Protein Misfolding Cyclic Amplification des prions

Résumé

Repliement des protéines amplification cyclique (PMCA) est un test in vitro pour l'étude de la conversion du prion et les obstacles souche et l'espèce. Il peut également être utilisé comme un test de détection de prion.

Résumé

Les prions sont des agents infectieux qui causent l'encéphalopathie spongiforme inévitablement fatale transmissible (EST) chez les animaux et les humains ^9,18. La protéine prion présente deux isoformes distincts, le non-infectieuse codée par l'hôte de protéine (PrP ^C) et la protéine infectieuse (PrP ^Sc), une isoforme anormale pliée de PrP ^{C 8.}

L'un des défis de travailler avec les prions est la longue période d'incubation avant l'apparition des signes cliniques qui suivent le ¹³ inoculation d'accueil. Cette traditionnellement chargé longs et coûteux essais biologiques d'origine animale. En outre, les propriétés biochimiques et biophysiques de la PrP ^Sc sont mal caractérisées en raison de leur conformation inhabituelle et états d'agrégation.

PrP ^Sc peut engendrer la conversion de PrP ^C en PrP ^Sc in vitro ^14. PMCA est une technique in vitro qui prend avantage de cette capacité en utilisant les cycles de sonication et d'incubation pour produire de grandes quantités de PrP ^Sc, à une vitesse accélérée, à partir d'un système contenant des quantités excessives de PrP ^C et des quantités infimes de la graine PrP ^{Sc 19.} Cette technique s'est avérée efficace pour résumer la spécificité d'espèce et la souche de PrP ^Sc conversion de PrP ^C, à imiter les interférences souche de prion, et d'amplifier de très faibles niveaux de PrP ^Sc dans les tissus infectés, fluides, et les échantillons environnementaux ^{6,7,16, 23.}

Cet article détaille le protocole de PMCA, y compris des recommandations pour minimiser la contamination, des résultats constants, et de quantifier ces résultats. Nous discutons également plusieurs applications PMCA, notamment la production et la caractérisation des souches de prions infectieux, les interférences souche de prion, et la détection des prions dans l'environnement.

Protocole

1. Préparation de l'équipement

1. Utilisez un 3000 Misonix ou Misonix 4000 sonicateur (Farmingdale, NY) relié à un bain Thermo Electron Neslab EX-7 de l'eau (Newington, NH) pour maintenir une température constante de 37 ° C. Soniquer les échantillons dans 200 pi à parois minces barrettes de tubes PCR avec bouchons bombés obtenus à partir de Thermo Scientific (Waltham, MA).
2. Un appareil à ultrasons nouvelle marque nécessite un "break-in" période de fonctionnement continu ^9. Une rupture dans le délai de deux mois se compose d'une salve sonication de 40 sec et cycles d'incubation de 10 minutes avec le niveau d'amplitude fixé à 10. On devrait observer l'érosion sur toute la surface de la corne de titane microplaque (figure 1, partie B). La circulation d'eau se penchera trouble blanche due à l'érosion de la corne de titane microplaque. Remplacer cette eau tous les jours.
3. L'amplification de la PrP ^Sc varie tout au long de la corne de microplaques. La meilleure efficacité PrP ^Sc d'amplification peut être obtenu dansun rayon de 5 cm du centre de la corne de microplaques (voir la figure 1, partie C).
4. Un tour de PMCA se compose 144 cycles. Chaque cycle se compose de 5 sonication sec et 10 min d'incubation. Ce sera à peu près entraînent à 24 h par tour de PMCA.
5. La puissance du moteur de sonication, affiché sur le panneau de commande de l'appareil à ultrasons, varie avec le nombre de tubes PCR présentes dans la grille de sonication et la température de l'eau circulant dans le bain d'eau. Assurez-vous que l'eau est équilibrée à 37 ° C, et ne remplissent pas plus de 30% du portoir du sonicateur (figure 1, partie C). Répartir les tubes PCR à travers la corne de microplaques. Avoir au moins une rangée d'espace vide entre les barrettes de tubes PCR et de permettre au plus quatre tubes reliés entre eux par bande (figure 1, partie C).
6. La force de sonication est essentiel pour une amplification souche de prion succès. Bien sonication, régler l'amplitude d'avoir une puissance de sortiecomprise entre 155 ~ 170 watts. Dans notre laboratoire, le niveau de puissance est réglé sur six et sept pour 3000 et Misonix Misonix 4000, respectivement.
7. Utilisez de l'eau distillée dans le bain d'eau pour éviter l'accumulation des taches d'eau dure. Remplacer cette semaine de l'eau. Au cours des cycles d'incubation et sonication, l'eau de condensation se produit à l'intérieur du couvercle corne de microplaques. Pour éviter la condensation, fixez les tampons petit aquarium de la chaleur vers le haut de la boîte de l'enceinte de l'appareil à ultrasons comme le montre la figure 1, le panneau A.

2. Préparation des échantillons

1. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par les soins de l'Université Creighton animaux institutionnel et l'utilisation comité et se conformer aux Lignes pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Avant tout prélèvement de tissus, l'animal doit être anesthésié et transcardiaque perfusé à l'aide glacée phosphate de solution saline tamponnée avec EDTA 5 mM à pH 7,4 pour enlever le sang du cerveau et d'éviter l'inhibition de laRéaction PMCA par le sang ^7. Recueillir les tissus animaux rapidement en utilisant une technique aseptique et des outils de dissection dédiées pour chaque souche de prion. Après dissection, placer le tissu dans un tube de 1,5 ml, flash à geler sur de la glace sèche, et de le stocker à -80 ° C jusqu'à homogénéisation.
2. Pour préparer le substrat PMCA (PrP ^C) solution, homogénéiser un cerveau de hamster infecté (ONU BH) à un 10% en poids / volume (p / v) avec un tampon de conversion glacée (voir partie 3) en utilisant un broyeur de tissu Tenbroeck. Bien homogénéiser, veillez à ne pas prendre l'air à l'intérieur du broyeur pour éviter un moussage excessif de la solution. Clarifier la solution par centrifugation à 500 xg pendant 30 sec et aliquote du surnageant dans des tubes de 1,5 ml microtubes. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
3. Pour préparer la graine PMCA (PrP ^Sc) solution, homogénéiser une matière infectieuse (ganglions lymphatiques du cerveau, de la rate, d'autres tissus, ou des sols contaminés) à un 10% p / v de solution avec de la glace froide water et aliquote de la solution dans 0,6 ml microtubes. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

3. Préparation du tampon de conversion

1. Peser 0,5093 g de Triton X-100 dans une fiole jaugée de 50 ml (résultat est une concentration finale de 1% de Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne).
2. Ajoutez un inhibiteur de la protéase complète Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne).
3. Ajouter 0,0931 g d'EDTA (cela se traduira par une concentration de 5 mM final de l'EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc; Phillipsburg, NJ).
4. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 1N.
5. Réglez le volume à 50 ml avec de phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) (Mediatech Inc; Manassas, VA).
6. Filtrer la solution à travers une membrane de nitrocellulose de 0,45 pm avec un appareil de filtration sous vide. Le tampon de conversion peut être conservé à 4 ° C pendant pas plus d'un mois.

4. L'amplification des souches de prion Utilisation PMCA

1. Diluer la graine PMCA dans le substrat PMCA dans un rapport de 1:20 (mélange soit 5 ul de la graine PMCA et 95 ul du substrat PMCA) dans un tube PCR. Retirez et rangez une aliquote de 15 ul à -80 ° C pour le contrôle unsonicated, ce contrôle unsonicated sera utilisée pour quantifier l'amplification PrP ^Sc par la protéinase K (PK) digestion suivie par Western blot (WB) analyse. Une commande supplémentaire unsonicated peut être généré en plaçant une seconde aliquote 15 ul à 37 ° C pendant toute la durée de la réaction PMCA. Un minimum de trois répétitions est nécessaire à des fins statistiques.
2. Sous réserve du reste de l'échantillon (70 pl) pour une tour de PMCA comme représenté sur la figure 1, partie A. Agiter chaque tube 5 h afin d'éviter la condensation de l'eau sur la coiffe en forme de dôme du tube de PCR.
3. Tubes de l'échantillon doit être centrifugé et délicatement vortex (en faisant attention que la solution ne vont pas dans le bouchon en forme de dôme) avant d'ouvrir après toute procédure visant à assurer homogeneity et éviter toute contamination.
4. Pour série PMCA (sPMCA) des souches période d'incubation courte (c.-à-HY TME, HaCWD ou 263K), diluer la matière traitée aux ultrasons dans un rapport de 1:20 en transférant 5 pl de l'échantillon soniqué de première ronde dans 95 ul de frais non infecté homogénat de cerveau (figure 2, partie B).
5. Pour sPMCA de longues souches période d'incubation (c.-à-DY TME, 139H, 22CH, 22AH, ou ME7H), diluer la matière traitée aux ultrasons dans un rapport de 1:1 en transférant 50 ul de l'échantillon soniqué de première ronde dans 50 pl de frais non infecté homogénat de cerveau (figure 2, partie B).
6. Retirez deux 15 aliquotes du mélange préalablement dilué soniqué (des étapes 4.4 ou 4.5) et stocker l'un d'eux à -80 ° C et l'autre à 37 ° C (solutions de contrôle unsonicated pour PMCA deuxième tour). Soumettre les restes d'une tour PMCA deux.
7. Cette procédure peut être répétée indéfiniment. Dans notre laboratoire, nousont effectué jusqu'à quinze rounds PMCA, avec les propriétés de déformation reste inchangée.
8. PK digérer les échantillons. Pour un type WB, mélanger 5 pl de PK 80 pg / ml à 5 ​​pl de l'échantillon (cette solution a une concentration finale de PK 40 pg / ml) et incuber à 37 ° C pendant une heure. Ajouter 10 ul de tampon de charge de gel. Faire bouillir cette solution pendant 10 min. Laisser la solution refroidir et charger 10 pi dans le gel.
9. Pour calculer le succès de l'amplification d'effectuer une analyse sur les échantillons WB PK-digérés pour estimer la quantité de PrP ^Sc amplifié en les comparant à deux, les contrôles unsonicated ^20,21 graphique 2, partie C ou en un montant connu de PK-digérées recombinant PrP.

5. Éviter la contamination croisée

Les étapes critiques doivent être prises pour réduire au minimum la contamination croisée et l'apparition de faux positifs dus à la formation de novo de produits résistants à la protéase.

1. Utilisez un ensemble dédié d'outils de dissection (c.-à-pinces, pinces à épiler, ciseaux) pour la collecte de l'échantillon pour chaque souche de prion.
2. Avant d'homogénéisation cerveaux sains pour être utilisé comme un substrat PMCA, essuyez les pipettes d'eau de Javel à 1%. Faire tremper le support du tube de PCR sonicateur, homogénéisateurs de tissus, et des supports de stockage de tubes PCR avec l'eau de Javel à 1% pendant 10 minutes et rincer abondamment avec de l'eau distillée.
3. Couvrir la zone de travail avec un remous Lab Versi-Dry frais chaque fois qu'un nouvel échantillon doit être homogénéisé, une nouvelle expérience PMCA est d'être prêt, ou lorsque aliquotage entre les rounds sPMCA.
4. Utiliser des gants chaque fois de nouvelles de nouveaux échantillons sont traités (en particulier lors du transfert entre les rounds aliquotes sPMCA).
5. Utiliser des salves courtes sonication pour chaque cycle de PMCA. Cycles de 5 sonication sec combiné avec 10 minutes d'incubation est suffisant pour amplifier les prions sans générer de novo PrP ^{Sc 1,20,21,23,24.} Comme d'autres laboratoires ont montré, en augmentant latemps de sonication, en augmentant l'amplitude de sonication, et s'étendant le nombre de cycles augmente la probabilité PMCA de novo de la PrP ^Sc formation ^2.

Résultats

Amplification cyclique protéine repliement (PMCA) est utilisée pour amplifier la PrP ^Sc in vitro ^{7, 12, 14, 19, 24.} Un succès PrP ^Sc amplification est démontré par une augmentation de l'intensité des bandes sur Western blot de la protéine prion PK-résistante (migration entre 19 et 30 kDa pour souches de prion de hamster dérivés), comme illustré à la figure 3. L'augmentation de l'intensité de la bande après PMCA indique l'amplificati...

Discussion

Les défis de amplification protéines prions infectieuses sont les longues périodes d'incubation et les frais de dans des expériences in vivo. La technique PMCA est un moyen rentable pour amplifier les prions infectieux. Plusieurs laboratoires ont confirmé la capacité de PMCA avec précision amplifier souches de prion in vitro ^{7, 9, 12, 14, 19,24.}

Les maladies à prions peuvent être transmis entre les espèces. Bessen et Marsh ont effectivement...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactif / équipement	Fabricant	Cat. Nombre
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Grinder tissus Tenbroeck	Kontes	885000-0007
Bain Neslab EX-7 Eau	Thermo Electron	Neslab EX-7
0,2 ml Bandes de tubes PCR	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Inhibiteur de la protéase complète	Roche	11 697 498 001
EDTA	JT Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Soakers Lab Versi-Dry	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Chauffage	Zoo Med Laboratories, Inc	RH-4