プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

要約

タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はプリオン変換とひずみと種の壁の研究のためのin vitroアッセイである。また、プリオン検出アッセイとして使用することができます。

要約

プリオンは、動物とヒト^9,18で必然的に致命的な伝達性 ​​海綿状脳症（TSE）を引き起こす感染性病原体である。プリオンタンパク質は、2つの異なるアイソフォームは、非感染性宿主でエンコードされたタンパク質（PrP ^C）および感染質（PrP ^Sc）は、PrP ^Cの8の異常に折り畳まれたアイソフォームを持っています。

プリオン剤での作業の課題の1つは、ホスト¹³接種後の臨床徴候の開発の前に長い潜伏期間があります。これは、伝統的に長く、高価な動物のバイオアッセイ研究を命じた。さらに^、PrP Scの生化学的および生物物理学的特性はあまり彼らの異常なコンフォメーションと凝集状態に起因する特徴がある。

^PrP Sc ^は 試験管 ¹⁴ 内 ^の PrP ScへのPrP ^Cの種子変換することができます。 PMCAはアドバを取るのin vitro手法ですのPrP ^Cと^PrP Scの^種子19微量の過剰な量を含んでいるシステムから、加速度的に^、PrP Scのを大量に生成するために超音波処理およびインキュベーションサイクルを使用してこの能力のntage。この手法は^、効果的にプリオン株の干渉をエミュレートするためには、PrP ^Cから^PrP Scの変換の種および株特異性を再現するために、感染した組織、体液、および環境試料^6,7,16から^PrP Scの非常に低いレベルを増幅することが証明されています^23。

一貫性のある結果を生成し、それらの結果を定量化、汚染を最小限にするための提言を含め、本稿では詳細PMCAプロトコルを、。我々はまた、感染性プリオン株、プリオン株の干渉、及び環境中のプリオンの検出の発生と特性化など、いくつかのPMCAアプリケーションを、議論する。

プロトコル

1。機器の準備

1. Misonix 3000または37の温度を一定に保つためにサーモエレクトロンNeslab EX-7水槽（ニューイントン、ニューハンプシャー州）に接続Misonix 4000ソニケーター（ファーミングデール、ニューヨーク州）℃を使用するサーモサイエンティフィック（ウォルサム、マサチューセッツ州）から入手したドーム型のキャップ付き200μlの薄壁PCRチューブストリップのサンプルを超音波洗浄します。
2. 真新しいソニケーターは連続運転⁹の"慣らし"期間を必要とします。 2ヶ月のブレークイン期間は10に設定されて振幅レベルを持つ40秒の超音波処理バーストと10分インキュベーションサイクルで構成されています。一つはチタンプレートホーン（ 図1、パネルB）の表面全体に浸食を確認する必要があります。循環水は、チタンマイクロホーンの浸食による白濁を見ていきます。毎日この水を交換してください。
3. ^PrP Scの増幅は、マイクロプレートホーンを通して変化します。最高の^PrP Scの^増幅効率が内に取得することができるマイクロホーンの中心から5cmの半径（ 図1、パネルCを参照してください）。
4. PMCAの一周は144サイクルで構成されています。各サイクルは、5秒の超音波処理し、10分間のインキュベーションで構成されています。これは大体PMCAのラウンドごとに24時間に負わせるでしょう。
5. 超音波破砕機のコントロールパネルに表示されて超音波処理の電力出力は、超音波破砕機のラックと水浴から循環水の温度に存在するPCRチューブの数によって異なります。水は37℃で平衡化されていることを確認し、超音波処理装置のチューブラック（ 図1、パネルC）の30％以上を記入しない。マイクロプレートホーンを通してPCRチューブを広げた。 PCRチューブストリップ間の空の空間の少なくとも1つの行を持っている（ 図1、パネルC）ストリップあたり一緒に接続されていない4つ以上のチューブを許す。
6. 超音波処理の強度は、成功したプリオン株の増幅のために重要です。超音波処理しながら、パワー出力を持つように振幅を調整155〜170ワットの間の範囲。私たちの研究室では、電力レベルは、それぞれMisonix 3000およびMisonix 4000の6と7に設定されています。
7. 硬水の汚れを蓄積しないように水浴中で蒸留水を使用します。毎週この水を交換してください。インキュベーションおよび超音波処理サイクル中に、凝縮水は、マイクロプレートホーンのふたの内側に発生します。 図1に示すように、結露を避けるために、パネルA、超音波破砕機の筐体ボックスの上部に小さな水槽の熱·アタッチ·パッド

2。サンプルの準備

1. 動物を含むすべての手順は、クレイトン大学施設内動物のケアと使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する指針に準拠した。任意の組織採取する前に、動物を麻酔とtranscardially氷冷リン酸を用いて灌流しなければなりませんが、脳から血液を除去するとの阻害を回避するために、pH7.4の5mMのEDTAとの緩衝生理食塩水血液⁷によるPMCA反応。無菌技術を用いて急速に動物組織を採取し、それぞれのプリオン株のための専用の解剖ツールを持っている。切開した後、1.5 mlのマイクロチューブに組織を置き、フラッシュがドライアイスの上に凍結し、-80℃で保管して℃を均質化するまで。
2. PMCA基板（PrP ^Cの ）溶液を調製し、Tenbroeck組織グラインダーを用いて氷冷変換バッファで10％重量/体積（w / v）溶液（パート3を参照）に感染ハムスター脳（国連BH）ホモジナイズする。ホモジナイズしながら、溶液の過剰な泡立ちを避けるために、グラインダーの内側に空気を入れないように注意してください。 30秒、アリコートを1.5ml微量遠心チューブの上清を500×gで遠心分離することによって解決策を明らかにする。 -80℃で保存さらなる使用まで。
3. PMCAシード^（PrP Scの）溶液を調製し、氷冷ウォートを10％（w / v）の溶液中に感染性物質（脳、脾臓、リンパ節、他の組織または汚染された土壌）をホモジナイズrとアリコート0.6ミリリットルマイクロチューブ内の溶液。 -80℃で保存さらなる使用まで。

3。変換バッファの準備

1. 50mlのメスフラスコ（結果はトリトンX-100の1％の最終濃度である）（;シュタインハイム、ドイツのSigma-Aldrich社）でのTriton X-100の0.5093グラムの重量を量る。
2. 1コンプリートプロテアーゼインヒビタータブレット（;マンハイム、ドイツロシュ·ダイアグノスティックス社）を追加します。
3. EDTAの0.0931グラム（これはEDTAの5mMの最終濃度になります）（;フィリップスバーグ、ニュージャージー州マリンクロット·ベイカー社）を追加します。
4. 1N NaOHでpHを7.4に調整してください。
5. ダルベッコのリン酸50mlに音量を調節するには（;マナッサスメディアテック株式会社）（DPBS）緩衝生理食塩水。
6. 真空ろ過装置と0.45μmのニトロセルロース膜を通して溶液をフィルタリングします。変換バッファが一箇月以内に4℃で保存することができます。

4。 PMCAを使用したプリオン株の増幅

1. PCRチューブに1:20の比率（ すなわちミックス PMCAシードの5μlとPMCA基板の95μl）をPMCAで基板にPMCAシードを希釈します。 -80℃で15μlのアリコート°unsonicated制御のためのCを削除して保存すること。このunsonicatedコントロールはウエスタンブロット（WB）の分析に続いてプロテイナーゼK（PK）消化により^PrP Scの^増幅を定量化するために使用されます。追加unsonicated制御はPMCA反応の持続時間のために37℃で第二15μlのアリコートを配置することによって生成することができます。 3回繰り返しの最小値は統計上の目的のために必要です。
2. 主題図1に示すように、PMCAの1ラウンドにサンプルの残り（70μl）を、パネルA.シェイクチューブPCRチューブのドーム型キャップの結露を避けるために、すべての5時間。
3. サンプルのチューブがhomog確保するために、任意の手順の後に開く前に（溶液はドーム形キャップに行っていないことに注意して）スピンダウンし、軽くボルテックスして下さいeneityと潜在的な汚染を避ける。
4. 短い潜伏期間株（ すなわち 、HY、TME、HaCWD、または263K）のシリアルPMCA（sPMCA）では、新鮮な未感染の95μLにラウンド1からの超音波処理したサンプルの5μlを転送することにより、1:20の割合で超音波処理した材料を希釈脳ホモジネート（ 図2、パネルB）。
5. 潜伏期間が長い株（ すなわち DY TME、139H、22CH、22AH、またはME7H）のsPMCAについては、感染していない新鮮な50μlのにラウンド1からの超音波処理したサンプル50μlを転送することにより、1:1の割合で超音波処理した材料を希釈脳ホモジネート（ 図2、パネルB）。
6. 以前に希釈混合超音波処理（ステップ4.4または4.5）から215μlのアリコートを取り出して、-80℃で、それらのいずれかを格納し、37℃と他の℃（PMCAラウンド2用unsonicated制御ソリューション）。 PMCAラウンド2への残党を施す。
7. この手順は、無限に繰り返すことができます。私たちの研究室では、我々ひずみ特性は変わらずで、PMCA 15ラウンドまで行ってきた。
8. PKはサンプルを消化。典型的なWBのために、サンプルを5μl（この溶液は、40μg/ mlの最終濃度のPKを持つことになります）にPKを80μg/ mlの5μlを混合し、37℃で1時間インキュベートする。ゲルローディング緩衝液10μlを追加します。 10分間この溶液を沸騰。解決策は冷えるとゲルに10μlをロードしましょう​​。
9. 増幅の成功を計算するには、どちらかにそれらを比較することによって増幅された^PrP Scの量を推定するために、PK-消化サンプル、unsonicatedコントロール^20,21 図2、パネルCまたは組換えPK-消化されていない既知の量に上のWB分析を実行プリオン。

5。クロスコンタミネーションの回避

重要なステップは、クロスコンタミネーション及びプロテアーゼ耐性製品の de novo形成に起因する偽陽性の発生を最小限に抑えるように注意する必要があります。

1. 各プリオン株のためのサンプル収集のための解剖ツール専用セット（ すなわち鉗子、ピンセット、はさみ）を使用します。
2. PMCA基板として使用されるために感染していない脳を均質化する前に、1％の漂白剤でピペットを拭いてください。 10分間1％の漂白剤で超音波処理装置のPCRチューブラック、組織ホモジナイザー、及びPCRチューブの収納ラックを浸して、蒸留水で十分に洗い流してください。
3. 新しいサンプルをホモジナイズするたびに新鮮なVersi-ドライラボ浸すと作業領域をカバーする、新しいPMCA実験が準備されるとき、またはsPMCAのラウンドの間に小分け。
4. 新しい手袋に新しいサンプルが（sPMCAラウンド間のアリコートを転送する場合は特に）に処理されるたびに使用してください。
5. 各PMCAサイクルの短い超音波処理のバーストを使用しています。 10分間のインキュベーションを組み合わせる5秒の超音波処理のサイクルは 、de novo ^の PrP Sc ^{1,20,21,23,24を}生成せず^にプリオンを増幅するのに十分である。他の研究室が示したように、増加超音波処理時間は、超音波の振幅を増加させ、PMCAのサイクル数を拡張することはde novoの ^PrP Scの形成²の確率を増加させる。

結果

タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はin vitroで ⁷ におけるPrP ^{Scは、12、14、19、24を}増幅するために使用されます。 図3に示すように、成功した^PrP Scの増幅^が PK耐性プリオンタンパク質（ハムスター由来のプリオン株の19および30kDaの間の移行）のウエスタンブロットのバンド強度の増加によって示されている

ディスカッション

感染性プリオンタンパク質を増幅するという課題は、長い潜伏期間および in vivo実験での経費です。 PMCA技術は感染性プリオンエージェントを増幅するための費用効果的な手段です。いくつかの研究室では、正確に試験管 ^{7、9、12、14、19,24} のプリオン株を増幅するPMCAの能力を確認しています。

プリオン病は、種間で送信することができ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/機器	メーカー	猫。数
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbroeckティッシュグラインダー	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7ウォーターバス	サーモエレクトロン	Neslab EX-7
0.2ミリリットルのPCRチューブストリップ	サーモサイエンティフィック	AB-0451
トリトンX-100	シグマアルドリッチ	T9284-100ML
コンプリートプロテアーゼインヒビター	ロッシュ	11 697 498 001
EDTAを	JTベーカー	4040から00
DPBS	マリンクロット·ベイカーメディアテック	21から031-CV
Versi-ドライラボSoakers	フィッシャー·サイエンティフィック	14 206 28
REPTIサームヒーター	動物園メッド·ラボラトリーズ社	RH-4