 30 minutes.
9. Immédiatement le transfert des diapositives à l'eau et tenir jusqu'à glisse refroidir à température ambiante (~ 20 minutes).
10. Transfert diapositives à des racks Dako Autostainer selon la tache séquence (Figure 1) et exécutez le programme double coloration. Les principales étapes du programme Autostainer sont répertoriés afin que les points fixes manuelles pouvez dupliquer.

5. Premières Anticorps primaires (Ki-67, CD3, le polypeptide pancréatique)

1. Bloc glisse avec une solution Sniper pendant 15 minutes. Laver deux fois avec TBST.
2. Incuber les lames dans l'anticorps primaire pendant 30 minutes. Laver deux fois avec TBST.
3. Incuber avec Mach2 chèvre anti-souris (Ki-67) ou anti-lapin (CD3, le polypeptide pancréatique) cheval peroxydase de raifort (HRP) polymère pour 30 minutes. Laver deux fois avec TBST.
4. Appliquer 3,3-diaminobenzidine tétrahydrochlorure (DAB) à des diapositives pendant 4 minutes. Laver deux fois avec de l'eau.
5. Lames incubées avec le polypeptide pancréatique sont maintenus sur le Dako lorsque étant dosée et en même temps TBST utilisé pour tous les étapes suivantes pendant que les lames restantes sont incubées avec le second ensemble d'anticorps primaires. Sinon, pour les dosages manuels, passez à la section 6.

6. Deuxièmement Anticorps primaires (insuline, glucagon)

1. Incuber les lames dans DEEB pendant 20 minutes. Laver deux fois avec TBST.
2. Bloquer avec du sérum de chèvre normal à 10% en bloquant l'avidine 20% dans TBST (insuline) ou Sniper (glucagon) dans TBST pendant 20 minutes. Laver deux fois avec TBST.
3. Incuber avec de l'insuline ou de l'anticorps primaire glucagon pendant 15 minutes. Laver deux fois avec TBST.
4. Insuline: Incuber les lames dans de chèvre anti-Guinée porc biotinylé à 1:300 de dilution pendant 30 minutes. Laver deux fois avec TBST. Incuber avec ve normector ABC-AP réactif pendant 30 minutes. Laver deux fois avec TBST.
5. Glucagon: Incuber les lames dans un tampon pendant 30 minutes, suivie par de chèvre anti-souris phosphatase alcaline (AP) polymère pendant 30 minutes. Laver deux fois avec TBST.
6. Tandis lames sont incubées dans des conjugués, chauffer le tampon LPR à la température ambiante. Ajouter 1 goutte de rouge permanente de liquide (LPR) par 3 ml de tampon immédiate avant l'utilisation et le lieu dans le rack réactif Dako. Incuber les lames dans LPC pendant 4 minutes. Laver deux fois avec de l'eau.
7. Incuber les lames dans l'hématoxyline pendant 1 minute. Rincer deux fois avec de l'eau.
8. Incuber les lames dans du TBS pH 7,6 pendant 1 minute. Rincer deux fois avec de l'eau.
9. Décharger les lames de DAKO Autostainer.
10. Immédiatement Déshydrater les lames colorées pour le polypeptide pancréatique. Pour toutes les diapositives doubles colorées, sec pendant au moins 1 heure, puis déshydrater.

7. La déshydratation

1. Lieu glisse dans l'éthanol 80% pendant 1 minute.
2. Plonger les lames dans l'éthanol à 95%.
3. Maintenez les lames dans l'éthanol à 95% pendant 30 secondes.
4. Transfert diapositives à l'éthanol 100% et maintenez 1 minute. Répéter.
5. Tremper les lames dans du xylène.
6. Tenez diapositives dans le xylène pendant 1 minute. Répéter.
7. Immédiatement monter des lamelles sur des lames en utilisant cytoseal.

8. Étiquetage diapositives

1. Entrez les informations d'identification cas y compris le nombre d'organes et de bloc, de la teinture, la date et l'impression. Numéro de la section de série est facultative pour les taches première diapositive de chaque bloc. Les niveaux suivants sont désignés par numérotation.
2. Placez les étiquettes sur les diapositives.

9. Numérisation diapositives

1. Placez les lames colorées dans le bac du scanner et de numériser en fonction de l'instrumentation.
2. Organisez vos diapositives par type donneur et les tissus (tête du pancréas, du corps, la queue, de la rate).
3. Diapositives Archives colorées à la température ambiante et toutes les diapositives restantes non colorées à -20 ° C jusqu'à leur utilisation.

10. RepreseRésultats ntative

Ces procédures de coloration ont été développés pour le réseau de la FRDJ de donneurs d'organes pancréatiques avec diabète (nPOD) pour fournir la caractérisation de base de paraffine et de frais blocs congelés. Chaque donateur a une caractérisation de base réalisée composé de coloration 2 blocs de chaque région du pancréas (tête, corps, et la queue) et de la rate (Figure 1, voir aussi formulaire de soumission cas, Annexe 1). La coloration H & E est effectuée en utilisant un Autostainer programmé que pour une installation clinique de qualité clinique solutions utilisées tout au long. Comme blocs donneurs supplémentaires sont sectionnés, chacun a une diapositive prise pour H & E pour montrer la morphologie des tissus. Lorsque les blocs sont sectionnés à nouveau, comme pour la distribution aux enquêteurs, des niveaux plus profonds devront également des diapositives prises pour le représentant de H & E diapositives afin de documenter la morphologie des tissus tout le bloc, ainsi que la numérotation des coupes sériées à chaque niveau. Lames colorées sont étiquetés avecl'identification des cas, la région du pancréas, le numéro de bloc, tache et la date (figure 2) et numérisés dans le système en ligne d'information de gestion pathologie. Des images représentatives provenant d'un donneur de contrôle sont présentés dans la figure 3, à deux grossissements haute et basse pour montrer les résultats escomptés à la suite de cette procédure. Les vitraux diapositive avec le polypeptide pancréatique (D, H) a été testée sur un autre jour avec le test effectué manuellement et montre réduit l'intensité de la coloration de la contre-coloration hématoxyline. Les différences dans l'intensité de la coloration des anticorps primaires ou du contre entre les dosages doit être évitée, en particulier si vous utilisez l'analyse d'image glisse autrement exiger la correction des couleurs individuel pour atteindre les zones de cellules mêmes chefs d'accusation.

Chaque laboratoire doit s'attendre à optimiser les concentrations d'anticorps comme étant le lot à lot de variation et d'autres réactifs et les conditions peuvent avoir une incidence intensité de la coloration et la spécificité. Avec l'acquisition de nouvelles raisonsmessieurs, les procédures de coloration sont validés avec des échantillons connus de contrôle positifs et négatifs pour atteindre le même degré d'intensité tache comme réactifs anciens. Anticorps supplémentaires optimisées dans le noyau nPOD pathologie sont fournis dans le tableau 2 comme source de référence et ont été utilisés pour multilabeling immunofluorescence pour la microscopie confocale.

Figure 1. Grille de coloration Dako. Ce schéma représente une analyse de routine à partir d'un pancréas de donneur nPOD effectuée sur un Dako Autostainer. Les bailleurs de fonds nPOD sont codés avec un numéro d'identification à 4 chiffres. Deux plateaux coulissants sont présentés avec des diapositives organisées par tache. Configurations de diapositives Autres sont attendus en fonction du nombre de diapositives donateurs. Les contrôles positifs, notamment l'intégration d'un donneur connu positif pour les deux taches doubles et de la rate des donateurs pour le Ki-67 et CD3. Les contrôles négatifs sont doubles et comprennent deux slides d'un bloc de pancréas de donneur incubées avec de l'immunoglobuline (Ig) de l'espèce hôte des anticorps primaires et deux diapositives à partir de la rate des donateurs pour l'insuline et le glucagon.

Figure 2. Représentant double glissière teinté. Une diapositive fini typique est montré avec des paramètres en matière d'étiquetage des diapositives et de placement des tissus avant la numérisation numérique est effectuée.

Figure 3. Représentant H & E et les taches IHC dans les sections du pancréas. Les articles du pancréas d'un donneur d'organe femelle adulte (6096-04 Panhead) étaient tachés et analyses numériques effectuées telles que décrites dans le protocole. Les images ont été obtenues en utilisant le programme ImageScope la visualisation de toute la section (AD) et d'un îlot (EH). Les intensités des îlots attendus détachants pour l'insuline, le glucagon, et le polypeptide pancréatique sontobservée pour les sections BD comme délimite D section que ce bloc de tête du pancréas contient une petite portion de la région unciforme ou lobe pancréatique ventrale que tous les îlots pancréatiques contiennent principalement polypeptide cellules positives. Notez que la contre-coloration hématoxyline dans le panneau D est trop léger alors que le hématoxyline recolorer intensités dans B et C sont optimales. Panneaux EH montrer un îlot du lobe dorsal avec la distribution attendue des cellules ß et α-cellules. A quelques cellules pancréatiques polypeptidiques se trouvent dans la partie inférieure gauche de l'îlot (H). A, E-H & E, B, F-Ki67 + insuline; C, G-CD3 + Glucagon; D, H-polypeptide pancréatique. AD, 0.2x, EH-12.8x.

Discussion

Normalisation des procédures IHC est critique pour l'analyse d'image, en particulier lors de l'utilisation des algorithmes informatiques, à travers un grand nombre de diapositives au fil du temps. La procédure de coloration IHC décrit dans le présent rapport permettront d'analyser des échantillons de lots d'un donateur donné de l'aide d'un Autostainer au sein d'une journée de travail de 8 heures et sont modifiées à partir d'un précédent rapport ^5. Images numéri...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Peroxyde d'hydrogène 30% (H 2 O 2)	FisherScientific	H325-500	Peroxydase endogène de blocage
ABC-phosphatase alcaline (AP)	Vecteur	AK-5000	AP conjugué
Antibody Diluent	Invitrogen	003218	L'anticorps primaire
Avidine bloquant	Vecteur	SP-2001	Bloquer la biotine endogène
Biotinylé de chèvre anti-Guinée cochon	Vecteur	BA-7000	Anticorps secondaire
Réactif bleuissant	FisherScientific	7301	Leica autostainer
Tampon citrate, pH 6,0	BioGenex	HK086-9K	De restauration des antigènes
Clarificateur 1	FisherScientific	7401	Leica Autostainer
Cytoseal XYL	FisherScientific	8312-4	Lamelle milieu de montage
DAB	Vecteur	SK-4100	HRP chromogène
DEEB	DAKO	S2003	Endogène AP réactif de blocage
Éosine alcoolique Y	FisherScientific	71204	Leica Autostainer
Éthanols-100%, 95%, 90%, 70%	FisherScientific	Divers	Déparaffinage et de lamelles de protection
Hématoxyline	DAKO	S3301	Dako Autostainer
Hématoxyline 7211	FisherScientific	7211	Leica Autostainer
IgG (toutes les espèces d'accueil pour les anticorps primaires)	Divers	Divers	Les contrôles négatifs pour les primaires
Liquid Permanent Red (LPR)	DAKO	K0640	AP chromogène
Mach2 AP	Biocare médicale	MALP521L	Chèvre anti-souris conjugué AP
Mach2 HRP	Biocare médicale	MHRP520L	Chèvre anti-souris conjugué HRP
Mach2 HRP	Biocare médicale	RHRP520L	Chèvre anti-souris conjugué HRP
Le méthanol	FisherScientific	Divers	H 2 O 2 diluant
Du sérum de chèvre normal	Vecteur	S-1000	IHC réactif de blocage
Tireur isolé	Biocare médicale	BS966M	IHC réactif de blocage
TBST 20X	ThermoScientific	TA-999-TT	IHC tampon
Trilogie 20x	Marque cellulaire	920P-06	Récupération d'antigène
Xylène	FisherScientific	Divers	Déparaffinage et de lamelles de protection

Anticorps primaire	Espèces hôtes	Vendeur	Cat. #	Commentaires et récupération d'antigène
Paraffine
Amylase	Souris	Santa Cruz	SC-46657	Citrate
Amylin	Souris	Serotec	MCA11267	Citrate
L'anhydrase carbonique 19,9	Souris	Abcam	ab15146
Caspase-3, clivé	Lapin	Signalisation cellulaire	9961	Citrate ou Trilogie
CD20	Souris	DAKO	M0755	Citrate ou Trilogie
CD3	Lapin	DAKO	A0452	Citrate
CD34	Souris	Signalisation cellulaire	3569	Citrate
CD4	Souris	DAKO	M7310	Citrate
CD45	Souris	DAKO	M0754	Citrate
CD68	Souris	DAKO	M0876	Citrate
CD8	Souris	DAKO	M7103	Citrate
Chromogranine A	Lapin	DAKO	A0430	Citrate
CK17	Souris	DAKO	M7046	Citrate
CK19	Souris	DAKO	M0772	Citrate
CK7	Souris	DAKO	M7018	Citrate
C-peptide	Lapin	Signalisation cellulaire	4593	Citrate
Foxp3	Rat	e Bioscience	14-4776-80	Citrate
La ghréline	Chèvre	Santa Cruz	SC-10386
La ghréline	Lapin	Abcam	ab85104
Glucagon	Lapin	DAKO	A0565
Glucagon	Souris	Abcam	ab10988	Citrate
Glucagon	Guinée Pig	Bachem	T-5037	Citrate
Glut-1	Souris	Abcam	ab40084	Trilogie
Glut-2	Lapin	Santa Cruz	SC-9117	Pas exprimé dans les îlots humains
Insuline	Guinée Pig	DAKO	A0564
Ki-67	Souris	DAKO	M7240	Citrate
Mafa	Lapin	Novus biologique	NB400-137A	Trilogie
Polypeptide pancréatique	Lapin	Invitrogen	18-0043	Citrate
PDX-1	Guinée Pig	Abcam	ab47308	Citrate ou Trilogie
Proinsuline	Souris	Novocastra	NCL-PROIN-1G4
Proinsuline	Souris	Developmental Studies Hybridoma Banque	GS-9A8	Citrate
Secretagogin	Lapin	Sigma	HPA 006641	Citrate
L'actine musculaire lisse	Lapin	Abcam	ab5694
La somatostatine	Lapin	DAKO	A0566
Synaptophysin	Souris	DAKO	M0776	Citrate
Frais congelé	Espèces hôtes	Vendeur	Cat. #	Commentaires
CD11b	Rat	Abcam	ab6332	Fixer avec PF 4%
CD11c	Lapin	Serotec	AHP1226
CD25	Souris	Novus biologique	NB 600-564	Utilisez une nuit d'incubation pour les coupes en paraffine
CD94	Souris	Abcam	ab61874	Fixer avec de l'acétone
GAD65	Souris	Santa Cruz	SC-130569	Fixer avec PF 4%
HLA-ABC	Souris	DAKO	M0736	Fixer avec de l'acétone ou PF 4%

Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aperio ScanScope CS	Aperio		Scanner de diapositives numérique
DAKO Autostainer Plus	DAKO		Taches IHC
Logiciel d'impression d'étiquettes Matrice	BioCarta	LM7UP57	Logiciel de étiquette de la diapositive
Leica Autostainer XL	Leica		H & E taches
Prime lamelle couvre-objet	FisherScientific	12-548-5J	Lamelle
Gestionnaire de l'information du spectre	Aperio		Logiciel du scanner
Superfrost Plus glisse	FisherScientific	12-550-15	Des lames chargées positivement
Vapeur de légumes	Black & Decker	Divers	De restauration des antigènes
Zebra TLP 3742	CDWG	TLP3742	Imprimante d'étiquettes Diapositive