Инструментарий, позволяющий конверсии углеводородов в водной среде

Резюме

Устойчивое авто регулирующих бактериальные системы для восстановления нефтяных загрязнений была разработана с использованием стандартных взаимозаменяемых частей ДНК (BioBricks). Инженерии E. палочки Штамма был использован для ухудшают алканов с помощью β-окисления токсичных водной среде. Соответствующих ферментов из различных видов показало, алканов деятельности деградации. Кроме того, повышение толерантности к П-Гексан было достигнуто путем введения генов от алкан-толерантный бактерий.

Аннотация

Эта работа выдвигает набор инструментов, который позволяет превращения алканов кишечной палочки и представляет собой доказательство принципа его применимости. Оно состоит из нескольких стандартных взаимозаменяемых частей (BioBricks) ⁹ адресации преобразования алканов, регуляции экспрессии генов и выживания в токсичные богатой углеводородами окружающей среды.

Трехступенчатый путь к деградации алкана был реализован в E. палочки для того, чтобы преобразования средне-и долгосрочной цепи алканов в соответствующие спирты, alkanals и в конечном итоге алкановых кислот. Последние были усвоены через родной β-окисления пути. Для облегчения окисления средней цепи алканов (C5-C13) и циклоалканов (С5-С8), четыре гена (alkB2, rubA3, rubA4 и Rubb) из алкана системы гидроксилазы от Гордония зр. TF6 ^8,21 были преобразованы в E. палочки. Для преобразованиядлинной цепи алканов (С15-С36), ген ЛАДА Geobacillus thermodenitrificans был реализован. Для необходимые дальнейшие шаги процесса деградации, АДГ и ALDH (исходящие из G. thermodenitrificans) были введены ^10,11. Деятельность измеряли отдыха анализов клеток. Для каждого окислительного шаг, активность фермента не наблюдалось.

Для оптимизации эффективности процесса, выражение было только индуцированных в условиях низкой глюкозы: субстрат-регулируемого промотора, pCaiF, был использован. pCaiF присутствует в E. палочки K12 и регулирует экспрессию генов, участвующих в деградации неглюкозными источников углерода.

В последней части инструментария - таргетинг выживания - был реализован с использованием растворителя генов толерантности, PhPFDα и β, как с Pyrococcus horikoshii OT3. Органические растворители могут вызывать клеточный стресс и снижение живучести отрицательно affectinг сворачивания белка. В качестве сопровождающих, PhPFDα и β улучшения сворачивания белка, например, процесс в рамках присутствии алканов. Экспрессии этих генов привела к улучшению толерантности углеводородного показали повышение темпов роста (до 50%) в присутствиях 10% н-гексана в культуральной среде не наблюдается.

Подводя итоги, результаты показывают, что инструментарий позволяет E. палочки для преобразования и терпеть углеводородов в водной среде. Как таковая, она представляет собой первый шаг на пути устойчивого решения для нефти реабилитации с использованием синтетического подхода биологии.

Введение

Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities ³. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil ¹. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving ³.

To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged ¹. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule ^{7, 21}. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids ⁸. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.

The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C₅-C₁₃ alkanes along with that of C₅-C₈ cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) ^{8, 21}. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C₁₅ up to C₃₆) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 ^{7, 15, 18, 22}. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway ^{7, 21}. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD⁺ as a cofactor ¹⁰. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD⁺-dependent final step in the medium-chain oxidation ¹¹.

In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels ⁶. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components ^{6, 14}.

Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems ¹². Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance ¹⁷.

The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts ⁹. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.

протокол

1. BioBrick Ассамблеи

1. BioBricks из реестра стандартной биологической части осуществляется ИГЕМ штаб-квартиры. Чтобы построить новую BioBrick из существующих BioBricks, переварить доноров BioBrick (до 1,0 мкг) с ферментами EcoRI и SpeI для размещения донора частью вниз по течению от акцепторной части. Дайджест с XbaI и PstI для размещения донора частью вверх по течению от акцепторной части. Добавьте третий соответствующего фермента рестрикции, что сокращение в основу донора. Выполните пищеварения в общем объеме 20-25 мл с соответствующим буфером, в соответствии с поставщика (конечная концентрация 1x). Используйте 5 единиц / мкг ДНК для ферментов рестрикции.
2. Дайджест акцептора BioBrick либо EcoRI и XbaI или SpeI и PstI.
3. Инкубируйте пищеварения (по крайней мере) один час при температуре 37 ° C. Деактивировать рестрикции тепла, инкубации при 80 ° С в течение 10 мин и центрифуги в ближайшее время.
4. Лигируют переваривается BioBrickчастей (доноров и акцепторов) вместе. С XbaI и SpeI создания совместимых концы ДНК, смешанной сайт создан, которые не могут быть сокращены с любым ферментов рестрикции в результате новой "объединенной" BioBrick, что в окружении 4 стандартных сайты рестрикции. В лигирования смеси конечной концентрации ДНК предпочтительно ~ 100 нг / мкл. Выполните реакции лигирования в общем объеме 10-15 мл с T4 буфера лигирования (конечная концентрация 1x) и лигазы Т4 (1 ед / мкг ДНК).
5. Инкубируйте перевязки смеси при 16 ° C в течение не менее 3 часов.
6. Выполнить преобразование реакцию с около половины лигирования смеси.
7. Подтвердите BioBrick правильной последовательности с.
8. Чтобы построить новую BioBrick от синтезированную ДНК, изменить гены для синтеза для оптимальной экспрессии в E. палочка с помощью JCat инструмент веб-сайте ( http://www.jcat.de/ ). Проведение дальнейших модификаций в соответствии с требованиями B ioBrick стандарта. Эта стандартизация подразумевает, что каждый BioBrick состоит из последовательности ДНК интерес префикс и с суффиксом. Префикс и суффикс-последовательности, которые содержат предопределенные сайты рестрикции, которые отсутствуют в остальных плазмиды последовательности. Эти стандартные сайты рестрикции позволяет поменять и продлить BioBrick вставляет гибко ^9. Префиксов и суффиксов имеют следующую последовательность:

Имя	Последовательность	Комментировать
Префикс	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3 "
	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'	Если следующие части кодирующей последовательности или любой его части, которая начинается с "ATG"
Суффикс	5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'

ove_title "> 2. Alkane преобразования отдыха анализа Cell, In Vivo

Этот анализ проводился на основе метода, описанного Фуджи и соавт. (2004).

1. Культура E. кишечной клетки, экспрессирующие Alkane системы гидроксилазы ( BBa_K398014 ) и клеток, несущих пустой вектор ( BBa_J13002 ) в 5 мл LB среде с соответствующими антибиотиками в течение ночи.
2. Передача 500 мкл ночной культуры в 50 мл свежей LB (с антибиотиком) и инкубировать до ячейки мутности достигли OD (оптической плотности) 0,3 при 600 нм.
3. Центрифуга в течение 10 мин при 4000 оборотах в минуту и ​​ресуспендируют осадок в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4).
4. Центрифуга в течение 10 мин при 4000 оборотов в минуту и ​​ресуспендируют осадок в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера теперь содержащих E2 соли и 0,66% объем / объем глицерина (азот deficienт среде).
5. Измерьте клетки мутности (OD _600).
6. Подготовка клетки смеси аликвоты 6 мл в 25 мл закрытой крышкой стеклянной колбы и не-клеточных элементов управления (E2 соли + 0,66% объем / объем глицерина).
7. Добавить 100 нмоль алканов в каждую колбу.
8. Инкубируйте смеси при 37 ° С в течение 24 ч (укоротить, когда более высокие темпы получены).
9. Измерьте OD ₆₀₀ после инкубации.
10. Извлечение углеводородов в культуре средств массовой информации в этилацетат и определения концентрации углеводородов в культуре клеток с помощью газовой хроматографии (см. протокол 3).
11. Рассчитать деградации на единицу биомассы путем деления общей суммы алканов преобразуется общего настоящее биомассы в каждой колбе (конвертировать OD ₆₀₀ на сухой вес). Разделив результат на экспериментальной продолжительность приводит к деградации активность на единицу биомассы в единицу времени. Средняя берется из трех отдельных трасс.

3. Alkane преобразования ферментов анализа, вVitro

Этот анализ был выполнен по существу в соответствии с методом, описанным Li и соавт. (2008).

1. Культура E. кишечной клетки, экспрессирующие ген Lada ( BBa_K398017 ) и клеток, несущих пустой вектор ( BBa_J13002 ) в 50 мл LB среде с соответствующими антибиотиками в течение ночи.
2. Передача 500 мкл ночной культуры в 50 мл свежей LB (с антибиотиком) и инкубировать до ячейки мутности достигли оптической плотности 0,6 при 600 нм.
3. Центрифуга 10 мин при 4000 оборотов в минуту (4 ° C) и ресуспендируют осадок в 5 мл 50 мМ Трис буфера.
4. Разрушать ультразвуком (Cell разрушитель, LA Biosystems) клеток на 40% рабочий цикл с выходом управления 4, держать раствор на льду в течение всего срока.
5. Центрифуга полученную смесь в течение 5 мин при 4000 оборотов в минуту на 4 и Dнапример, C для удаления остатков клеток. Передача супернатант в чистую пробирку.
6. Определение общей концентрации белка в клеточных экстрактах с помощью анализа Брэдфорда. Примечание: используйте стеклянные флаконы, чтобы предотвратить увеличение фона и / или потерю белка.
7. Подготовьте 100 мл смеси, содержащей 0,1% об / об алкана и 50 мМ Трис-HCl буфера.
8. Смесь нагревают при 100 ° С в течение 5 мин. Примечание: Выполните этот шаг только для средне-длинной цепи алканов с высокой температурой кипения. (Например, C _16: 287 ° C).
9. Для достижения оптимальной растворимости алканов, разрушать ультразвуком в течение 1 мин в то же время теплым до получения однородной, вязкой смеси.
10. Добавить 1 мМ НАДН, 1 мМ FMN, 1 мМ MgSO ₄ и 0,01 о / Triton X-100.
11. Подготовить 6 мл аликвоты в 25 мл закрытой крышкой колбы.
12. Добавить достаточного количества клеточного экстракта (в зависимости от анализов Брэдфорд, конечная концентрация 5 мг белка / л). Подготовка нет белка контроль.
13. Инкубировать при 60 ° C (для оптимального электроннойnzymatic деятельности) в течение 24 часов.
14. Извлечение углеводородов в культуре средств массовой информации в этилацетат и определения концентрации углеводородов в культуре клеток с помощью газовой хроматографии (см. протокол 3).
15. Рассчитать деградации на единицу биомассы путем деления общей суммы алканов преобразуется общего белка добавляли к каждой колбе (по калибровочной кривой Bradford). Дальнейшее деление на продолжительность эксперимента приводит к деградации активность на единицу клеточного белка в единицу времени. Средняя берется из трех отдельных трасс.

4. Этиловый ацетат добычи углеводородов и измерения концентрации

1. Алканы извлекают из водного раствора путем добавления 2,5 мл этилацетата (аполярная solvant) до 6 мл экспериментального решения. Внутренний стандарт добавляется в растворитель при концентрации 0,1% (V / V). Стандарт (например, цикло-декан) варьируется в зависимости от ожидаемого диапазона пики интереса.
2. Дополнительно: Добавить TritonX-100 к водной смеси и центрифуги образцов в течение 10 мин при 4000 оборотов в минуту для того, чтобы получить надлежащее двухфазной системе.
3. Vortex смесь в течение 5 секунд (1.500 оборотов в минуту) и инкубировать при комнатной температуре до двух фаз отдельно.
4. Удалить максимальное количество органического слоя (вверху) и высушить растворитель с использованием безводного сульфата магния.
5. Удалить MgSO ₄ путем фильтрации (0,2 мкм) и передать фильтрата в газе флаконы хроматограф для измерения или хранить при -20 ° C.
6. Определить концентрацию газовой хроматографии с использованием CP-SIL 5ЦБ колонка (длина = 5 м). Inject 10 мкл образца в режиме разделенного (1:10, 230 ° C). Установить потока газа в колонке 1 мл / мин (гелий). В следующей программе температуры печи используются:

   Скорость	Температура [° C]	Время [мин]
   0	50	7,5
   50	90	1,0
   50	110	2,0
   50	130	2,0
   50	145	2,0
   50	160	2,0
   50	170	2,0
   50	185	2,0
   50	210	2,0
   50	250	2,0
   50	320	2,0

7. Интеграция пики и исправить концентрации по отношению к внутреннему стандарту.

5. Алкоголь / альдегиддегидрогеназы деятельности пробирного

Этот анализ был выполнен по существу в соответствии с методом, описанным Kato и соавт.(2010).

1. Культура E. кишечной клетки, экспрессирующие АДГ ( BBa_K398018 ) или ALDH ( BBa_K398030 ) генов и клеток, несущих пустой вектор ( BBa_J13002 ) в 50 мл LB среде с соответствующими антибиотиками в течение ночи.
2. Передача 500 мкл ночной культуры в 50 мл свежей LB (с антибиотиком) и инкубировать до ячейки мутности достигли оптической плотности 0,6 при 600 нм.
3. Центрифуга 10 мин при 4000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C и ресуспендируют осадок в 5 мл 50 мМ Трис буфера.
4. Разрушать ультразвуком клетки решения при 40% рабочего цикла с выходом управления 4 (держать раствор на льду во время обработки ультразвуком).
5. Центрифуга полученную смесь в течение 5 мин при 4000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С для удаления остатков клеток.
6. Определите дляТаль концентрации белка клеточных экстрактов по Бредфорда (Примечание: использовать стеклянный флакон для предотвращения связывания с белками).
7. Загрузите 96-луночный планшет с 180 мкл 57 мМ глицина буфер, содержащий NAD (конечная концентрация 1 мМ, рН 9,5) в каждую лунку.
8. Добавьте 5 мкл спирта (альдегид), которые будут проверены на скважинах. Примечание: Тепло спирты с длинной цепью до начала анализа, чтобы жидкость. Для каждого спирта (альдегид) управление без подложки должна быть добавлена ​​(отрицательный контроль). Кроме того, подготовить пустой, содержащий смесь буфера и подложки без клеточного экстракта.
9. Подогрейте тарелки ридер (Tecan Magellan v7.0) в течение 15 мин при 37 ° C, чтобы равновесие системы.
10. Добавить достаточного количества клеточного экстракта (в зависимости от анализов Брэдфорд, конечная концентрация 5 мг белка / л). Подготовка нет белка контроль.
11. Измерьте NADH производства с использованием спектрофотометра при длине волны 340 нм каждые 2-3 мин в течение 1 часа при 37 ° C.
12. Рассчитать NADH дебит по наклону OD (340 нм). Примите во внимание длину пути света и коэффициента экстинкции NADH из 6220 М ^-1 см ^-1. Разделите NADH уровень добычи на общее количество белка добавил, чтобы выразить активность дегидрогеназы реакции в клеточный экстракт (U / мг общего белка клетки). Рассчитать среднее и стандартное отклонение от трех независимых трасс.

6. Характеристика pCaiF

1. Культура E. кишечной клетки, экспрессирующие pCaiF-GFP конструкции ( BBa_K398331 ) и клеток, несущих промоутером в одиночку ( BBa_K398326 ) в течение ночи в 5 мл LB среднего соответствующими антибиотиками в течение ночи.
2. Инокулировать 5 мл M9, содержащей 10 г / л глюкозы и антибиотиков с 50 мкл ночной культуры и расти в течение ночи.
3. Субкультура 50 мкл в течение ночи результатом в 5 мл свежего M9 с 10 г / л и инкубировать до ячейки мутности достигли оптической плотности 0,2 при 600 нм.
4. Загрузите 96-луночный планшет с 100 мкл свежей среды M9 содержащие необходимое количество источника углерода для тестирования в каждую лунку. Выполните трех экземплярах экспериментов для статистической оценки и добавить соответствующий отрицательный контроль (дикого типа E.coli К12).
5. Добавьте 5 мкл ночной культуры в среде, содержащей скважин.
6. Измерьте кривой роста (OD ₆₀₀₎ и флуоресценции GFP (485 нм возбуждения излучения и 520), используя ридер каждые 10 мин в течение 18 ч при температуре 37 ° C с постоянной тряски.
7. Рассчитать скорость роста и конкретного содержания GFP из соответствующих измерений и сравнить с управлением. Рассчитать среднее и стандартное отклонение по крайней мере трех независимых экспериментах.

7. Толерантность анализа

1. КультураE.coli, выразив PhPFDα и β гена ( BBa_K398406 ) в течение ночи в 5 мл среды LB и соответствующие антибиотики. Е. палочки выражения Лада гена ( BBa_K398017 ) используется в качестве отрицательного контроля.
2. Субкультура 10 мкл ночь вырост на свежий 5 мл LB (с антибиотиком) и инкубировать до ячейки мутности достигли оптической плотности от 0,3 до 0,4 при 600 нм.
3. Развести культур со свежей среде до OD ₆₀₀ в 0,1 достигнут.
4. Загрузите 96-луночный планшет с 180 мкл среды M9 содержащей соответствующие антибиотики и надлежащего конечной концентрации токсичных соединений (например, 0, 4, 8, 10% н-гексан) в трех экземплярах. Потому что алканов смесей воды может привести к двухфазных системах, необходимо иметь соответствующие элементы управления на тарелку (например, Different штаммов и соответствующих пустых экспериментов).
5. Добавить 20 мкл культуры (контроля) в лунки.
6. Измерение концентрации биомассы (OD ₆₀₀₎ использованием ридер каждые 10 мин в течение 24 ч при температуре 37 ° C с постоянной тряски.
7. Рассчитайте темпы роста от соответствующих измерений для различных концентрациях агента и по сравнению с отрицательным контролем. Рассчитать среднее и стандартное отклонение по крайней мере трех независимых трасс.

8. Взаимодействие карт гомолога

1. Приложение HIM была разработана для выполнения белком запросов PostgreSQL сервер баз данных STRING (бесплатно для академического использования) ^20. Отображение гомолог взаимодействия приложение определяет взаимодействующих белков в оригинальной организма-хозяина, используя строку базы данных. Последовательности соответствующих генов взаимодействуют используется в доменной поиска, чтобы найти гомологичных генов в целевой организма. Cytoscape ⁴ используется для визуализации результатов сопоставления. HIM программное средство можно загрузить по адресу: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
2. Чтобы выполнить отображение (1) ввести ID BioBrick и приложение будет автоматически загружать часть последовательности данных из реестра стандартной биологической части ^9, или (2) Введите (паста) последовательность данных в приложении.
3. Использование веб-сайта STRING баз данных, чтобы найти ID STRING белка для введенного аминокислотной последовательности.
4. Белка с высокой степенью гомологии определяется с помощью BLAST. Впоследствии приложение содержит список всех известных белков, взаимодействующих в организме источников и поиска гомологов в организме хозяина (например, кишечная палочка).
5. Экспорт в результате предполагаемого списка взаимодействия с текстом или Cytoscape.

Результаты

Alkane conversion

The activity of the three oxidation steps from the alkane to the respective fatty acid was evaluated using resting cell assays and enzyme activity measurements. The results are presented following the pathway reactions (1) alkane hydroxylase, (2) alcohol dehydrogenase and (3) aldehyde dehydrogenase.
For the first step, different plasmids were constructed for medium and long-chain alkanes. The plasmid BBa_...

Обсуждение

Принцип BioBrick используется для создания шасси для деградации алканов и доказательство принципа для отдельных компонентов набора инструментальных средств было получено. Несколько анализов предлагается измерять в естественных условиях и в пробирке деятельности алкана ферме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli K12	New England Biolabs	C2523H
Octane	Fluka	74822
Hexadecane	Fluka	52209
octanol-1	Fluka	95446
dodecanol-1	Sigma-Aldrich	126799
Hexane	Sigma-Aldrich	296090
NADH	Sigma-Aldrich	N4505
FMN	Sigma-Aldrich	F2253
MgSO4	J.T. Baker Casno	7487 889
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
T4 ligase	New England Biolabs	M0202L
Gas chromatograph
Cell disrupter	LA Biosystems	CD-019
Spectrophotometer	Amersham pharmacia	spec 2000
Plate reader	Tecan Group Ltd.	Magellan v7.0
Incubator	Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398014	Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398027	ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398018	ADH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398030	ALDH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398326	pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398331	pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107-	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398406	Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol