مجموعة أدوات لتمكين تحويل المواد الهيدروكربونية في البيئات المائية

Summary

تم تصميم نظام السيارات المستدامة تنظم البكتيرية لعلاج التلوث النفطي باستخدام معيار أجزاء DNA للتبادل (BioBricks). وهندسيا E. القولونية للحط من سلالة الألكانات عبر الأكسدة β في البيئات المائية السامة. أظهرت الإنزيمات منها من الأنواع المختلفة ألكان النشاط التدهور. بالإضافة إلى ذلك، لزيادة التسامح ن الهكسان عن طريق إدخال جينات من البكتيريا التي تتحمل ألكان.

Abstract

هذا العمل يطرح مجموعة أدوات التي تمكن من تحويل الألكانات من الإشريكية القولونية، ويقدم دليلا على مبدأ إمكانية تطبيقه. مجموعة الأدوات يتكون من أجزاء متعددة قابلة للتبديل القياسية (BioBricks) ⁹ التصدي لتحويل الألكانات، وتنظيم التعبير الجيني والبقاء على قيد الحياة في البيئات الغنية الهيدروكربونية السامة.

تم تنفيذ مسار ثلاث خطوات لتدهور ألكان في E. الإشريكية لتمكين تحويل الألكانات متوسطة وطويلة السلسلة إلى alkanols كل منها، والأحماض alkanals alkanoic-في نهاية المطاف. ويستقلب هذا الأخير عبر مسار β للأكسدة الأصلية. لتسهيل أكسدة المتوسطة سلسلة الألكانات (C5-C13) وcycloalkanes (C5-C8)، وأربعة جينات (alkB2، rubA3، rubA4 والمطاطية) من نظام هيدروكسيلاز ألكان من Gordonia SP. تحولت TF6 ^8،21 في E. القولونية. لتحويلسلسلة طويلة الألكانات (C15-C36)، تم تنفيذ هذا الجين لادا من thermodenitrificans Geobacillus. لمزيد من الخطوات المطلوبة لعملية التدهور، وأدخلت ADH وALDH (القادمة من thermodenitrificans G.) ^10،11. تم قياس النشاط المقايسات الخلية الراحة. لكل خطوة الأكسدة، لوحظ نشاط انزيم.

لتحسين كفاءة عملية، وكان المستحث فقط التعبير في ظل ظروف انخفاض الجلوكوز: تم استخدام الركيزة المروج التنظيم، pCaiF. pCaiF موجود في E. K12 القولونية وينظم التعبير عن الجينات المسؤولة عن تدهور مصادر الكربون غير الجلوكوز.

ونفذ باستخدام الجينات التسامح المذيبات، وPhPFDα β، وكلاهما من Pyrococcus horikoshii OT3 - الجزء الأخير من مجموعة الأدوات - استهداف البقاء. يمكن المذيبات العضوية لحث على الإجهاد وانخفاض الخلايا البقاء على قيد الحياة من قبل affectin سلباغرام من البروتين للطي. كما المحرمين، وPhPFDα β تحسين عملية مثل البروتين للطي في ظل وجود من الألكانات. وقد لوحظت التعبير عن هذه الجينات أدى إلى التسامح الذي أبداه الهيدروكربونية تحسين معدل زيادة النمو (إلى 50٪) في الوجود من 10٪ N-الهكسان في ثقافة المتوسط.

تلخيص، فإن النتائج تشير إلى أن مجموعة أدوات تمكن E. الإشريكية لتحويل وتحمل النفط والغاز في البيئات المائية. على هذا النحو، فإنه يمثل خطوة أولية نحو إيجاد حل مستدام لإصلاح النفطية باستخدام نهج البيولوجيا التركيبية.

Introduction

Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities ³. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil ¹. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving ³.

To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged ¹. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule ^{7, 21}. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids ⁸. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.

The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C₅-C₁₃ alkanes along with that of C₅-C₈ cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) ^{8, 21}. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C₁₅ up to C₃₆) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 ^{7, 15, 18, 22}. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway ^{7, 21}. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD⁺ as a cofactor ¹⁰. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD⁺-dependent final step in the medium-chain oxidation ¹¹.

In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels ⁶. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components ^{6, 14}.

Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems ¹². Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance ¹⁷.

The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts ⁹. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.

Protocol

1. BioBrick الجمعية

1. وتقدم BioBricks من التسجيل الأجزاء البيولوجية المعيارية من مقر iGEM. لبناء BioBrick جديدة من BioBricks القائمة، هضم BioBrick المانحة (تصل إلى 1.0 ميكروغرام) مع الانزيمات وEcoRI SpeI لتحديد المواقع المصب جزء المانحة للجزء متقبل. ملخص مع XbaI وPstI لتحديد المواقع الجزء المانحة المنبع للجزء متقبل. إضافة 1/3 انزيم تقييد المناسبة التي تقطع في العمود الفقري للالمانحين. أداء الهضم في إجمالي حجم من 20-25 مل مع المخزن المؤقت المناسبة، وفقا لمزود (تركيز النهائي 1X). استخدام 5 وحدات / DNA ميكروغرام للإنزيمات التقييد.
2. هضم BioBrick متقبل مع أي EcoRI وXbaI أو SpeI وPstI.
3. احتضان الهضم ل(على الأقل) واحد ساعة في 37 ° C. إبطال نشاط نوكليازات الاقتطاع الداخلية عن طريق الحرارة، الحضانة عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وطرد المركزي في وقت قريب.
4. Ligate على هضم BioBrickأجزاء (المانحة ومتقبل) معا. منذ XbaI وSpeI توليد ينتهي DNA متوافق، يتم إنشاء موقع المختلطة التي لا يمكن قطع مع أي تقييد انزيم مما أدى إلى BioBrick الجديدة مجتمعة بأن يحيط بها 4 مواقع تقييد القياسية. في خليط ربط تركيز DNA النهائي هو يفضل ~ 100 نانوغرام / ميكرولتر. أداء رد فعل ربط في إجمالي حجم من 10-15 مل مع المخزن المؤقت ربط T4 (تركيز النهائي 1X) ويغاز T4 (1 وحدة / ميكروغرام DNA).
5. احتضان الخليط في ربط C ° 16 على الأقل 3 ساعة.
6. أداء رد فعل التحول مع نصف مزيج من حوالي ربط.
7. تأكيد BioBrick أن يكون صحيحا مع التسلسل.
8. لبناء BioBrick جديدة من DNA توليفها، تعديل الجينات لتخليق الأمثل للتعبير في E. القولونية عن طريق أداة الموقع JCat ( http://www.jcat.de/ ). إجراء تعديلات إضافية، وفقا لمتطلبات B ioBrick القياسية. هذا يعني أن توحيد يتكون كل BioBrick من تسلسل الحمض النووي التي تهم يسبقه البادئة ويليه لاحقة. البادئة واللاحقة هي متواليات التي تحتوي على مواقع محددة سلفا تقييد، التي هي غائبة في تسلسل البلازميد المتبقية. تقييد هذه المواقع القياسية تجعل من الممكن لتبادل وتوسيع إدراج BioBrick بمرونة ^9. البادئة واللاحقة لها تسلسل التالي:

اسم	تسلسل	تعليق
بادئة	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'	إذا كان الجزء التالي هو تسلسل الترميز أو أي الجزء الذي يبدأ ب "ATG"
لاحقة	5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'

ove_title "> 2 تحويل ألكان. يستريح الفحص الخلوي، في الجسم الحي

تم إجراء هذا الاختبار يعتمد على الطريقة الموصوفة من قبل فوجي وآخرون (2004).

1. ثقافة E. خلايا الإشريكية معربا عن نظام هيدروكسيلاز ألكان ( BBa_K398014 ) والخلايا يحمل ناقلات الفارغة ( BBa_J13002 ) في 5 مل المتوسطة LB مع المضادات الحيوية المناسبة بين عشية وضحاها.
2. نقل 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل من LB جديدة (مع مضاد حيوي) واحتضان الخلايا التعكر حتى التوصل الى OD (الكثافة الضوئية) بنسبة 0.3 في 600 نانومتر.
3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4،000 دورة في الدقيقة و resuspend بيليه في 5 مل العازلة الفوسفات 0،1 M (درجة الحموضة 7.4).
4. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 4،000 دورة في الدقيقة و resuspend بيليه في 5 مل العازلة الفوسفات M 0،1 تحتوي على أملاح E2 الآن و0.66٪ V / V الجلسرين (النيتروجين deficienر متوسطة).
5. قياس العكارة الخلية (OD _600).
6. إعداد خليط الخلايا مأخوذة من 6 مل مل في 25 قوارير الزجاج المغلقة الغطاء وعدم التحكم الخلية (E2 + أملاح 0.66٪ V / V الجلسرين).
7. إضافة 100 نانومول لكل من ألكان القارورة.
8. احتضان مخاليط في C ° 37 لمدة 24 ساعة (تقصير عندما يتم الحصول على معدلات أعلى).
9. قياس OD ₆₀₀ بعد الحضانة.
10. استخراج الهيدروكربونات في وسائل الإعلام الثقافة عن طريق خلات الإيثيل وتحديد تركيز المواد الهيدروكربونية في الثقافة الخلية بواسطة كروماتوغرافيا الغاز (انظر البروتوكول 3).
11. حساب تدهور لكل وحدة من الكتلة الحيوية من خلال تقسيم المبلغ الإجمالي للألكان تحويلها من قبل الحاضر مجموع الكتلة الحيوية في كل قارورة (OD ₆₀₀ إلى تحويل الوزن الجاف). تقسيم الناتج على مدة تجريبية تعطي النشاط تدهور في الكتلة الحيوية وحدة لكل وحدة الزمن. يتم أخذ المتوسط ​​من ثلاثة أشواط الفردية.

3. ألكان الفحص إنزيم تحويل، وفيالمختبر

تم إجراء هذا الفحص بشكل أساسي وفقا لطريقة وصفها لي وآخرون (2008).

1. ثقافة E. خلايا الإشريكية التعبير عن الجينات لادا ( BBa_K398017 ) والخلايا يحمل ناقلات الفارغة ( BBa_J13002 ) في 50 مل المتوسطة بالمضادات الحيوية المناسبة LB بين عشية وضحاها.
2. نقل 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل من LB جديدة (مع مضاد حيوي) واحتضان الخلايا التعكر حتى التوصل إلى الكثافة البصرية بنسبة 0.6 في 600 نانومتر.
3. أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 4،000 دورة في الدقيقة (4 ° C) و resuspend بيليه في 5 مل من 50 ملي تريس العازلة.
4. يصوتن (خلية ديسروبتر، LA النظم البيولوجية) الخلايا في دورة عمل 40٪ مع عنصر تحكم الإخراج من 4، والحفاظ على الحل على الجليد لكامل مدة.
5. أجهزة الطرد المركزي في الخليط الناتج لمدة 5 دقائق في 4،000 دورة في الدقيقة في 4 و دعلى سبيل المثال؛ C لإزالة الحطام الخلية. نقل طاف إلى قارورة جديدة.
6. تحديد تركيز البروتين الكلي للخلية مقتطفات من الفحص برادفورد. ملاحظة: استخدام قوارير الزجاج لمنع زيادة الخلفية و / أو فقدان البروتين.
7. إعداد خليط 100 مل تحتوي على 0.1٪ V / V ألكان و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة.
8. تسخين الخليط في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة فقط لسلسلة الألكانات متوسطة طويلة مع ارتفاع درجة الغليان. (على سبيل المثال C _16: 287 ° C).
9. لتحقيق الذوبان الأمثل للألكان، يصوتن لمدة 1 دقيقة في حين لا يزال دافئا حتى يتم الحصول على متجانسة، خليط لزج.
10. إضافة 1MM من NADH، 1 ملم أحادي نوويد الفلافين، 1 ملم MgSO ₄ و 0،01 ت / ت تريتون X-100.
11. إعداد 6 مليلتر مأخوذة في 25 قوارير مغلقة غطاء مل.
12. إضافة كميات كافية من مستخلص الخلية (يعتمد على المقايسات برادفورد، وتركيز النهائي من 5 ملغم بروتين / لتر). إعداد التحكم لم البروتين.
13. احتضان عند 60 ° C (للبريد الأمثلnzymatic النشاط) لمدة 24 ساعة.
14. استخراج الهيدروكربونات في وسائل الإعلام الثقافة عن طريق خلات الإيثيل وتحديد تركيز المواد الهيدروكربونية في الثقافة الخلية بواسطة كروماتوغرافيا الغاز (انظر البروتوكول 3).
15. وأضاف حساب تدهور لكل وحدة من الكتلة الحيوية من خلال تقسيم المبلغ الإجمالي للألكان تحويلها من قبل البروتين الكلي لكل قارورة (من منحنى المعايرة برادفورد). مزيد من تقسيم مدة التجربة تعطي النشاط تدهور لكل وحدة من البروتين الخلوي لكل وحدة الزمن. يتم أخذ المتوسط ​​من ثلاثة أشواط الفردية.

4. إيثيل أسيتات استخراج النفط والغاز وقياسات تركيز

1. يتم استخراج الألكانات من محلول مائي عن طريق إضافة 2.5 مل خلات الإيثيل (solvant عديم الأقطاب) إلى حل التجريبية 6 مل. يتم إضافة القياسي الداخلي للمذيب عند تركيز 0.1٪ (V / V). المعيار (على سبيل المثال، سيكلو ديكان) تختلف اعتمادا على مجموعة من قمم المتوقع في المصالح.
2. اختياري: إضافة تريتونX-100 إلى خليط مائي وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 4،000 دورة في الدقيقة من أجل الحصول على المناسبة ثنائية طوري النظام.
3. دوامة الخليط لمدة 5 ثوانى (1،500 دورة في الدقيقة) واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى مرحلتي منفصلة.
4. إزالة كمية ممكنة من الطبقة العضوية (أعلى) وتجفيف المذيبات اللامائية باستخدام كبريتات المغنيسيوم.
5. إزالة MgSO ₄ من الترشيح (0.2 ميكرومتر) ونقل الراشح في قوارير الغاز اللوني للمقاييس، أو مخزن في -20 ° C.
6. تحديد تركيز بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي باستخدام عمود CP-SIL 5CB (طول = 5 م). حقن 10 ميكرولتر من العينة في طريقة تقسيم (1:10، 230 ° C). تعيين العمود تدفق الغاز إلى 1 مل / دقيقة (الهيليوم). ويستخدم الفرن درجة حرارة التالية البرنامج:

   معدل	درجة حرارة [° C]	الوقت [دقيقة]
   0	50	7.5
   50	90	1.0
   50	110	2.0
   50	130	2.0
   50	145	2.0
   50	160	2.0
   50	170	2.0
   50	185	2.0
   50	210	2.0
   50	250	2.0
   50	320	2.0

7. دمج القمم وتصحيح تركيزات فيما يتعلق القياسي الداخلي.

5. الكحول / الفحص ألدهيد نشاط إنزيم

تم إجراء هذا الفحص بشكل أساسي وفقا لطريقة وصفها آخرون كاتو.(2010).

1. ثقافة E. الخلايا القولونية التعبير عن ADH ( BBa_K398018 ) أو ALDH ( BBa_K398030 ) الجينات والخلايا يحمل ناقلات الفارغة ( BBa_J13002 ) في 50 مل المتوسطة بالمضادات الحيوية المناسبة LB بين عشية وضحاها.
2. نقل 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل من LB جديدة (مع مضاد حيوي) واحتضان الخلايا التعكر حتى التوصل إلى الكثافة البصرية بنسبة 0.6 في 600 نانومتر.
3. أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 4،000 دورة في الدقيقة في C ° 4 و resuspend بيليه في 5 مل من 50 ملي تريس العازلة.
4. يصوتن الحل الخلية في دورة عمل 40٪ مع عنصر تحكم إخراج 4 (إبقاء الحل على الجليد خلال صوتنة).
5. أجهزة الطرد المركزي في الخليط الناتج لمدة 5 دقائق في 4،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلية.
6. لتحديدتل تركيز البروتين في الخلية عن طريق الفحص مقتطفات برادفورد (ملاحظة: استخدام قارورة زجاجية لمنع ملزمة البروتين).
7. تحميل وحة 96 ميكرولتر جيدا مع 180 57 مم جليكاين العازلة التي تحتوي على NAD (تركيز النهائي 1 ملم، ودرجة الحموضة 9.5) في كل بئر.
8. إضافة 5 ميكرولتر من الكحول (ألدهيد) لفحصها للآبار. ملاحظة: الكحول الحرارة سلسلة طويلة قبل بدء الفحص أن يكون السائل. وينبغي أن يضاف لكل الكحول (ألدهيد) عنصر تحكم دون الركيزة (المراقبة السلبية). وبالإضافة إلى ذلك، تعد فارغة تحتوي على خليط من العازلة والركيزة دون استخراج الخلايا.
9. سخن لوحة للقارئ لوحة (ماجلان TECAN V7.0) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للموازنة للنظام.
10. إضافة كميات كافية من مستخلص الخلية (يعتمد على المقايسات برادفورد، وتركيز النهائي من 5 ملغم بروتين / لتر). إعداد التحكم لم البروتين.
11. قياس إنتاج NADH باستخدام الطيف في طول موجة من 340 نانومتر كل دقيقة من 2-3 1 ساعة عند 37 ° C.
12. حساب معدل إنتاج NADH من منحدر OD (340 نانومتر). تأخذ في الاعتبار طول مسار الضوء ومعامل انقراض NADH من 6220 سم ^-1 M ^-1. وأضاف تقسيم معدل إنتاج NADH من المبلغ الإجمالي من البروتين للتعبير عن النشاط للتفاعل نازعة في استخراج الخلايا (U / ملغم بروتين خلية كاملة). حساب متوسط ​​والانحراف المعياري من ثلاثة أشواط مستقلة.

6. pCaiF توصيف

1. ثقافة E. خلايا الإشريكية معربا عن بناء pCaiF-GFP ( BBa_K398331 ) والخلايا التي تحمل المروج وحده ( BBa_K398326 ) بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة المضادات الحيوية المناسبة LB بين عشية وضحاها.
2. تطعيم 5 مل تحتوي على 10 M9 غرام / لتر الجلوكوز والمضادات الحيوية مع 50 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها وتنمو بين عشية وضحاها.
3. ثقافة فرعية 50 ميكرولتر من ثمرة بين عشية وضحاها إلى 5 مل من جديد ز with10 M9 / لتر واحتضان حتى وصلت إلى التعكر خلية الكثافة البصرية بنسبة 0.2 في 600 نانومتر.
4. تحميل وحة 96 أيضا مع 100 ميكرولتر من M9 المتوسطة الطازجة التي تحتوي على المبلغ المطلوب من مصدر الكربون لاختبار في كل بئر. إجراء تجارب لتقييم ثلاث نسخ الإحصائية وإضافة عناصر التحكم الخاصة السلبية (البرية من نوع E. القولونية K12).
5. إضافة 5 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى الآبار التي تحتوي على المتوسط.
6. قياس منحنى النمو (OD ₆₀₀₎ ومضان GFP (485 نانومتر الإثارة وانبعاث 520) باستخدام قارئ لوحة كل 10 دقيقة لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز المستمر.
7. حساب معدل النمو ومحتوى GFP محددة من القياسات منها وقارن بين عنصر التحكم. حساب متوسط ​​والانحراف المعياري على الأقل ثلاث تجارب مستقلة.

7. التسامح الفحص

1. ثقافةكولاي التعبير عن الجينات وPhPFDα β ( BBa_K398406 ) بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة LB والمضادات الحيوية المناسبة. E. القولونية التعبير عن الجينات لادا ( BBa_K398017 يستخدم) كما المراقبة السلبية.
2. ثقافة فرعية 10 ميكرولتر من ثمرة بين عشية وضحاها إلى 5 مل جديدة من LB (مع مضاد حيوي) واحتضان حتى وصلت إلى التعكر خلية الكثافة البصرية من 0،3 حتي 0،4 في 600 نانومتر.
3. تمييع الثقافات مع الطازجة المتوسطة وحتى يتم التوصل إلى OD ₆₀₀ من 0.1.
4. تحميل وحة 96 أيضا مع 180 ميكرولتر المتوسطة M9 التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة والتركيز السليم النهائي للمركب سام (مثل 0، 4، 8، 10٪ من N-الهكسان) في ثلاث نسخ. لأن ألكان المياه يمكن أن يؤدي إلى خليط من مرحلتين نظم فمن الضروري أن يكون ضوابط ملائمة على لوحة (على سبيل المثال دifferent سلالات والتجارب ذات الصلة فارغة).
5. إضافة 20 ميكرولتر من ثقافة (التحكم) في الآبار.
6. قياس تركيز الكتلة الحيوية (OD ₆₀₀₎ باستخدام قارئ لوحة كل 10 دقيقة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز المستمر.
7. حساب معدلات النمو من القياسات منها عن تركيزات مختلفة كيل وقارن بين سيطرة سلبية. حساب متوسط ​​والانحراف المعياري على الأقل ثلاثة أشواط مستقلة.

8. Homolog التفاعل رسم الخرائط

1. وقد وضعت تطبيق HIM لتنفيذ استعلامات البروتين في الخادم بوستجرس تشغيل قاعدة البيانات STRING (مجاني للاستخدام الأكاديمي) ^20. تعيين تطبيق التفاعل نديد يحدد البروتينات المتفاعلة في الكائن الحي المضيف الأصلي باستخدام قاعدة بيانات STRING. يتم استخدام تسلسل من الجينات المعنية التفاعل في البحث للعثور على الجينات BLAST مثلي في الكائن الحي المستهدف. ⁴ Cytoscape لتصور نتيجة لرسم الخرائط. يمكن تحميل الأداة البرمجيات HIM في: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
2. لإجراء رسم الخرائط، (1) دخول ID BioBrick والتطبيق سوف تحميل البيانات تلقائيا تسلسل جزء من قلم الأجزاء البيولوجية المعيارية ^9، أو (2) ENTER (لصق) البيانات تسلسل في التطبيق.
3. استخدام الموقع قاعدة بيانات للبحث عن STRING ID STRING البروتين لتسلسل الأحماض الأمينية التي تم إدخالها.
4. يتم تحديد البروتين مع تماثل عالية باستخدام الانفجار. بعد ذلك تطبيق تسرد كل بروتين التفاعل معروفة في الحي والبحث عن مصدر homologs في الكائن الحي المضيف (على سبيل المثال كولاي).
5. تصدير قائمة الناتجة التفاعل المفترضة إلى نص أو Cytoscape.

النتائج

Alkane conversion

The activity of the three oxidation steps from the alkane to the respective fatty acid was evaluated using resting cell assays and enzyme activity measurements. The results are presented following the pathway reactions (1) alkane hydroxylase, (2) alcohol dehydrogenase and (3) aldehyde dehydrogenase.
For the first step, different plasmids were constructed for medium and long-chain alkanes. The plasmid BBa_...

Discussion

ويستخدم مبدأ BioBrick لبناء هيكل للتدهور الألكانات وتم الحصول على دليل على مبدأ واحد للمكونات مجموعة الأدوات. ويقترح عدة فحوصات لقياس في الجسم الحي والنشاط في المختبر من الانزيمات ألكان مسار المهينة. العمل المقدم يوضح بنجاح عددا من الأساليب التي يمكن استخدامه...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli K12	New England Biolabs	C2523H
Octane	Fluka	74822
Hexadecane	Fluka	52209
octanol-1	Fluka	95446
dodecanol-1	Sigma-Aldrich	126799
Hexane	Sigma-Aldrich	296090
NADH	Sigma-Aldrich	N4505
FMN	Sigma-Aldrich	F2253
MgSO4	J.T. Baker Casno	7487 889
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
T4 ligase	New England Biolabs	M0202L
Gas chromatograph
Cell disrupter	LA Biosystems	CD-019
Spectrophotometer	Amersham pharmacia	spec 2000
Plate reader	Tecan Group Ltd.	Magellan v7.0
Incubator	Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398014	Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398027	ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398018	ADH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398030	ALDH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398326	pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398331	pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107-	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398406	Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol