تضخيم بروتين دوري Misfolding من البريونات

Summary

التضخيم البروتين دوري misfolding (PMCA) هو فحص المختبر في لدراسة تحويل بريون والحواجز سلالة والأنواع. ويمكن أيضا أن تستخدم لفحص الكشف عن بريون.

Abstract

البريونات هي العوامل المعدية التي تسبب الوفاة حتما انتقال مرض جنون (TSE) في الحيوانات والبشر ^9،18. من بروتين بريون اثنين من الأشكال الإسوية متميزة، وغير المعدية المضيف ترميز البروتين (بي ار بي ^C) والبروتين المعدية (بي ار بي ^SC)، وهو شكل الإسوي بشكل غير طبيعي مطوية من ^C بي ار بي ^8.

واحدة من التحديات التي تواجه العمل مع وكلاء بريون هي فترة حضانة طويلة قبل وضع العلامات السريرية بعد التلقيح المضيف ^13. هذا تكليف تقليديا طويلة ومكلفة الدراسات الأحيائي الحيواني. وعلاوة على ذلك، تتميز سيئة خصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية ^{للبرأسية} بي ار بي بسبب التشكل غير عادية والدول التجميع.

بي ار بي ^برأسية البذور يمكن تحويل ^C بي ار بي بي ار بي ^إلى اتفاقية استكهولم في المختبر ^14. PMCA هو أسلوب المختبر في أن يأخذ أدفاntage من هذه القدرة باستخدام صوتنة والحضانة دورات لإنتاج كميات كبيرة من بي ار بي ^{برأسية،} بمعدل متسارع، من نظام التي تحتوي على كميات الزائدة من بي ار بي ^C وكميات ضئيلة من البذور ^برأسية بي ار بي ^19. وقد ثبت أن ألخص هذه التقنية بشكل فعال خصوصية الأنواع وسلالة من بي ار بي ^برأسية التحويل من ^C بي ار بي، لمحاكاة التدخل سلالة بريون، وتضخيم مستويات منخفضة جدا من بي ار بي ^برأسية من الأنسجة المصابة، والسوائل، والعينات البيئية ^{6،7،16، 23.}

هذه الورقة تفاصيل البروتوكول PMCA، بما في ذلك توصيات للتقليل من التلوث، وتوليد نتائج متسقة، وقياس تلك النتائج. نناقش أيضا العديد من التطبيقات PMCA، بما في ذلك الجيل وتوصيف سلالات بريون المعدية، بريون تدخل السلالة، وكشف عن البريونات في البيئة.

Protocol

1. إعداد معدات

1. استخدام Misonix 3000 أو 4000 Misonix sonicator (فارمنجديل، NY) متصلة حمام الحرارية Neslab الكترون EX-7 المياه (نوينغاتون، NH) للحفاظ على درجة حرارة ثابتة من 37 ° C. يصوتن العينات في 200 ميكرولتر رقيقة الجدران أنبوب PCR شرائط مع قبعات القبة تم الحصول عليها من العلم الحرارية (التايم، MA).
2. A sonicator العلامة التجارية الجديدة يتطلب "كسر في" فترة من التشغيل المستمر ^9. فاصل في فترة شهرين وتتألف من انفجار صوتنة 40-ثوانى ودورات حضانة الدقيقة 10-مع مستوى السعة إلى 10 مجموعة. ينبغي للمرء أن يلاحظ تآكل في جميع أنحاء سطح صفيحة ميكروسكوبية القرن التيتانيوم (الشكل 1، لوحة B). فإن الماء عكر تعميم تبدو بيضاء بسبب تآكل صفيحة ميكروسكوبية القرن التيتانيوم. استبدال هذه المياه يوميا.
3. والتضخيم من ^برأسية بي ار بي تختلف في جميع أنحاء منطقة القرن صفيحة ميكروسكوبية. ويمكن الحصول على أفضل التضخيم ^برأسية بي ار بي الكفاءة داخلدائرة نصف قطرها 5 سم من وسط القرن صفيحة ميكروسكوبية (انظر الشكل 1، لوحة C).
4. جولة واحدة من دورات PMCA يتكون 144. كل دورة تتكون من صوتنة 5 و 10 ثانية حضانة دقيقة. وهذا يستتبع تقريبا إلى 24 ساعة لكل جولة من PMCA.
5. انتاج الطاقة من صوتنة، عرض على لوحة التحكم في sonicator، ويختلف مع عدد من الأنابيب PCR موجودة في رفوف وsonicator ودرجة حرارة المياه المتداولة من حمام الماء. تأكد من أن الماء هو معايرتها عند 37 درجة مئوية، وعدم ملء أكثر من 30٪ من رف أنبوب للsonicator في (الشكل 1، لوحة C). نشر أنابيب PCR خلال القرن صفيحة ميكروسكوبية. على الأقل صف واحد من المساحة الفارغة بين شرائح أنبوب PCR والسماح أي أكثر من أربعة أنابيب متصلة ببعضها البعض في قطاع (الشكل 1، لوحة C).
6. قوة صوتنة أمر بالغ الأهمية لالتضخيم بريون سلالة ناجحة. بينما sonicating، ضبط السعة لانتاج الطاقةتتراوح ما بين 155 واط 170 ~. في مختبرنا تم تعيين مستوى السلطة إلى ستة وسبعة ل3000 Misonix وMisonix 4000، على التوالي.
7. استخدام الماء المقطر في حمام مائي لتفادي تراكم البقع الماء العسر. استبدال هذا الأسبوعية المياه. خلال دورات حضانة وصوتنة، وتكثيف الماء داخل الغطاء تحدث القرن صفيحة ميكروسكوبية. لتجنب التكثيف، إرفاق الحرارة الحوض الصغير لوحة إلى أعلى مربع الضميمة على sonicator كما هو موضح في الشكل 1، لوحة A.

2. إعداد عينات

1. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات عن طريق رعاية جامعة كريتون الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة والامتثال للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. مخزنة قبل أي جمع الأنسجة، ويجب أن يكون هذا الحيوان تخدير وperfused transcardially باستخدام الثلج الباردة الفوسفات محلول ملحي مع EDTA 5 مم في درجة الحموضة 7.4 لإزالة الدم من المخ وتجنب تثبيطPMCA رد فعل من الدم ^7. جمع الأنسجة الحيوانية بسرعة باستخدام تقنية العقيم ولها أدوات تشريح مخصصة لكل سلالة بريون. بعد تشريح، ضع الأنسجة في أنبوب مل ميكروسنتريفوج 1.5، فلاش تجميده على الثلج الجاف، وتخزينها في -80 ° C حتى التجانس.
2. لإعداد الركيزة PMCA (بي ار بي ^C) حل، والتجانس الدماغ الهامستر غير مصاب (UN BH) في التوصل إلى حل الوزن / الحجم (ث / ت) 10٪ مع العازلة الجليد الباردة تحويل (انظر الجزء 3) باستخدام طاحونة الأنسجة Tenbroeck. بينما المجانسة، يجب الحرص على عدم الحصول على طاحونة الهواء داخل لتجنب الإفراط في رغوة من الحل. توضيح الحل عن طريق الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية وقسامة طاف في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. المحل في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
3. لإعداد البذرة PMCA (بي ار بي ^SC) الحل، التجانس مادة المعدية (الغدد الليمفاوية الدماغ والطحال و، الأنسجة الأخرى أو التربة الملوثة) إلى حل ث / ت 10٪ مع توفير المياه المثلجةص وقسامة الحل في 0.6 مل أنابيب microcentrifuge. المحل في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

3. إعداد الاحتياطي التحويل

1. تزن 0.5093 غرام من تريتون X-100 في قارورة سعة 50 مل (النتيجة هي تركيز 1٪ تريتون X النهائية لل-100) (سيغما الدريخ شركة محدودة؛ Steinheim، ألمانيا).
2. إضافة واحد مثبط البروتياز كاملة اللوحي (روش تشخيص محدودة؛ مانهايم، ألمانيا).
3. إضافة 0،0931 غرام من EDTA (وهذا سوف يؤدي إلى تركيز النهائي 5 ملم EDTA من) (مالينكرودت بيكر وشركة؛ فيليبسبورغ، NJ).
4. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم 1N.
5. التخزين المؤقت ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل مع الفوسفات في Dulbecco المالحة (DPBS) (Mediatech شركة؛ ماناساس، VA).
6. تصفية حل من خلال غشاء النيتروسليلوز 0،45 ميكرون مع فراغ جهاز الترشيح. ويمكن تخزين المخزن المؤقت في تحويل C ° 4 لمدة لا تزيد عن شهر واحد.

4. التضخيم من سلالات بريون طريق PMCA

1. يخفف من البذور PMCA إلى الركيزة PMCA في نسبة 01:20 (أي مزيج 5 ميكرولتر من البذور PMCA و 95 ميكرولتر من الركيزة PMCA) في أنبوب PCR. إزالة وتخزين قسامة 15 ميكرولتر في -80 درجة مئوية لمدة unsonicated السيطرة، وسيتم استخدام هذا التحكم لتحديد unsonicated التضخيم ^برأسية بي ار بي عن طريق الهضم بروتين (PK) K يليه تحليل الغربية (WB) وصمة عار. يمكن إنشاء رقابة إضافية من خلال وضع unsonicated الثانية 15 ميكرولتر قسامة في C ° 37 لمدة رد الفعل PMCA. مطلوب تقل عن ثلاث التكرار لأغراض إحصائية.
2. الموضوع ما تبقى من العينة (70 ميكرولتر) إلى جولة واحدة من PMCA كما هو مبين في الشكل 1، لوحة A. اهتز كل ساعة أنابيب 5 إلى تجنب تكثيف الماء على الغطاء القبة من الأنبوب PCR.
3. وينبغي نسج أنابيب العينة إلى أسفل وvortexed بلطف (والحرص على أن الحل لا تذهب إلى الحد الأقصى القبة) قبل فتح بعد أي إجراء لضمان homogeneity وتجنب التلوث المحتملة.
4. لPMCA مسلسل (sPMCA) من سلالات فترة حضانة قصيرة (أي HY TME، HaCWD، أو 263K)، يخفف من المواد sonicated في نسبة 1:20 من نقل 5 ميكرولتر من العينة sonicated من جولة واحدة في 95 ميكرولتر من المعافين جديدة الدماغ جناسة (الشكل 2، لوحة B).
5. لsPMCA من سلالات فترة حضانة طويلة (أي DY TME، 139H، 22CH، 22AH، أو ME7H)، يخفف من المواد sonicated في نسبة 1:1 من خلال نقل 50 ميكرولتر من العينة sonicated من جولة واحدة في 50 ميكرولتر من المعافين جديدة الدماغ جناسة (الشكل 2، لوحة B).
6. إزالة كل منهما من 15 ميكرولتر من خليط مأخوذة من sonicated المخفف سابقا (من الخطوات 4،4 أو 4.5) وتخزين واحد منهم في -80 ° C، والآخر عند 37 درجة مئوية (حلول التحكم unsonicated للجولة PMCA اثنين). إخضاع بقايا لجولة PMCA اثنين.
7. ويمكن تكرار هذا الإجراء إلى أجل غير مسمى. في المختبر لدينا، ونحنكان أداء ما يصل الى جولات PMCA خمسة عشر عاما، مع خصائص سلالة المتبقية دون تغيير.
8. PK هضم العينات. لWB نموذجية، 5 ميكرولتر من مزيج ميكرولتر 80 ميكروغرام / مل إلى 5 من عينة PK (هذا الحل سوف يكون تركيز النهائي من 40 PK ميكروغرام / مل) واحتضان في C ° 37 لمدة ساعة. إضافة 10 ميكرولتر من العازلة تحميل هلام. غلي هذا الحل لمدة 10 دقيقة. السماح للتهدئة والحل تحميل 10 ميكرولتر في هلام.
9. لحساب نجاح التضخيم إجراء تحليل على عينات WB-PK هضمها لتقدير كمية ^برأسية بي ار بي تضخيم عن طريق مقارنتها إما، والضوابط unsonicated ^20،21 الشكل 2، C أو لوحة لكميات معروفة من عسر الهضم PK-المؤتلف بي ار بي.

5. تجنب انتقال التلوث

الخطوات الحاسمة التي يتعين اتخاذها للحد من إنتشار التلوث وحدوث ايجابيات كاذبة بسبب تشكيل نوفو دي من المنتجات المقاومة للالبروتيني.

1. استخدام مجموعة من الأدوات مخصصة تشريح (ملقط أي ملاقط، مقصات) لجمع العينات لكل سلالة بريون.
2. قبل المجانسة العقول غير مصاب ليتم استخدامها باعتبارها الركيزة PMCA، امسح ماصات مع التبييض 1٪. نقع في رف أنبوب PCR sonicator، المجانسة الأنسجة، ورفوف التخزين أنبوب PCR مع التبييض 1٪ لمدة 10 دقيقة ويشطف جيدا بالماء المقطر.
3. تغطية منطقة العمل مع معتاد على الثمالة جديدة مختبر فيرسي الجافة في كل مرة عينة الجديد هو أن المتجانس، تجربة جديدة PMCA هو أن نكون مستعدين، أو عندما aliquoting بين جولات sPMCA.
4. استخدام قفازات جديدة في كل مرة يتم التعامل مع عينات جديدة (خصوصا عندما نقل مأخوذة بين جولات sPMCA).
5. استخدام رشقات نارية قصيرة صوتنة لكل دورة PMCA. دورات صوتنة ثوانى 5 جنبا إلى جنب مع الحضانة 10 دقيقة كافية لتضخيم البريونات بدون إنشاء من جديد ^{برأسية 1،20،21،23،24} بي ار بي. كما أظهرت مختبرات أخرى، وزيادةالوقت صوتنة، وزيادة السعة صوتنة، وتقديم عدد من الدورات PMCA يزيد من احتمال لبي ار بي دي نوفو تشكيل ^{برأسية 2.}

النتائج

ويستخدم البروتين التضخيم دوري misfolding (PMCA) لتضخيم بي ار بي ^برأسية في المختبر ^{7 و 12 و 14 و 19 و 24.} ويرد ناجحة التضخيم ^برأسية بي ار بي زيادة في كثافة الفرقة على البقع الغربية من بروتين بريون PK-مقاومة (المهاجرة ما بين 19 و 30 كيلو دالتون لسلالات الهامستر بري?...

Discussion

تحديات تضخيم بروتينات بريون المعدية هي فترات حضانة طويلة ونفقات في التجارب المجراة. هذه التقنية هي وسيلة PMCA فعالة من حيث التكلفة لتضخيم وكلاء بريون المعدية. وقد أكدت عدة مختبرات قدرة PMCA بدقة لتضخيم سلالات بريون في المختبر ^{7، 9، 12، 14، 19،24.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
كاشف / معدات	الصانع	القط. عدد
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbroeck الأنسجة المطحنة	Kontes	885000-0007
Neslab حمام EX-7 المياه	الحرارية الكترون	Neslab EX-7
0،2 أنبوب PCR شرائط مل	الحرارية العلمية	AB-0451
تريتون X-100	سيغما الدريتش	T9284-100ML
البروتياز المانع كاملة	روش	11 697 498 001
EDTA	JT بيكر	4040-00
DPBS	مالينكرودت بيكر Mediatech	21-031-CV
الحفاضات مختبر فيرسي الجافة	فيشر العلمية	14 206 28
Repti ثيرم سخان	حديقة الحيوان ميد المختبرات، وشركة	RH-4