Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Özet

Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) Prion dönüşüm ve zorlanma ve tür engellerin çalışma için bir in vitro testtir. Aynı zamanda, bir prion saptama sistemi olarak da kullanılabilir.

Özet

Prionlar hayvan ve insanlarda ^9,18 olarak kaçınılmaz ölümcül bulaşıcı süngerimsi ensefalopati (TSE) neden bulaşıcı ajanlardır. Prion proteini iki farklı izoformu, bulaşıcı olmayan ana-kodlanmış protein (PrP ^C) ve enfeksiyöz protein (PrP ^Sc), PrP ^{C 8} anormal katlanmış izoformu vardır.

Prion ajanlar ile çalışan zorluklardan biri öncesinde ev sahibi inokülasyon ¹³ sonrasında klinik bulguların gelişimi uzun bir kuluçka dönemidir. Bu geleneksel olarak uzun ve pahalı hayvan biyoassay çalışmaları görevlendirdi. Ayrıca, PrP ^Sc biyokimyasal ve biyofiziksel özelliklere kötü onların sıradışı konformasyon ve agregasyonu devletler nedeniyle karakterize edilir.

PrP ^Sc in vitro ¹⁴ PrP ^Sc PrP ^C tohum dönüşüm yapabilirsiniz. PMCA Adva alır bir in vitro bir tekniktirPrP ^C ve PrP ^Sc tohum ¹⁹ dakika miktarları aşan miktarda içeren bir sistem, giderek artan bir oranda, PrP ^Sc büyük miktarlarda üretmek için sonication ve inkübasyon döngüleri kullanarak bu yeteneği ntage. Bu ^teknik, etkili prion zorlanma girişime taklit etmek, PrP ^C PrP ^Sc dönüştürme türleri ve gerilme özgüllük özetlemek için, ve enfekte dokuları, sıvıları ve çevresel örneklerde ^6,7,16 gelen PrP ^Sc çok düşük seviyelere yükseltmek için kanıtlanmıştır ^23.

, Kontaminasyonu en aza tutarlı sonuçlar üreten, ve bu sonuçların ölçülmesi için öneriler içeren bu kağıdı ayrıntıları PMCA protokolü. Biz de bulaşıcı prion suşları, prion zorlanma girişim, ve çevre Prionların algılama üretimi ve karakterizasyonu gibi çeşitli PMCA uygulamaları tartışmak.

Protokol

1. Ekipman hazırlanması

1. Bir Misonix 3000 veya 37 sabit bir sıcaklıkta tutmak için bir Thermo Electron NESLAB EX-7 su banyosu (Newington, NH) bağlı Misonix 4000 sonikatör (Farmingdale, NY) ° C kullanın Thermo Scientific (Waltham, MA) dan elde edilen kubbeli kapak ile 200 ul ince duvarlı tüp PCR şeritler örnekleri sonikasyon.
2. Yepyeni sonikatör sürekli çalışma ⁹ bir "soygun" dönemi gerektirir. Bir iki ay aradan-in dönemi 10 ayarlanmış genlik seviyesi ile 40 saniye sonication patlama ve 10 dakikalık inkübasyon döngüleri oluşur. Bir titanyum mikroplaka boynuz (Şekil 1, panel B) yüzeyi boyunca erozyon uyulması gerekir. Dolaşan su titanyum mikroplak boynuz erozyon nedeniyle beyaz bulanık görünecektir. Günlük bu suyu değiştirin.
3. PrP ^Sc amplifikasyon mikroplak boynuz boyunca değişir. En iyi PrP ^Sc amplifikasyon verim içinde elde edilebilirmikroplak boynuz (Şekil 1, panel C'ye bakınız) merkezine 5 cm yarıçapında.
4. PMCA biri yuvarlak 144 döngüleri oluşur. Her döngü 5 saniye ile 10 dakika sonikasyon inkübasyondan oluşur. Bu kabaca PMCA yuvarlak başına 24 hr gerektirecektir.
5. Sonikatör kontrol panelinde görüntülenen sonication ve güç çıkışı, sonikatör en raf ve su banyosundan dolaşan su sıcaklığı mevcut PCR tüpleri sayısına göre değişir. Su 37 ° C'de dengelenmiş olduğundan emin olun, ve sonikatör en tüp raf (Şekil 1, panel C)% 30'dan fazla doldurmayın. Mikroplak boynuzu ile PCR tüpleri duyurun. PCR tüp stripleri arasındaki boş alan en az bir satır var ve (Şekil 1, panel C) şerit başına birbirine bağlı en fazla dört tüpler sağlar.
6. Sonikasyon gücü başarılı bir prion suşu amplifikasyonu için kritik önem taşımaktadır. Sonicating iken, bir güç çıkışı için genlik ayarlamak155 ~ 170 watt arasında değişen. Laboratuvarımızda güç seviyesi sırasıyla altı ve Misonix 3000 ve Misonix 4000 için yedi, ayarlanır.
7. Sert su lekeleri birikmesini önlemek için su banyosunda distile su kullanın. Bu su haftalık değiştirin. Kuluçka ve sonication çevrimleri sırasında, su yoğuşması mikroplak korna kapağı içinde meydana gelecek. Şekil 1, panel A'da gösterildiği gibi yoğunlaşmayı önlemek için, sonikatör muhafazası kutusunun üstüne küçük bir akvaryumda ısı pedi takın

2. Hazırlanıyor

1. Hayvanların kullanıldığı bütün işlemler Creighton Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan ve Kullanım Kurulu ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ile uyumlu yapılmıştır. Herhangi bir doku toplama önce, hayvan anestetize ve transkardiyal buz gibi soğuk fosfat ile perfüze olmalıdır beyin kan kaldırmak ve inhibisyonu önlemek için pH 7.4, 5 mM EDTA ile tamponlanmış tuz çözeltisiKan ⁷ tarafından PMCA reaksiyon. Aseptik teknik kullanarak hızla hayvan dokuları toplayın ve her prion suşu için özel diseksiyon araçları vardır. Diseksiyonu sonra, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpünün içindeki doku yerleştirmek, flaş kuru buz üzerinde dondurma ve -80 saklayın ° C homojenizasyon kadar.
2. PMCA alt tabaka (PrP ^C) çözelti hazırlamak için, bir Tenbroeck doku öğütücü kullanılarak buz gibi soğuk tampon dönüştürme ile bir% 10 ağırlık / hacim (ağırlık / hacim) çözeltisi (parça 3) için bir etkilenmemiş beyin hamsteri (BM BH) homojen hale getirilir. Homojenleştirici iken, çözüm köpük aşırı önlemek için taşlama içine hava almak için dikkatli olun. 30 sn ve kısım 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine süpernatant için 500 xg'de santrifüj çözümü netleştirin. -80 ° C'de saklayın, daha sonra kullanmak kadar.
3. PMCA tohum (PrP ^Sc) çözeltisi hazırlamak için, buz Wate ile% 10 w / v çözüm bulaşıcı bir malzeme (beyin, dalak, lenf düğümleri, diğer dokulara veya kontamine toprak) homojenize0,6 ml mikrosantrifüj tüpleri r ve kısım çözüm. -80 ° C'de saklayın, daha sonra kullanmak kadar.

3. Dönüşüm Tampon Hazırlanması

1. 50 ml'lik bir balon jojeye (sonuç Triton X-100,% 1 son konsantrasyon) (; Steinheim, Almanya Sigma-Aldrich GmbH) içinde Triton X-100, 0,5093 g tartılır.
2. Biri Komple Proteaz İnhibitör Tablet (; Mannheim, Almanya Roche Diagnostics GmbH) ekleyin.
3. EDTA 0,0931 g (bu EDTA, 5 mM nihai konsantrasyon neden olur (), Phillipsburg, NJ Mallinckrodt Baker, Inc) ekleyin.
4. 1N NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın.
5. Dulbecco Fosfat ile 50 ml hacim ayarlama (; Manassas, VA Mediatech Inc) (DPBS) Tamponlu Tuzlu.
6. Bir vakumlu filtrasyon cihazı ile bir 0.45 mikron nitroselüloz membran ile çözelti filtre. Dönüşüm tampon fazla bir ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanabilir.

4. PMCA kullanma Prion Suşlarının Amplifikasyon

1. PCR tüp içine 1:20 oranında (PMCA tohum ve PMCA alt tabaka 95 ul, yani karışım 5 ul) de PMCA alt tabaka içine PMCA tohum seyreltilir. -80 15 ul kısım çıkarın ve saklayın ° unsonicated kontrolü için C; Bu unsonicated kontrolü Western Blot (WB) analizi takip proteinaz K (PK) sindirim yoluyla PrP ^Sc amplifikasyon ölçmek için kullanılacaktır. İlave bir kontrol unsonicated PMCA reaksiyon süresi boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir ikinci 15 ul alikot yerleştirilmesi ile oluşturulur olabilir. Üç tekrarları en az istatistiki amaçlar için gereklidir.
2. Konu Şekil 1 ile ilgili olarak tarif PMCA bir tur için örnek geri kalanı (70 ul) eklendi Panel A. çalkalayın tüpler PCR tüpün kubbeli kapak üzerinde su yoğuşmayı önlemek için her 5 saat.
3. Numune tüpler aşağı döndü ve yavaşça homog sağlamak için herhangi bir işlem sonrası açmadan önce (çözüm kubbeli kapağı girmeyiz dikkatli olmak) vortekslenerek edilmelidireneity ve potansiyel kontaminasyon.
4. Kısa bir kuluçka süresi suşları (örneğin, HY TME HaCWD, ya da 263K) seri PMCA (sPMCA) için taze enfekte olmamış 95 ul içine yuvarlak bir ikinci sonicated örnek 5 ul transfer ederek 1:20 oranında sonicated madde seyreltik beyin homojenatı (Şekil 2, Panel B).
5. Uzun kuluçka süresi suşları (örneğin, DY TME, 139H, 22CH, 22AH, ya da ME7H) arasında sPMCA için, enfekte olmamış taze 50 ul içine yuvarlak bir ikinci sonicated örnek 50 ul transfer ederek 1:1 oranında sonicated madde seyreltik beyin homojenatı (Şekil 2, Panel B).
6. Önceden seyreltilmiş sonicated karışımı (adımlar 4,4 ya da 4,5) iki alikotları 15 ul çıkarın ve -80 az biri depolamak 37 ° C'de ve diğer ° C (PMCA boyunca iki unsonicated kontrol çözümleri). Bir PMCA yuvarlak iki kalıntıları koşuluyla.
7. Bu prosedür, süresiz olarak tekrar edilebilir. Laboratuvarımızda, bizdeğişmeden kalan zorlanma özellikleri ile, onbeş PMCA mermi kadar gerçekleştirdik.
8. PK örnekleri sindirimi. Tipik bir DB, 5 örnek PK 80 ug / ml ila 5 ul (bu çözelti 40 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyon PK sahip olacaktır) ul ve bir saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir karıştırın. Jel yükleme tamponu 10 ul ekle. 10 dakika için bu çözelti kaynatılır. Çözüm soğumasını ve jel içine 10 ul yük olsun.
9. Amplifikasyon başarı hesaplamak için ya bunları karşılaştırarak amplifiye PrP ^Sc miktarını tahmin etmek için PK-sindirilmiş örnekler üzerinde WB analizi gerçekleştirmek, unsonicated kontrolleri ^20,21 Şekil 2, Panel C veya bilinen miktarda rekombinant PK-sindirilmemiş PrP.

5. Çapraz bulaşma kaçınmak

Kritik adımlar çapraz kontaminasyon ve proteaz dayanıklı ürünler de novo oluşumu nedeniyle yanlış pozitif oluşumunu en aza indirmek için alınması gerekir.

1. Her prion suşu için numune toplama için diseksiyon araçları özel bir kümesi (yani forseps, cımbız, makas) kullanın.
2. PMCA bir alt tabaka olarak kullanılmak üzere etkilenmemiş beyin homojenleştirme öncesinde,% 1 çamaşır suyu ile pipetler temizleyin. 10 dakika süreyle% 1 çamaşır suyu ile sonikatör en PCR tüp raf, doku homojenizatör ve PCR tüp depolama rafları ıslatın ve distile su ile iyice durulayın.
3. Bir taze Versi-kuru Lab Soaker yeni bir numune homojenize edilmesi için her zaman birlikte çalışma alanı Kapak, bir yeni deneme PMCA hazırlanması için, ya da sPMCA mermi arasında aliquoting.
4. Yeni eldivenler yeni örnekler (sPMCA mermi arasında alikotları aktarırken özellikle) ele alınır, her zaman kullanın.
5. Her PMCA döngü için kısa sonication patlamaları kullanın. 10 dakika inkübasyon ile birlikte 5 saniye sonication döngüleri de novo PrP ^{Sc 1,20,21,23,24} oluşturmadan prionlar yükseltmek için yeterlidir. Diğer laboratuarlar gösterildiği gibi, artansonikasyon zaman, sonication genlik artırmak ve PMCA döngü sayısı uzanan de novo PrP ^Sc oluşumu ² için olasılığını arttırmaktadır.

Sonuçlar

Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) İn vitro ^{7 PrP, Sc, 12, 14, 19, 24,} yükseltmek için kullanılır. Başarılı amplifikasyon PrP ^Sc, Şekil 3'te gösterildiği gibi PK-dirençli prion proteini (hamsterden türetilmiş prion suşları için 19 ila 30 kDa geçiş) Western blot üzerinde bant yoğunluğunda bir artış ile gösterilmiştir. Kendi bant yoğunluk artışı sonra PMCA PK-dirençli PrP ^Sc malzeme amplifika...

Tartışmalar

Yükseltici bulaşıcı prion proteinlerin Zorluklar in vivo deneyler uzun inkübasyon süreleri ve giderleri vardır. PMCA tekniği bulaşıcı prion ajanları güçlendirmek için uygun maliyetli bir yoludur. Birkaç laboratuar doğru vitro ^{7, 9, 12, 14, 19,24} içinde prion suşları yükseltmek için PMCA yeteneğini doğruladı.

Prion hastalıkları türler arasında aktarılabilir. Bessen ve Marsh etkili iki ayrı hamsterden türetilmiş prion suşl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Ekipman	Üretici	Kedi. Numara
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbroeck Doku Öğütücü	Kontes	885000-0007
NESLAB EX-7 Su Banyosu	Thermo Electron	NESLAB EX-7
0.2 ml PCR Tüp Şeritler	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Komple Proteaz İnhibitör	Roche	11 697 498 001
EDTA	JT Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Kuru Lab soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Isıtıcı	Zoo Med Laboratories, Inc	RH-4