Une boîte à outils pour permettre la conversion d'hydrocarbures en milieu aqueux

Résumé

Un système de régulation automatique durable bactérienne pour l'assainissement des pollutions pétrolières a été conçu en utilisant des pièces interchangeables (ADN BioBricks). Une ingénierie E. coli Les contraintes a été utilisée pour dégrader les alcanes par β-oxydation dans des milieux aqueux toxiques. Les enzymes respectives de différentes espèces ont montré une activité dégradation alcane. En outre, une tolérance accrue à N-Hexane a été réalisée par l'introduction de gènes de bactéries résistantes alcane.

Résumé

Ce travail met en avant un ensemble d'outils qui permet la conversion d'alcanes par Escherichia coli et présente une preuve de principe de son applicabilité. La boîte à outils se compose de plusieurs éléments standards interchangeables (BioBricks) ⁹ portant sur ​​la conversion d'alcanes, la régulation de l'expression génique et la survie des toxiques riches en hydrocarbures environnements.

Un parcours en trois étapes pour la dégradation de l'alcane a été mis en œuvre dans E. coli afin de permettre la conversion d'alcanes à moyen et à longue chaîne à leurs alcanols, alcanals respectives et, finalement, des acides alcanoïque. Ces derniers ont été métabolisé par le natif de β-oxydation voie. Pour faciliter l'oxydation des alcanes à chaîne moyenne (C5-C13) et de cycloalcanes (C5-C8), quatre gènes (alkB2, rubA3, rubA4 et Rubb) du système alcane hydroxylase de Gordonia sp. TF6 ^8,21 ont été transformés en E. coli. Pour la conversion desalcanes à longue chaîne (C15-C36), le gène de Lada thermodenitrificans Geobacillus a été mis en œuvre. Pour les autres étapes nécessaires du processus de dégradation, l'ADH et l'ALDH (provenant de thermodenitrificans G.) ont été introduites ^10,11. L'activité a été mesurée par des dosages de cellules au repos. Pour chaque étape d'oxydation, l'activité enzymatique a été observée.

Afin d'optimiser l'efficacité des processus, l'expression n'a été induite dans des conditions hypoglycémie: un promoteur régulé substrat, pCaiF, a été utilisé. pCaiF est présent dans E. coli K12 et régule l'expression des gènes impliqués dans la dégradation de la source de carbone non-glucose.

La dernière partie de la trousse à outils - le ciblage de survie - a été mis en œuvre en utilisant des gènes de tolérance solvants, PhPFDα et β, deux de Pyrococcus horikoshii OT3. Les solvants organiques peuvent induire un stress cellulaire et une diminution de la survie par négativement affectinrepliement des protéines g. Comme chaperons, PhPFDα et β améliorer le processus de repliement des protéines, par exemple en présence d'alcanes. L'expression de ces gènes conduit à une tolérance améliorée d'hydrocarbures montré un taux de croissance élevé (jusqu'à 50%) dans les présences de 10% de n-hexane dans le milieu de culture ont été observés.

En résumé, les résultats indiquent que la boîte à outils permet E. coli à convertir et à tolérer les hydrocarbures dans les milieux aqueux. En tant que tel, il constitue une première étape vers une solution durable pour le pétrole-remédiation en utilisant une approche de biologie synthétique.

Introduction

Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities ³. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil ¹. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving ³.

To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged ¹. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule ^{7, 21}. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids ⁸. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.

The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C₅-C₁₃ alkanes along with that of C₅-C₈ cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) ^{8, 21}. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C₁₅ up to C₃₆) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 ^{7, 15, 18, 22}. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway ^{7, 21}. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD⁺ as a cofactor ¹⁰. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD⁺-dependent final step in the medium-chain oxidation ¹¹.

In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels ⁶. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components ^{6, 14}.

Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems ¹². Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance ¹⁷.

The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts ⁹. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.

Protocole

1. BioBrick Assemblée

1. BioBricks du Registre de pièces normalisées biologiques sont fournis par le siège iGEM. Pour construire une nouvelle BioBrick de BioBricks existants, digérer le donateur (jusqu'à 1,0 mg) BioBrick par les enzymes EcoRI et Spel pour le positionnement de la partie aval des bailleurs de fonds de la part accepteur. Digestion par XbaI et PstI pour positionner le donneur de la pièce en amont de la partie accepteur. Ajouter une troisième enzyme de restriction appropriée qui coupe dans le squelette du donneur. Effectuer les digestions dans un volume total de 20-25 ml avec le tampon approprié, selon le fournisseur (concentration finale 1x). Utilisez 5 unités / mg d'ADN pour les enzymes de restriction.
2. Digérer l'accepteur BioBrick soit avec EcoRI et XbaI ou Spel et PstI.
3. Incuber les digestions pour (au moins) une heure à 37 ° C. Inactiver les endonucléases de restriction par la chaleur, l'incubation à 80 ° C pendant 10 min et centrifugation sous peu.
4. Ligaturer le BioBrick digéréparties (donneur et accepteur) ensemble. Depuis Xbal et Spel générer des extrémités d'ADN compatibles, un site mixte est créé, qui ne peut pas être coupé avec une enzyme de restriction résultant en une nouvelle «combiné» BioBrick qui flanquaient par les 4 sites de restriction standard. Dans le mélange de ligature de la concentration finale en ADN est de préférence ~ 100 ng / ul. Effectuer la réaction de ligature dans un volume total de 10-15 ml avec le tampon de ligature T4 (concentration finale 1 x) et la T4 ligase (1 unité / mg d'ADN).
5. Incuber le mélange de ligature à 16 ° C pendant au moins 3 h.
6. Effectuer réaction de transformation de la moitié vers le mélange de ligature.
7. Confirmez le BioBrick comme correctes pour le séquençage.
8. Pour construire une nouvelle BioBrick de l'ADN synthétisé, de modifier les gènes de synthèse pour une expression optimale dans E. coli à l'aide de l'outil de site JCAT ( http://www.jcat.de/ ). Apporter d'autres modifications, conformément aux exigences de la B ioBrick standard. Cette standardisation implique que chaque BioBrick est composé d'une séquence d'ADN d'intérêt précédée d'un préfixe et d'un suffixe suivi. Le préfixe et le suffixe sont des séquences qui contiennent des sites de restriction prédéfinis, qui sont absents dans le reste de la séquence du plasmide. Ces sites de restriction standards permettent d'échanger et de prolonger les inserts BioBrick flexible ^9. Les préfixes et suffixes ont les séquences suivantes:

Nom	Séquence	Commenter
Préfixe	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'	Si la partie qui suit est une séquence codante ou toute partie qui commence par "ATG"
Suffixe	5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'

ove_title "> 2. Conversion alcane cellule de dosage de repos, In Vivo

Cet essai a été effectué sur la base de la méthode décrite par Fujii et al. (2004).

1. Culture E. coli exprimant les cellules du système alcane hydroxylase ( BBa_K398014 ) et les cellules portant un vecteur vide ( BBa_J13002 ) dans 5 ml de milieu LB avec des antibiotiques appropriés pendant la nuit.
2. Transfert 500 pi de la culture d'une nuit dans 50 ml de LB frais (avec un antibiotique) et incuber jusqu'à ce que la turbidité des cellules a atteint une DO (densité optique) de 0,3 à 600 nm.
3. Centrifuger pendant 10 min à 4000 rpm et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4).
4. Centrifuger à nouveau pendant 10 min à 4000 rpm et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M contenant des sels maintenant E2 et 0,66% v / v de glycérol (azote carencest moyen).
5. Mesurer la turbidité cellulaire (DO _600).
6. Préparer cellule-mélange des aliquotes de 6 ml dans des flacons de 25 ml en verre fermé d'assemblage et les contrôles non-cellulaires (E2 + 0,66 sels% v / v de glycérol).
7. Ajouter 100 nmol d'alcane dans chaque flacon.
8. Incuber les mélanges à 37 ° C pendant 24 heures (raccourcir lorsque des taux plus élevés sont obtenus).
9. Mesurer la DO ₆₀₀ après incubation.
10. Extraire les hydrocarbures dans les milieux de culture par l'acétate d'éthyle et de déterminer la concentration d'hydrocarbures en culture cellulaire par chromatographie en phase gazeuse (voir le protocole 3).
11. Calculer la dégradation par unité de biomasse en divisant la quantité totale d'alcane converti par la biomasse totale présente dans chaque fiole (OD ₆₀₀ à convertir la matière sèche). En divisant le résultat par la durée expérimentale donne l'activité de dégradation par unité de biomasse par unité de temps. La moyenne est calculée à partir de trois points différents.

3. Essai alcane enzyme de conversion, enVitro

Cet essai a été réalisé essentiellement selon la méthode décrite par Li et al. (2008).

1. Culture E. cellules de E. coli exprimant le gène de Lada ( BBa_K398017 ) et les cellules portant un vecteur vide ( BBa_J13002 ) dans 50 ml de milieu LB avec des antibiotiques appropriés pendant la nuit.
2. Transfert 500 pi de la culture d'une nuit dans 50 ml de LB frais (avec un antibiotique) et incuber jusqu'à ce que la turbidité des cellules a atteint une densité optique de 0,6 à 600 nm.
3. Centrifuger 10 min à 4000 rpm (4 ° C) et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon Tris 50 mM.
4. Soniquer (cellulaire perturbateur, LA Biosystems), les cellules à rapport cyclique de 40% avec une commande de sortie de 4, maintenir la solution sur de la glace pendant toute la durée.
5. Centrifuger le mélange résultant pendant 5 min à 4000 rpm à 4 & dpar exemple, C pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
6. Déterminer la concentration totale en protéines des extraits cellulaires par dosage de Bradford. Remarque: Utilisez des flacons en verre pour empêcher l'augmentation du fond et / ou la perte de protéines.
7. Préparer un mélange 100 ml contenant 0,1% en volume / volume d'alcane et 50 mM de tampon Tris-HCl.
8. Chauffer le mélange à 100 ° C pendant 5 min. Remarque: Effectuez cette étape uniquement pour les alcanes à chaîne moyenne et longue avec un point d'ébullition élevé. (Par exemple C _16: 287 ° C).
9. Pour obtenir une solubilité optimale de l'alcane, une sonication pendant 1 min encore chaude jusqu'à ce qu'une homogène, mélange visqueux est obtenu.
10. Ajouter 1 mM de NADH, 1 mM FMN, 1 mM de MgSO ₄ et 0,01 v / v de Triton X-100.
11. Préparez 6 ml d'aliquotes de 25 ml à bouchon fermé flacons.
12. Ajouter une quantité suffisante d'extrait cellulaire (dépend de tests Bradford, la concentration finale de 5 mg de protéine / l). Préparer un témoin sans protéines.
13. Incuber à 60 ° C (par e optimalenzymatic activité) pendant 24 heures.
14. Extraire les hydrocarbures dans les milieux de culture par l'acétate d'éthyle et de déterminer la concentration d'hydrocarbures en culture cellulaire par chromatographie en phase gazeuse (voir le protocole 3).
15. Calculer la dégradation par unité de biomasse en divisant la quantité totale d'alcane converti en protéine totale dans chaque fiole (par Bradford courbe d'étalonnage). En outre la division de la durée du test donne l'activité de dégradation par unité de protéine cellulaire par unité de temps. La moyenne est calculée à partir de trois points différents.

4. Ethyl Acetate extraction d'hydrocarbures et de concentration

1. Alcanes sont extraits de la solution aqueuse en ajoutant 2,5 ml d'acétate d'éthyle (solvant apolaire) pour solution expérimentale 6 ml. Un étalon interne est ajouté au solvant à une concentration de 0,1% (v / v). La norme (par exemple cyclo-décane) varie en fonction de la fourchette prévue des pics d'intérêt.
2. Facultatif: Ajouter TritonX-100 pour le mélange aqueux et centrifuger les échantillons pendant 10 min à 4000 rpm afin d'obtenir un bon système biphasique.
3. Vortex le mélange pendant 5 sec (1,500 rpm) et incuber à température ambiante jusqu'à ce que les deux phases se séparent.
4. Suppression d'un montant maximal de la couche organique (en haut) et sécher le solvant en utilisant du sulfate de magnésium anhydre.
5. Retirer MgSO ₄ par filtration (0,2 um) et transférer le filtrat dans des flacons chromatographe en phase gazeuse pour la mesure, ni le conserver à -20 ° C.
6. Déterminer la concentration par chromatographie en phase gazeuse en utilisant une colonne CP-SIL 5CB (longueur = 5 m). Injecter 10 ul d'échantillon en mode split (1:10, 230 ° C). Régler le débit de gaz colonne à 1 ml / min (Hélium). Le programme du four suivant la température est utilisée:

   Taux	Température [° C]	Temps [min]
   0	50	7,5
   50	90	1,0
   50	110	2,0
   50	130	2,0
   50	145	2,0
   50	160	2,0
   50	170	2,0
   50	185	2,0
   50	210	2,0
   50	250	2,0
   50	320	2,0

7. Intégrer les pics et corriger les concentrations par rapport à l'étalon interne.

5. Alcool / Test d'activité aldéhyde déshydrogénase

Cet essai a été réalisé essentiellement selon la méthode décrite par Kato et al.(2010).

1. Culture E. cellules de E. coli exprimant l'ADH ( BBa_K398018 ) ou ALDH ( BBa_K398030 ) des gènes et des cellules portant un vecteur vide ( BBa_J13002 ) dans 50 ml de milieu LB avec des antibiotiques appropriés pendant la nuit.
2. Transfert 500 pi de la culture d'une nuit dans 50 ml de LB frais (avec un antibiotique) et incuber jusqu'à ce que la turbidité des cellules a atteint une densité optique de 0,6 à 600 nm.
3. Centrifuger 10 min à 4000 rpm à 4 ° C et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon Tris 50 mM.
4. Soniquer la solution de cellules au facteur de marche 40%, avec une commande de sortie de 4 (maintenir la solution sur de la glace pendant la sonication).
5. Centrifuger le mélange résultant pendant 5 min à 4000 rpm à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
6. Déterminer le àconcentration en protéines tal des extraits cellulaires par Bradford dosage (Remarque: utiliser un flacon en verre pour empêcher la liaison des protéines).
7. Chargez une plaque de 96 puits avec 180 pl 57 mM tampon glycine contenant du NAD (concentration finale 1 mM, pH 9,5) dans chaque puits.
8. Ajouter 5 ul de l'alcool (aldéhyde) à tester dans les puits. Remarque: les alcools à longue chaîne de chaleur avant le début de l'essai d'avoir un liquide. Pour chaque alcool (aldéhyde) un contrôle sans substrat doit être ajouté (témoin négatif). En outre, de préparer une ébauche qui contient un mélange de tampon et le substrat sans extrait cellulaire.
9. Préchauffer la plaque de la plaque (Tecan Magellan v7.0) lecteur pendant 15 min à 37 ° C pour permettre l'équilibrage du système.
10. Ajouter une quantité suffisante d'extrait cellulaire (dépend de tests Bradford, la concentration finale de 5 mg de protéine / l). Préparer un témoin sans protéines.
11. Mesurer la production de NADH l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 340 nm toutes les 2-3 minutes pendant 1 heure à 37 ° C.
12. Calculer le taux de production de NADH à partir de la pente de la DO (340 nm). Prendre en compte la longueur de trajet de la lumière et le coefficient d'extinction du NADH de 6220 M ^-1 cm ^-1. Diviser le rythme de production de NADH par la quantité totale de protéine ajoutée à exprimer l'activité de la déshydrogénase de réaction dans l'extrait cellulaire (U / mg de protéine de cellule entière). Calculer la moyenne et l'écart type de trois essais indépendants.

6. Caractérisation pCaiF

1. Culture E. cellules exprimant la construction coli pCaiF-GFP ( BBa_K398331 ) et les cellules portant le promoteur seul ( BBa_K398326 ) pendant une nuit dans 5 ml de milieu LB les antibiotiques appropriés pendant la nuit.
2. Inoculer 5 ml M9 contenant 10 g / l de glucose et les antibiotiques avec 50 ul de la culture de la nuit et du jour au lendemain se développer.
3. Subculture 50 pl de l'excroissance du jour au lendemain dans 5 ml de frais M9 avec 10 g / l et incuber jusqu'à ce que la turbidité des cellules a atteint une densité optique de 0,2 à 600 nm.
4. Chargez une plaque de 96 puits avec 100 ul de milieu M9 frais contenant la quantité désirée de source de carbone pour les essais dans chaque puits. Effectuer trois expériences pour l'évaluation statistique et ajoutez les contrôles respectifs négatifs (de type sauvage de E. coli K12).
5. Ajouter 5 ul de la culture d'une nuit dans les puits milieu contenant.
6. Mesurer la courbe de croissance (DO ₆₀₀₎ et fluorescence de la GFP (485 nm d'excitation et 520 émissions) en utilisant un lecteur de plaque toutes les 10 minutes pendant 18 heures à 37 ° C avec une agitation constante.
7. Calculer le taux de croissance et la teneur en GFP spécifique des mesures respectives et le comparer au contrôle. Calculer la moyenne et l'écart type d'au moins trois expériences indépendantes.

7. Essai de tolérance

1. CultureE. coli exprimant le gène PhPFDα et β ( BBa_K398406 ) pendant une nuit dans 5 ml de milieu LB et les antibiotiques appropriés. E. coli exprimant Lada gène ( BBa_K398017 ) est utilisé comme contrôle négatif.
2. Subculture 10 pi du jour au lendemain en conséquence frais 5 ml de LB (avec un antibiotique) et incuber jusqu'à ce que la turbidité des cellules a atteint une densité optique de 0,3 à 0,4 à 600 nm.
3. Diluer les cultures avec du milieu frais jusqu'à _une DO600 de 0,1 est atteint.
4. Chargez une plaque de 96 puits avec 180 ul de milieu M9 contenant les antibiotiques appropriés et la concentration finale appropriée du composé toxique (par exemple, 0, 4, 8, 10% de n-hexane) en trois exemplaires. Parce que alcane mélanges d'eau et pourrait conduire à des systèmes à deux phases, il est essentiel d'avoir des contrôles appropriés sur la plaque (par exemple, différents souches et les expériences respectives en blanc).
5. Ajouter 20 ul de la culture (contrôle) dans les puits.
6. Mesurer la concentration de la biomasse (OD ₆₀₀₎ en utilisant un lecteur de plaque toutes les 10 minutes pendant 24 heures à 37 ° C avec une agitation constante.
7. Calculer les taux de croissance à partir des mesures respectives pour les différentes concentrations de l'agent et le comparer au contrôle négatif. Calculer la moyenne et l'écart type d'au moins trois essais indépendants.

8. Cartographie interaction homologue

1. L'application a été développée pour LUI effectuer des requêtes de protéines sur un serveur PostgreSQL la base de données STRING (gratuit pour un usage académique) ^20. L'application de cartographie homologue de l'interaction identifie les protéines qui interagissent dans l'organisme hôte d'origine en utilisant la base de données STRING. Les séquences des gènes respectifs interaction sont utilisés dans une recherche BLAST pour trouver des gènes homologues dans l'organisme cible. Cytoscape ⁴ est utilisé pour visualiser le résultat de la cartographie. L'outil logiciel HIM peut être téléchargé à l'adresse: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
2. Pour effectuer une cartographie, (1) entrez l'ID BioBrick et l'application va automatiquement télécharger les données de séquence de pièces tirées du Registre des standards biologiques Pièces ^9, ou (2) ENTRER (coller) les données de séquence dans l'application.
3. Utilisez le site Web de la base de données STRING pour trouver l'ID de protéines STRING pour la séquence d'acides aminés entré.
4. Une protéine ayant une forte homologie est déterminée en utilisant BLAST. Par la suite, l'application répertorie chaque protéine d'interaction connue dans l'organisme source et recherche des homologues dans l'organisme hôte (par exemple E. coli).
5. Exporter découlant liste interaction putative de texte ou Cytoscape.

Résultats

Alkane conversion

The activity of the three oxidation steps from the alkane to the respective fatty acid was evaluated using resting cell assays and enzyme activity measurements. The results are presented following the pathway reactions (1) alkane hydroxylase, (2) alcohol dehydrogenase and (3) aldehyde dehydrogenase.
For the first step, different plasmids were constructed for medium and long-chain alkanes. The plasmid BBa_...

Discussion

Le principe BioBrick est utilisé pour construire un châssis pour la dégradation des alcanes et une preuve de principe pour les composants individuels de la boîte à outils a été obtenu. Plusieurs dosages sont proposés pour mesurer l'in vivo et in vitro l'activité des enzymes de la voie d'alcanes dégradantes. Le travail présenté démontre avec succès un certain nombre de méthodes qui peuvent être utilisées pour déterminer l'activité des enzymes et de l'expression dan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli K12	New England Biolabs	C2523H
Octane	Fluka	74822
Hexadecane	Fluka	52209
octanol-1	Fluka	95446
dodecanol-1	Sigma-Aldrich	126799
Hexane	Sigma-Aldrich	296090
NADH	Sigma-Aldrich	N4505
FMN	Sigma-Aldrich	F2253
MgSO4	J.T. Baker Casno	7487 889
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
T4 ligase	New England Biolabs	M0202L
Gas chromatograph
Cell disrupter	LA Biosystems	CD-019
Spectrophotometer	Amersham pharmacia	spec 2000
Plate reader	Tecan Group Ltd.	Magellan v7.0
Incubator	Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398014	Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398027	ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398018	ADH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398030	ALDH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398326	pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398331	pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107-	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398406	Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol