Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica

Resumen

Misfolding proteína amplificación cíclica (EPCP) es un ensayo in vitro para el estudio de la conversión de priones y barreras cepa y especie. También se puede utilizar como un ensayo de detección de priones.

Resumen

Los priones son los agentes infecciosos causantes de la encefalopatía espongiforme transmisible inevitablemente fatal (EET) en los animales y los seres humanos ^9,18. La proteína prión tiene dos isoformas distintas, la no infecciosa proteína codificada por el hospedador (PrP ^C) y la proteína infecciosa (PrP ^Sc), una isoforma anormal de PrP plegado en ^{C 8.}

Uno de los retos de trabajar con agentes de priones es el largo período de incubación antes de la aparición de los signos clínicos después de la inoculación de acogida ^13. Este mandato tradicionalmente los estudios en animales largos y caros de bioensayo. Además, las propiedades bioquímicas y biofísicas de PrP ^Sc están pobremente caracterizados debido a su conformación inusual y estados de agregación.

PrP ^Sc puede sembrar la conversión de PrP ^{C y} PrP ^Sc in vitro ^14. El EPCP es una técnica in vitro que se Advantage de esta capacidad utilizando ciclos de sonicación y la incubación para producir grandes cantidades de PrP ^Sc, a un ritmo acelerado, a partir de un sistema que contiene cantidades en exceso de PrP ^C y pequeñas cantidades de la semilla PrP ^{Sc 19.} Esta técnica ha demostrado ser eficaz para recapitular la especificidad de especie y cepa de PrP ^Sc conversión de PrP ^C, para emular interferencia cepa de priones, y para amplificar los niveles muy bajos de PrP ^Sc partir de tejidos infectados, fluidos y muestras ambientales ^{6,7,16, 23.}

Este documento detalla el protocolo EPCP, incluyendo recomendaciones para minimizar la contaminación, generando resultados consistentes, y la cuantificación de los resultados. También se discuten varias aplicaciones del EPCP, incluyendo la generación y caracterización de cepas de priones infecciosos, la interferencia cepa de prión, y la detección de priones en el medio ambiente.

Protocolo

1. Preparación del Equipo

1. Utilice un Misonix 3000 o 4000 sonicador Misonix (Farmingdale, NY) conectado a un baño de Thermo Electron Neslab EX-7 agua (Newington, NH) para mantener una temperatura constante de 37 ° C. Sonicar las muestras en 200 ul de paredes delgadas tiras de tubos de PCR con tapas abovedadas obtenidos de Thermo Scientific (Waltham, MA).
2. Un baño de ultrasonidos nueva marca requiere de un "robo" período de operación continua ^9. Un robo de dos meses consiste en una ráfaga de sonicación de 40 segundos y 10 minutos ciclos de incubación con el nivel de amplitud establece en 10. Uno debería observar la erosión a lo largo de la superficie del cuerno de titanio de microplacas (Figura 1, panel B). El agua circulante se verá blanca, turbia debido a la erosión de la bocina de titanio microplaca. Cambie el agua diariamente.
3. La amplificación de la PrP ^Sc variará a través de la trompa de microplacas. La mejor eficiencia de amplificación PrP ^Sc se puede conseguir dentro deun radio de 5 cm desde el centro de la bocina de microplacas (Véase la Figura 1, panel C).
4. Una ronda de EPCP consiste en 144 ciclos. Cada ciclo consta de 5 segundos sonicación y 10 min de incubación. Esto implicará aproximadamente a 24 horas por ronda del EPCP.
5. La salida de potencia de la sonicación, se muestra en el panel de control del sonicador, varía con el número de tubos de PCR presentes en la rejilla del sonicador, y la temperatura del agua de circulación del baño de agua. Asegúrese de que el agua se equilibra a 37 ° C, y no llene más de 30% de soporte de tubos de la sonicador (Figura 1, panel C). Extienda los tubos de PCR a través de la trompa de microplacas. Tener al menos una fila de espacios vacíos entre las tiras de tubos PCR y no permitir más de cuatro tubos conectados entre sí por tira (Figura 1, panel C).
6. La fuerza de la sonicación es crítico para una amplificación prión cepa éxito. Mientras sonicación, ajustar la amplitud de tener una potencia de salidaque oscila entre 155 ~ 170 vatios. En nuestro laboratorio, el nivel de potencia se establece en seis y siete para el 3000 Misonix Misonix y 4000, respectivamente.
7. El uso de agua destilada en el baño de agua para evitar la acumulación de manchas de agua dura. Reemplazar esta semana el agua. Durante los ciclos de incubación y sonicación, la condensación de agua se produce en el interior de la tapa del cuerno de microplacas. Para evitar la condensación, coloque una almohadilla de calor pequeño acuario a la parte superior de la caja de la carcasa del aparato de ultrasonidos, como se muestra en la Figura 1, panel A.

2. Preparación de las muestras

1. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional Creighton University y el empleo Comisión y cumplir con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Antes de que cualquier recogida de tejido, el animal debe ser anestesiados y perfundidos transcardialmente con fosfato enfriada con hielo una solución salina tamponada con 5 mM de EDTA a pH 7,4 para eliminar la sangre desde el cerebro y evitar la inhibición de laEPCP reacción por la sangre ^7. Recoge los tejidos animales rápidamente utilizando una técnica aséptica y tienen herramientas específicas para cada cepa de disección prión. Después de la disección, colocar el tejido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, flash que se congele en hielo seco, y almacenar a -80 ° C hasta la homogeneización.
2. Para preparar el sustrato EPCP (PrP ^C) solución, homogeneizar un cerebro de hámster infectado (ONU BH) a un 10% peso / volumen (w / v) de solución con tampón de conversión enfriado con hielo (véase la parte 3), utilizando un triturador de tejidos Tenbroeck. Mientras homogeneizar, tenga cuidado de no tener aire en el interior del molino para evitar una excesiva formación de espuma en la solución. Aclarar la solución por centrifugación a 500 xg durante 30 seg y alícuota del sobrenadante en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.
3. Para preparar la semilla EPCP (PrP ^Sc) solución, homogeneizar un material infeccioso (nodos cerebro, bazo, linfáticos, otros tejidos o el suelo contaminado) a un 10% w / v solución con wate hielo fríor y alícuota de la solución en tubos de microcentrífuga de 0,6 ml. Almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.

3. Preparación de Buffer de conversión

1. Pesar 0,5093 g de Triton X-100 en un matraz aforado de 50 ml (el resultado es una concentración final de 1% de Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania).
2. Añadir una inhibidor de proteasa completo Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania).
3. Añadir 0,0931 g de EDTA (esto dará lugar a una concentración final 5 mM de EDTA) (Mallinckrodt Baker, Inc.; Phillipsburg, NJ).
4. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 1N.
5. Ajustar el volumen a 50 ml con fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS) (Mediatech Inc.; Manassas, VA).
6. Filtrar la solución a través de una membrana de 0,45 micras de nitrocelulosa con un aparato de filtración a vacío. El tampón de conversión se puede almacenar a 4 ° C durante no más de un mes.

4. La amplificación de las cepas de priones mediante el EPCP

1. Diluir la semilla EPCP en el sustrato EPCP en una proporción de 1:20 (es decir, mezcla de 5 l de la semilla EPCP y 95 l de sustrato de la PMCA) en un tubo de PCR. Retirar y almacenar una parte alícuota de 15 l a -80 ° C para el control de unsonicated; este control unsonicated se utiliza para cuantificar la amplificación PrP ^Sc través de proteinasa K (PK) seguido por la digestión de Western (WB) análisis. Un control unsonicated adicional podría ser generada por la colocación de una segunda alícuota de 15 l a 37 ° C durante la duración de la reacción EPCP. Un mínimo de tres repeticiones se requiere para fines estadísticos.
2. Se somete el resto de la muestra (70 l) a una ronda de EPCP como se representa en la Figura 1, Panel A. Se mezcla tubos cada 5 hr para evitar la condensación de agua en la tapa abovedada del tubo de PCR.
3. Tubos de la muestra deben ser centrifugadas y suavemente vortex (teniendo cuidado de que la solución no va en la tapa abovedada) antes de abrir después de cualquier procedimiento que garantice Homogeneity y evitar la contaminación potencial.
4. Para serie EPCP (sPMCA) de corto cepas período de incubación (es decir, HY TME, HaCWD, o 263K), diluir el material sonicado en una proporción de 1:20 mediante la transferencia de 5 l de la muestra sometida a ultrasonidos desde la primera ronda en 95 l de fresco no infectada homogeneizado de cerebro (Figura 2, panel B).
5. Para sPMCA de largos cepas período de incubación (es decir, DY TME, 139H, 22CH, 22AH, o ME7H), diluir el material sonicado en una proporción de 1:1 por transferencia de 50 l de la muestra sometida a ultrasonidos desde la primera ronda en 50 l de fresco no infectada homogeneizado de cerebro (Figura 2, panel B).
6. 15 Retire los dos alícuotas de la mezcla previamente diluido sonicado (de pasos 4,4 o 4,5) y almacenar uno de ellos a -80 ° C y el otro a 37 ° C (soluciones de control para unsonicated EPCP la segunda ronda). Someter a los restos de una ronda EPCP dos.
7. Este procedimiento se puede repetir indefinidamente. En nuestro laboratorio, hemoshan realizado hasta quince rounds EPCP, con las propiedades de deformación permanecerán invariables.
8. PK digerir las muestras. Para un típico WB, mezclar 5 l de PK 80 ug / ml a 5 l de muestra (esta solución tendrá una concentración final de PK de 40 mg / ml) e incubar a 37 ° C durante una hora. Añadir 10 l de tampón de carga de gel. Hervir esta solución durante 10 min. Deje que la solución se enfríe y cargar 10 l en el gel.
9. Para calcular el éxito de la amplificación de realizar un análisis de WB en las muestras digeridas PK-para estimar la cantidad de PrP ^Sc amplificado por comparación a cualquiera, los controles unsonicated ^20,21 Figura 2, panel C o a cantidades conocidas de PK-sin digerir recombinante PrP.

5. Evitar la contaminación cruzada

Los pasos críticos tienen que ser tomadas para reducir al mínimo la contaminación cruzada y la ocurrencia de falsos positivos debido a la formación de novo de productos resistentes a la proteasa.

1. Utilice un conjunto dedicado de herramientas de disección (es decir, fórceps, pinzas, tijeras) para la recolección de la muestra para cada cepa de prión.
2. Antes de homogeneización de los cerebros no infectadas para ser utilizados como un sustrato de PMCA, limpiar las pipetas con 1% de lejía. Remoje la cremallera sonicador de PCR tubo, homogeneizadores de tejidos, y bastidores de almacenamiento de tubos PCR con 1% de lejía durante 10 minutos y enjuagar con agua destilada.
3. Cubra el área de trabajo con un Soaker Lab fresco Versi-Dry cada vez que una nueva muestra se homogeneiza, un nuevo experimento EPCP es estar preparado, o cuando alícuotas entre rondas sPMCA.
4. Use guantes nuevos cada vez que nuevas muestras se manejan (especialmente cuando se transfieren alícuotas entre rondas sPMCA).
5. Utilice descargas cortas sonicación durante cada ciclo del EPCP. Los ciclos de sonicación 5 sec combinado con 10 minutos de incubación es suficiente para amplificar los priones sin generar de novo PrP ^{Sc 1,20,21,23,24.} Como otros laboratorios han demostrado, el aumento de latiempo de sonicación, el aumento de la amplitud de sonicación, y aumentando el número de ciclos de PMCA aumenta la probabilidad de novo de PrP ^Sc formación ^2.

Resultados

Misfolding proteína amplificación cíclica (PMCA) se utiliza para amplificar PrP ^Sc in vitro ^{7, 12, 14, 19, 24.} El éxito de la amplificación PrP ^Sc se muestra por un aumento en la intensidad de la banda en las transferencias Western de la proteína priónica PK-resistente (migrando entre 19 y 30 kDa para las cepas de priones de hámster derivados) como se muestra en la Figura 3. El aumento de la intensidad de la banda después de su EPCP indica la amplificac...

Discusión

Desafíos de la amplificación de las proteínas priónicas infecciosas son los períodos de incubación largos y los gastos de los experimentos in vivo. La técnica EPCP es un medio rentable para amplificar los agentes infecciosos de priones. Varios laboratorios han confirmado la capacidad de PMCA para amplificar con precisión las cepas de priones in vitro ^{7, 9, 12, 14, 19,24.}

Las enfermedades por priones se pueden transmitir entre especies. Bessen y M...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo / Equipo	Fabricante	Cat. Número
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbroeck triturador de tejidos	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath	Thermo Electron	Neslab EX-7
PCR de 0,2 ml tiras de tubos	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Inhibidor de Proteasa Completo	Roche	11 697 498 001
EDTA	JT Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm calentador	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4