Toolkit כדי לאפשר גיור פחמימן בסביבות מימיות

Summary

אוטומטי קיימא ויסות מערכת חיידקים לטיפול של זיהומי נפט תוכנן באמצעות חלקי DNA החלפה סטנדרטיים (BioBricks). מהונדס א coli מתח שמש לבזות אלקאנים באמצעות β-חמצון בסביבות מימיות רעילות. את האנזימים המתאימים ממינים שונים הראו פעילות alkane שפלה. בנוסף, סובלנות מוגברת ל N-הקסאן הושג על ידי החדרת גנים מחיידקי alkane סובלניים.

Abstract

עבודה זו מעבירה קדימה ערכת כלים המאפשרת את ההמרה של אלקאנים ידי חיידקי Escherichia ומציג הוכחה לעיקרון תחולתו. ערכת הכלים מורכבים ממספר חלקים סטנדרטיים להחלפה (BioBricks) ⁹ העוסקים בהמרות של אלקאנים, הוויסות של ביטוי גנים וההישרדות בסביבה רעילה פחמימנים עשירות.

מסלול בן שלושת שלבים לפירוק alkane יושם בE. coli כדי לאפשר המרה של טווח הבינוניים וארוך שרשרת אלקאנים לalkanols בהתאמה, alkanals וחומצות alkanoic-סופו של דבר. האחרון היו מפורק דרך מסלול יליד β-חמצון. כדי להקל את החמצון של אלקאנים בינוני שרשרת (C5-C13) וcycloalkanes (C5-C8), ארבעה גנים (alkB2, rubA3, rubA4 וrubB) של מערכת hydroxylase alkane מגורדוניה SP. TF6 ^8,21 נהפכו E. coli. להמרה שלאלקאנים ארוכי שרשרת (C15-C36), גן LADA מthermodenitrificans Geobacillus יושמו. לצעדים הנוספים הנדרשים בתהליך ההידרדרות, ADH וALDH (שמקורם thermodenitrificans ג') הוכנסו ^10,11. הפעילות נמדדה על ידי מבחני תא מנוחה. לכל שלב חמצונים, פעילות אנזים נצפתה.

כדי לייעל את יעילות התהליך, הביטוי היה מושרה רק בתנאי הגלוקוז נמוכים: אמרגן מצע מוסדר, pCaiF, היה בשימוש. pCaiF נוכח בE. coli K12 ומסדיר את הביטוי של הגנים הקשורים בפירוק של מקורות הפחם שאינה גלוקוז.

חלקיו האחרונים של ערכת הכלים - מיקוד הישרדות - יושם באמצעות גני ממס סובלנות, PhPFDα וβ, שני מ furiosus horikoshii הארכת זמן 3. ממסים אורגניים יכולים לגרום למתח תא וירידה בשרידות על ידי שלילי affectinקיפול חלבונים גרם. כמלווים, PhPFDα וβ לשפר את התהליך למשל החלבון מתקפל תחת הנוכחות של אלקאנים. הביטוי של גנים אלה הובילו לסובלנות פחמימנים משופרות שמוצגת על ידי עלייה בשיעור צמיחה (עד 50%) בנוכחות של 10% n-הקסאן במדיום התרבות נצפה.

בסיכום, התוצאות מצביעות על כך שארגז הכלים מאפשר E. coli כדי להמיר ולסבול פחמימנים בסביבות מימיות. ככזה, הוא מהווה צעד ראשון לקראת פתרון בר קיימא ל- משיקום שמן בעזרת גישת ביולוגיה סינטתית.

Introduction

Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities ³. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil ¹. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving ³.

To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged ¹. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule ^{7, 21}. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids ⁸. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.

The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C₅-C₁₃ alkanes along with that of C₅-C₈ cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) ^{8, 21}. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C₁₅ up to C₃₆) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 ^{7, 15, 18, 22}. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway ^{7, 21}. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD⁺ as a cofactor ¹⁰. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD⁺-dependent final step in the medium-chain oxidation ¹¹.

In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels ⁶. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components ^{6, 14}.

Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems ¹². Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance ¹⁷.

The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts ⁹. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.

Protocol

1. BioBrick עצרת

1. BioBricks מהרישום של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים מסופקים על ידי מטה iGEM. לבנות BioBrick חדש מBioBricks הקיים, לעכל את תורם BioBrick (עד 1.0 מיקרוגרם) עם אנזימי EcoRI וSpeI למיצוב במורד החלק התורם של חלק acceptor. תקציר עם XbaI וPstI למיצוב חלק התורם במעלה הזרם של חלק acceptor. הוסף אנזים הגבלה מתאימה 3 שחותך בעמוד השדרה של התורם. בצע את digestions בהיקף כולל של 20-25 מ"ל עם החיץ המתאים, על פי הספק (ריכוז סופי 1x). השתמש / 5 יחידות DNA מיקרוגרם לאנזימי ההגבלה.
2. לעכל BioBrick acceptor עם או EcoRI וXbaI או SpeI וPstI.
3. דגירת digestions ל( לפחות) אחד בשעה 37 ° C. לנטרל את הגבלת endonucleases על ידי חום, דגירה על 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וצנטריפוגה זמן קצר.
4. לקשור BioBrick מתעכלחלקים (תורם וacceptor) יחד. מאז XbaI וSpeI לייצר קצות DNA תואמים, אתר מעורב נוצר שלא ניתן לחתוך בכל אנזים הגבלה וכתוצאה מBioBrick חדש והמאוחדת "שניצב בין 4 אתרי ההגבלה הסטנדרטי. בתערובת קשירת ריכוז הדנ"א הסופי הוא עדיף ~ 100 ng / μl. בצע את תגובת הקשירה בהיקף כולל של 10-15 מ"ל עם חיץ T4 קשירה (ריכוז סופי 1x) וligase T4 (יחידת דנ"א 1 / מיקרוגרם).
5. דגירה את תערובת הקשירה ב 16 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות.
6. לבצע שינוי תגובה עם חצי בערך מתמהיל הקשירה.
7. אשר BioBrick להיות נכון עם הסידור.
8. לבנות BioBrick חדש מ-DNA המסונתז, לשנות את הגנים לסינתזה לביטוי אופטימלי בE. coli באמצעות כלי האתר JCat (http://www.jcat.de/). לבצע שינויים נוספים בהתאם לדרישות של B ioBrick סטנדרטי. סטנדרטיזציה זה מרמז שכל BioBrick מורכב מרצף ה-DNA של עניין קדם קידומת ואחריו סיומת. הקידומת והסיומת הם רצפים המכילים אתרי הגבלה מוגדרים מראש, שנעדרו ברצף פלסמיד שנותר. אתרי הגבלה סטנדרטיות אלו מאפשרים להחליף ולהרחיב מחדירה BioBrick גמישות ^9. הקידומת והסיומת יש את הרצפים הבאים:

שם	רצף	הערה
קידומת	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'	אם החלק הבא הוא רצף קידוד או כל חלק שמתחיל עם "ATG"
סיומת	5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'

ove_title "> 2. Assay Alkane מרת מנוחת תא, In Vivo

בדיקה זו מתבצעת על בסיס השיטה שתוארה על ידי פוג'י et al. (2004).

1. תרבות ה תאי coli המבטאים את מערכת Alkane hydroxylase (BBa_K398014) ותאי נשיאת וקטור ריק (BBa_J13002) במדיום 5 מ"ל LB עם אנטיביוטיקה מתאימה בן הלילה.
2. העברת 500 μl של תרבות הלילה ל50 מ"ל של LB הטרי (עם אנטיביוטיקה) ולדגור עד עכירות התא הגיעה OD (צפיפות אופטית) של 0.3 ב 600 ננומטר.
3. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב4000 סל"ד ו resuspend גלול ב 5 מיליליטר חיץ 0.1 מ 'פוספט (pH 7.4).
4. צנטריפוגה שוב למשך 10 דקות ב4000 סל"ד ו resuspend גלול ב 5 מיליליטר חיץ 0.1 מ 'פוספט המכיל מלחים עכשיו E2 ו0.66% גליצרול v / v (החנקן deficienלא בינוני).
5. מדוד את עכירות התא (OD _600).
6. הכן aliquots תא תערובת של 6 מ"ל ב25 מיליליטר צלוחיות סגור כובע זכוכית ובקרות לא תאים (מלחים E2 + 0.66% גליצרול v / v).
7. הוסף 100 nmol של alkane לכל בקבוק.
8. דגירת התערובות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות (לקצר כאשר שיעורים גבוהים יותר מתקבלים).
9. מדוד את OD ₆₀₀ לאחר דגירה.
10. חלץ את פחמימנים בתקשורת התרבות של אתיל יצטט ולקבוע ריכוז פחמימנים בתרבית תאים על ידי גז כרומטוגרפיה (ראה פרוטוקול 3).
11. חישוב השפלה ליחידה של ביומסה על ידי חלוקת הסכום הכולל של alkane מומר על ידי נוכחים ביומסה הסך הכילו בכל בקבוק (OD להמיר ₆₀₀ למשקל יבש). חלוקת התוצאה בתקופת הניסוי מניבה פעילות ההשפלה לביומסה יחידה ליחידת זמן. הממוצע נלקח מתוך שלוש ריצות בודדות.

3. Assay Alkane המרת אנזים, במבחנה

בדיקה זו בוצעה למעשה על פי השיטה שתוארה על ידי לי אח'. (2008).

1. תרבות ה תאי coli מבטאים LADA הגן (BBa_K398017 ותאים שנשאו וקטור ריק () BBa_J13002) במדיום LB מ"ל 50 עם טיפול אנטיביוטי מתאים. הלילה
2. העברת 500 μl של תרבות הלילה ל50 מ"ל של LB הטרי (עם אנטיביוטיקה) ולדגור עד עכירות התא הגיעה צפיפות אופטית של 0.6 ב 600 ננומטר.
3. צנטריפוגה 10 דקות ב 4000 סל"ד (4 ° C) וresuspend גלול ב 5 מ"ל של חיץ 50 mM טריס.
4. Sonicate (תא המשבש, לוס אנג'לס Biosystems) את התאים ב40% מחזור פעולה עם שליטת תפוקה של 4, לשמור את הפתרון על קרח לכל התקופה.
5. צנטריפוגה את התערובת וכתוצאה למשך 5 דקות ב4000 סל"ד ב 4 & דלדוגמה: C כדי להסיר את הפסולת של התאים. העברת supernatant לבקבוקון טרי.
6. לקבוע את ריכוז החלבון הכולל של התמציות הסלולריות על ידי assay ברדפורד. הערה: השתמש בבקבוקוני זכוכית כדי למנוע עלייה של רקע ו ​​/ או אובדן של חלבון.
7. הכן תערובת המכילה 100 מ"ל 0.1% v / v alkane וחיץ 50 מ"מימ טריס-HCl.
8. מחמם את התערובת ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שימו לב: בצע צעד זה רק לאלקאנים שרשרת בינוני ארוכים עם נקודת רתיחה גבוהה. (לדוגמה: C _16: 287 מעלות צלזיוס).
9. כדי להשיג מסיסות אופטימלית של alkane, sonicate ל1 דקות ועדיין חם עד לקבלת תערובת הומוגנית, צמיג מתקבלת.
10. הוסף 1mm של NADH, 1 המ"מ FMN, 1 ₄ המ"מ MgSO ו0.01 V / v טריטון X-100.
11. הכן 6 aliquots מ"ל ב 25 מיליליטר צלוחיות של פקקים סגורים.
12. הוסף כמות מספקת של תמצית תאים (תלוי במבחנים ברדפורד, ריכוז סופי של 5 מ"ג חלבון / ליטר). הכן את שליטה ללא חלבון.
13. לדגור על 60 ° C (לדואר אופטימליnzymatic פעילות) עבור 24 שעות.
14. חלץ את פחמימנים בתקשורת התרבות של אתיל יצטט ולקבוע ריכוז פחמימנים בתרבית תאים על ידי גז כרומטוגרפיה (ראה פרוטוקול 3).
15. חישוב השפלה ליחידה של ביומסה על ידי חלוקת הסכום הכולל של alkane מומר על ידי חלבון מוסף לכל בקבוק (על ידי עקומת כיול ברדפורד). נוספת על ידי חלוקת משך ניסוי מניבה פעילות השפלה ליחידת חלבון תאי ליחידת זמן. הממוצע נלקח מתוך שלוש ריצות בודדות.

4. הפקת אתיל יצטט פחמימנים מדידות ריכוז

1. אלקאנים מופקים מהתמיסה המימית על ידי הוספה יצטט אתיל מ"ל 2.5 (solvant apolar) לפתרון ניסיוני 6 מ"ל. תקן פנימי נוסף לממס בריכוז של 0.1% (נ / ה). סטנדרטי (למשל סקל-decan) מגוון בהתאם הטווח הצפוי של הפסגות של עניין.
2. אופציונלי: הוסף טריטוןX-100 לתערובת המימית וחובצה את הדגימות למשך 10 דקות ב4000 סל"ד כדי לקבל מערכת ראויה דו phasic.
3. מערבולת את התערובת במשך 5 שניות (1,500 סל"ד) ו דגירה בטמפרטורת חדר עד שני השלבים נפרדים.
4. הסר סכום מקסימאלי של השכבה האורגנית (למעלה) וייבש את הממס באמצעות מגנזיום סולפט נטול מים.
5. הסר MgSO ₄ על ידי סינון (0.2 מיקרומטר) ולהעביר את התסנין לבקבוקוני גז כרומטוגרף למדידות, או בחנות ב -20 ° C.
6. לקבוע את הריכוז על ידי גז כרומטוגרפיה באמצעות עמודת 5CB CP-SIL (= אורך 5 מ '). הזרק 10 μl של מדגם במצב פיצול (1:10, 230 מעלות צלזיוס). הגדר את זרימת הגז לעמודת 1 מ"ל / דקה (הליום). תכנית טמפרטורת התנור הבאה משמשת:

   קצב	טמפרטורה [° C]	זמן [דקות]
   0	50	7.5
   50	90	1.0
   50	110	2.0
   50	130	2.0
   50	145	2.0
   50	160	2.0
   50	170	2.0
   50	185	2.0
   50	210	2.0
   50	250	2.0
   50	320	2.0

7. שלב את הפסגות ולתקן את הריכוזים ביחס לסטנדרט הפנימי.

5. אלכוהול / Assay הפעילות dehydrogenase אלדהיד

בדיקה זו בוצעה למעשה על פי השיטה שתוארה על ידי קאטו et al.(2010).

1. תרבות ה תאי coli מבטאים ADH (BBa_K398018) או ALDH (BBa_K398030 גן) ותאים שנשאו וקטור ריק (BBa_J13002) במדיום LB מ"ל 50 עם אנטיביוטיקת הלילה מתאימה.
2. העברת 500 μl של תרבות הלילה ל50 מ"ל של LB הטרי (עם אנטיביוטיקה) ולדגור עד עכירות התא הגיעה צפיפות אופטית של 0.6 ב 600 ננומטר.
3. צנטריפוגה 10 דקות ב 4000 סל"ד ב 4 ° C וresuspend גלול ב 5 מ"ל של חיץ 50 mM טריס.
4. Sonicate פתרון התא ב 40% מחזור פעולה עם שליטת תפוקה של 4 (לשמור על הפתרון בקרח במהלך sonication).
5. צנטריפוגה את התערובת וכתוצאה למשך 5 דקות ב4000 סל"ד ב 4 ° C כדי להסיר שאריות של תאים.
6. קבע לריכוז חלבון טל של תמציות תא על ידי ברדפורד assay (הערה: להשתמש בבקבוקון זכוכית כדי למנוע חלבון מחייב).
7. טען צלחת גם 96 עם 180 μl 57 מ"מ גליצין החיץ המכיל NAD (ריכוז סופי 1 מ"מ, pH 9.5) בכל אחד גם.
8. הוסף 5 μl של האלכוהול (אלדהיד) להיבדק לבארות. הערה: כהלי חום שרשרת ארוכים לפני תחילת הבדיקה יש לנוזל. עבור כל אלכוהול (אלדהיד) שליטה ללא מצע יש להוסיף (שליטה שלילית). בנוסף, להכין ריק המכיל תערובת של חיץ והמצע בלי תמצית תא.
9. מחממי צלחת צלחת הקורא (טקאן מגלה v7.0) במשך 15 דקות ב 37 ° C על מנת לאפשר איזון של המערכת.
10. הוסף כמות מספקת של תמצית תאים (תלוי במבחנים ברדפורד, ריכוז סופי של 5 מ"ג חלבון / ליטר). הכן את שליטה ללא חלבון.
11. מדוד את ייצור NADH באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל של 340 ננומטר כל 2-3 דקות במשך שעות 1 ב 37 ° C.
12. לחשב את קצב ייצור NADH משיפוע OD (340 ננומטר). קח בחשבון את אורך נתיב האור ומקדם ההכחדה של NADH של 6220 ^-1 סנטימטר M ^-1. מחלק את קצב ייצור NADH על ידי הסכום הכולל של חלבון הוסיף להביע את הפעילות של תגובת דהידרוגנז בתמצית התא (חלבוני תא שלמים U / מ"ג). חשבתי את הממוצע וסטיית התקן משלוש ריצות עצמאיות.

6. אפיון pCaiF

1. תרבות ה תאי coli מבטאים pCaiF-GFP המבנה (BBa_K398331 ותאים שנשאו את האמרגן לבד () BBa_K398326) בלילה במדיום LB מ"ל 5 לילה את האנטיביוטיקה המתאימה.
2. לחסן 5 המ"ל M9 המכיל גלוקוז 10 גרם / ליטר ואנטיביוטיקה עם 50 μl של תרבות הלילה ולגדול בין הלילה.
3. 50 μl תת של תולדת הלילה ל5 מ"ל של M9 טרי with10 ג'/ ליטר ולדגור עד עכירות התא הגיע צפיפות אופטית של 0.2 ב 600 ננומטר.
4. טען צלחת גם 96 עם 100 μl של מדיום M9 טרי המכיל את הכמות הרצויה של מקור פחמן לבדיקה בכל אחד גם. לבצע ניסויי שלושה עותקים להערכות סטטיסטיות ולהוסיף בקרות השליליות בהתאמה (E. coli פראי מסוג K12).
5. הוסף 5 μl של תרבות הלילה לבארות המכילות הבינוניות.
6. מדוד את עקומת הגדילה (OD ₆₀₀₎ וGFP פלואורסצנטי (485 ננומטר עירור ופליטה 520) באמצעות קורא צלחת כל 10 דקות במשך 18 שעות ב 37 ° C עם רעד בגוף קבוע.
7. לחשב את שיעור הצמיחה ואת התוכן הספציפי GFP מהמידות המתאימות והשווה לשליטה. חשבתי את הממוצע וסטיית ההתקן של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים.

7. Assay סובלנות

1. תרבותחיידק מבטא גן PhPFDα וβ (BBa_K398406) בלילה במדיום 5 מ"ל LB והאנטיביוטיקה המתאימה. א coli מבטא LADA גן (BBa_K398017) משמש כבקרה שלילית.
2. 10 μl תת של תולדת הלילה ל5 מ"ל הטרי של LB (עם אנטיביוטיקה) ולדגור עד עכירות התא הגיע צפיפות אופטית של 0.3-0.4 ב 600 ננומטר.
3. לדלל את התרבויות עם מדיום טרי עד ₆₀₀ OD של 0.1 הוא הגיע.
4. טען צלחת גם 96 עם מדיום M9 μl 180 המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה ואת הריכוז הסופי התקין של המתחם רעיל (למשל 0, 4, 8, 10% של n-הקסאן) בשלושה עותקים. משום תערובות alkane-מים עלולות להוביל למערכות שני שלבים הוא הכרחי יש בקרה נאותה על הצלחת (למשל דזני ifferent והניסויים הריקים בהתאמה).
5. הוסף 20 μl של התרבות (שליטה) לבארות.
6. למדוד את הריכוז ביומסה (OD ₆₀₀₎ באמצעות קורא צלחת כל 10 דקות במשך 24 שעות ב 37 ° C עם רעד בגוף קבוע.
7. לחשב את שיעורי הצמיחה ממידות בהתאמה לריכוזי הסוכן השונים ולהשוות לשליטה השלילית. חשבתי את הממוצע וסטיית התקן של לפחות שלוש ריצות עצמאיות.

8. מיפוי אינטראקצית homolog

1. בקשתו הייתה שפותחה כדי לבצע שאילתות בחלבון בשרת מסד נתוני PostgreSQL פועל STRING (חינם לשימוש אקדמי) ^20. יישום מיפוי אינטראקצית homologue מזהה חלבונים באינטראקציה באורגניזם המארח המקורי באמצעות מסד נתוני STRING. הרצפים של גני אינטראקצית בהתאמה משמשים בחיפוש יפציץ למצוא הומולוגי גנים באורגניזם היעד. Cytoscape ⁴ משמש כדי לחזות את התוצאה של המיפוי. כלי התוכנה ניתן להוריד אותו בכתובת: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
2. כדי לבצע מיפוי, (1) להזין את זיהוי BioBrick והיישום באופן אוטומטי להוריד את נתוני רצף חלק מהרישום של חלקים סטנדרטיים ביולוגיים ^9, או (2) להיכנס (דבק) את נתוני הרצף ביישום.
3. השתמש באתר האינטרנט של מאגר STRING כדי למצוא את זהות חלבון STRING לרצף החומצות האמיניות שהוזן.
4. חלבון עם הומולוגיה גבוהה נקבע באמצעות פיצוץ. בהמשך היישום מפרט כל חלבון אינטראקציה ידועה באורגניזם המקור ומחפש homologs באורגניזם המארח (חיידק E. למשל).
5. יצוא רשימת אינטראקציה משוערת תוצאה לטקסט או Cytoscape.

תוצאות

Alkane conversion

The activity of the three oxidation steps from the alkane to the respective fatty acid was evaluated using resting cell assays and enzyme activity measurements. The results are presented following the pathway reactions (1) alkane hydroxylase, (2) alcohol dehydrogenase and (3) aldehyde dehydrogenase.
For the first step, different plasmids were constructed for medium and long-chain alkanes. The plasmid BBa_...

Discussion

עיקרון BioBrick משמש לבניית מארז להשפלה של אלקאנים והוכחת עיקרון של הרכיבים הבודדים של ערכת הכלים הושגה. כמה מבחנים מוצעים למדידת in vivo ו במבחנת פעילות של אנזימי מסלול משפיל alkane. העבודה הוצגה מדגימה מספר השיטות שיכולים לשמש כדי לקבוע פעילויות וביטוי אנזים באורג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli K12	New England Biolabs	C2523H
Octane	Fluka	74822
Hexadecane	Fluka	52209
octanol-1	Fluka	95446
dodecanol-1	Sigma-Aldrich	126799
Hexane	Sigma-Aldrich	296090
NADH	Sigma-Aldrich	N4505
FMN	Sigma-Aldrich	F2253
MgSO4	J.T. Baker Casno	7487 889
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
T4 ligase	New England Biolabs	M0202L
Gas chromatograph
Cell disrupter	LA Biosystems	CD-019
Spectrophotometer	Amersham pharmacia	spec 2000
Plate reader	Tecan Group Ltd.	Magellan v7.0
Incubator	Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398014	Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398027	ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398018	ADH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398030	ALDH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398326	pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398331	pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107-	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398406	Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol