Sulu Ortamlarda Hidrokarbon Dönüşüm Enable A Toolkit

Özet

Petrol kirliliğinin iyileştirilmesi için bakteriyel sistemini düzenleyen sürdürülebilir bir otomatik standart değiştirilebilir DNA parçalarının (BioBricks) kullanılarak tasarlanmıştır. Bir mühendislik E. coli Gerilme toksik sulu ortamlarda β-oksidasyon yoluyla alkanlar indirgemek için kullanıldı. Farklı türlerden ilgili enzimler alkan bozulması aktivite göstermiştir. Için Ayrıca, artan bir tolerans N-Hekzan alkan dayanıklı bakterilerden gen değişimleri elde edilmiştir.

Özet

Bu çalışma ileriye Escherichia coli alkan dönüşüm sağlayan ve uygulanabilirlik ilkesinin bir kanıtı sunan bir araç koyar. Toolkit çoklu standart değiştirilebilir parçalar (BioBricks) ⁹ alkan dönüşüm, toksik hidrokarbon zengini ortamlarda gen ekspresyonu ve sağkalım düzenlenmesi ele oluşur.

Alkan bozulması için üç aşamalı yolun E. uygulanmıştır kendi alkanoller, alkanals ve sonuçta alkanoik asitler, orta ve uzun zincirli alkanlar dönüşümü sağlamak için coli. Ikincisi doğal β-oksidasyon yol üzerinden metabolize edildi. Orta-zincirli alkanlar (C5-C13) sikloalkanlar ve (C5-C8), Gordonia sp alkan hidroksilaz sistemi dört gen (alkB2, rubA3, rubA4 ve kolla) 'nin oksidasyonu kolaylaştırmak için. TF6 ^8,21 E. dönüştü coli. Ve dönüşüm içinUzun zincirli alkanlar (C15-C36), Geobacillus thermodenitrificans dan Lada gen uygulanmıştır. Bozulması sürecinin gerekli ileri adımlar için, ADH ve ALDH (G. thermodenitrificans menşeli) ^10,11 tanıtıldı. Istirahat etkinlik hücrelerin analizi ile ölçülmüştür. Her oksidatif adım için, enzim aktivitesi gözlendi.

Süreci etkinliği optimize etmek için, ifade sadece düşük glikoz koşullar altında uyarılmıştır: bir alt-tabaka ile düzenlenen promotör, pCaiF kullanılmıştır. pCaiF E. mevcut coli K12 ve non-glikoz karbon kaynaklarının bozulma içerdiği genlerin ekspresyonunu düzenlemektedir.

Setinin son bölümü - yaşama hedefleme - PhPFDα ve β çözücü dayanıklılık genlerinin, Pyrococcus horikoshii OT3 hem kullanılarak uygulanmıştır. Organik solventler olumsuz affectin tarafından hücrenin stres neden ve beka azalmış olabilirg protein katlanması. Şaperonlar olarak, PhPFDα ve β alkan varlığı altında protein katlama işlemi örneğin arttırır. Kültür ortamı içinde% 10 n-heksan suretin artan bir büyüme oranı (% 50'ye kadar) ile gösterilen bir hidrokarbon iyileştirilmiş tolerans yol açmıştır, bu genlerin ekspresyonu görülmüştür.

Özetleme, sonuç seti E. sağlar belirtmek Sulu ortamlarda hidrokarbon dönüştürmek ve tolere coli. Bu nedenle, bir sentetik biyoloji yaklaşım kullanarak petrol iyileştirme için sürdürülebilir bir çözüm bulunması yönünde bir ilk adımdır.

Giriş

Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities ³. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil ¹. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving ³.

To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged ¹. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule ^{7, 21}. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids ⁸. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.

The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C₅-C₁₃ alkanes along with that of C₅-C₈ cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) ^{8, 21}. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C₁₅ up to C₃₆) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 ^{7, 15, 18, 22}. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway ^{7, 21}. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD⁺ as a cofactor ¹⁰. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD⁺-dependent final step in the medium-chain oxidation ¹¹.

In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels ⁶. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components ^{6, 14}.

Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems ¹². Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance ¹⁷.

The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts ⁹. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.

Protokol

1. BioBrick Meclisi

1. Standart Biyolojik parçaları Sicilinden BioBricks iGEM merkez tarafından sağlanmaktadır. Mevcut BioBricks yeni bir BioBrick oluşturmak için, alıcı kısmın verici parça aşağı konumlandırılması için enzimler EcoRI ve SpeI ile verici BioBrick (en fazla 1.0 ug) sindirimi. Alıcı kısmının yukan verici parça konumlandırılması için Xbal ve PstI ile Digest. Donör omurgasında kesen bir üçüncü uygun restriksiyon enzimi ekleyin. Satıcı (nihai konsantrasyon 1 x) 'ye göre, uygun bir tampon ile 20-25 ml'lik bir toplam hacim içinde sindirimler gerçekleştirin. Restriksiyon enzimleri için 5 adet / mg DNA kullanın.
2. EcoRI ve Xbal ya da SpeI ve PstI ile ya da alıcı BioBrick özet.
3. 37. az bir saat (en az) için sindirimler inkübe ° C. Kısıtlama ısı endonükleazları Inactivate, 80 inkübasyon süre 10 dakika ve santrifüj ° C.
4. Sindirilmiş BioBrick Arterbirlikte parçaları (verici ve alıcı). Xbal ve SpeI uyumlu DNA uçları oluşturur yana, bir karma site 4 standart kısıtlama siteleri ile çevrili yeni bir 'birleşik' BioBrick sonuçlanan herhangi bir restriksiyon enzimi ile kesilmiş olamaz oluşturulur. Ligasyon karışımı, bir son DNA konsantrasyonu, tercihen ~ 100 ng / ml 'den. T4 ligasyon tampon (nihai konsantrasyon 1 x) ve T4 ligaz (1 ünite / ug DNA) birlikte 10-15 ml'lik toplam hacim içinde ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin.
5. En azından 3 saat için 16 ° C 'de ligasyon karışımı inkübe edin.
6. Ligasyon karışımı yaklaşık yarısı dönüşüm reaksiyonu gerçekleştirin.
7. Sıralama ile doğru olmak BioBrick onaylayın.
8. Sentezlenen DNA 'sından yeni BioBrick inşa etmek için, E. optimum ifade için sentez genleri için değiştirmek JCat web sitesi aracının (vasıtasıyla coli http://www.jcat.de/ ). B gereklerine uygun olarak daha fazla değişiklik yapın ioBrick standart. Bu standardizasyon her BioBrick bir önek öncesinde ve sonek ardından ilgi DNA dizisi oluşur anlamına gelir. Önek ve sonek kalan plazmid sırayla bulunmadığına önceden tanımlanmış kısıtlama siteleri içeren dizileri vardır. Bunlar standart kısıtlama siteleri değiştokuşu ve ⁹ esnek BioBrick ekler uzatmak mümkün kılar. Önek ve sonek aşağıdaki dizileri var:

Isim	Sıra	Yorumlamak
Önek	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'	Aşağıdaki parçası kodlama sırası veya "ATG" ile başlayan herhangi bir bölümü ise
Sonek	5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'

In Vivo ove_title "> 2. Alkan Dönüşüm Dinlenme Hücre Deneyi,

Bu tahlil, Fujii ve diğ. (2004) tarafından tarif edilen yönteme göre yapıldı.

1. Kültür E. Alkan Hidroksilaz sistemi (eksprese coli hücreleri BBa_K398014 bir boş vektör (taşıma) ve hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 5 ml LB ortam içinde).
2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.3 bir OD (optik yoğunluk) ulaşana kadar inkübe edilir.
3. 4,000 rpm'de 10 dakika boyunca santrifüje ve 5 ml 0.1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde tekrar süspansiyon pelet.
4. 4,000 rpm'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüje ve artık E2 edilebilir tuzları ve% 0.66 hacim / hacim gliserol (nitrojen-ihtiva eden yetersizliklerin 5 ml 0.1 M fosfat tampon içinde tekrar süspansiyon pelett orta).
5. Hücre bulanıklık (OD ₆₀₀₎ ölçün.
6. 25 ml kapalı bir kap cam şişeler ve herhangi bir hücre kontrol (E2 tuzları +% 0.66 hacim / hacim gliserol) içinde 6 ml hücre-alikotları karışım hazırlayın.
7. Her şişeye alkan 100 nmol ekleyin.
8. 24 saat (daha yüksek oranlar elde edildiği takdirde kısaltmak) için 37 ° C 'de karışımlarını.
9. Inkübasyondan sonra OD ₆₀₀ ölçün.
10. Etil asetat ile kültür ortamı içinde hidrokarbon ayıklamak ve gaz kromatografisi (protokol 3'e bakınız) ile, hücre kültürü içinde hidrokarbon konsantrasyonu belirlenir.
11. Her balona toplam biyokütle bugünkü (kuru ağırlık OD ₆₀₀ dönüştürmek) tarafından dönüştürülmüş alkan toplam miktarı bölerek biyokütle birim bozulması hesaplayın. Deney süresi sonucu bölerek birim zamanda birim biyokütle başına degradasyon aktivitesinin verir. Ortalama üç ayrı çalışır alınır.

3. Alkan Dönüşüm Enzim Testi, Inİn Vitro

Bu tahlil, Li ve diğ. (2008) tarafından tarif edilen metoda göre esasen yapıldı.

1. Kültür E. Lada gen (eksprese coli hücreleri BBa_K398017 ) ve boş vektör (taşıyan hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 50 mL LB ortam içinde).
2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.6 bir optik yoğunluğa ulaşıncaya kadar inkübe edilir.
3. 4000 rpm (4 ° C) de 10 dakika santrifüjlenir ve 50 mM Tris tamponu, 5 ml içinde pelet tekrar süspansiyon.
4. 4 bir çıkış kontrolü ile% 40 görev devresi sonikasyon (Hücre bölücü, LA Biyosistem) hücreler, süresi boyunca buz üzerinde çözüm tutmak.
5. 4 ve d az 4000 rpm'de 5 dakika için elde edilen karışım santrifüjlenirörneğin, C hücre enkaz kaldırmak için. Taze bir flakon süpernatant aktarın.
6. Bradford tahlili ile hücre özlerinin toplam protein konsantrasyonu belirlenir. Not: Arka plan artış ve / veya protein kaybını önlemek için cam şişe kullanın.
7. % 0.1 v / v alkan ve 50 mM Tris-HCl tampon içeren 100 ml'lik bir karışım hazırlayın.
8. 5 dakika boyunca 100 ° C'de karışım ısıtılır. Not: Sadece yüksek kaynama noktasına sahip orta-uzun zincirli alkanlar için bu adımı gerçekleştirin. (Örneğin C _16: 287 ° C).
9. Alkan optimal bir çözünürlük elde etmek için, 1 dak hala sıcak iken homojen, viskoz karışım elde edilinceye kadar için sonikasyon.
10. 1 mM NADH, 1 mM FMN, 1 mM _MgSO4 ve 0.01 h / h Triton X-100 ilave edin.
11. 25 ml kapalı kap şişeleri içinde 6 ml alikotları hazırlayın.
12. Hücre ekstresi yeterli miktarda (Bradford deneyleri, 5 mg protein / l son konsantrasyon bağlıdır) ekleyin. No-proteini kontrol hazırlayın.
13. Optimal e 60 ° C (inkübe24 saat süre ile) aktivitesi nzymatic.
14. Etil asetat ile kültür ortamı içinde hidrokarbon ayıklamak ve gaz kromatografisi (protokol 3'e bakınız) ile, hücre kültürü içinde hidrokarbon konsantrasyonu belirlenir.
15. Toplam protein tarafından dönüştürülmüş alkan toplam miktarı bölerek biyokütle birim bozulması hesaplayın Her balona (Bradford kalibrasyon eğrisi ile) eklendi. Ayrıca deneme süresi bölünerek birim zamanda hücresel protein birim degradasyon aktivitesinin verir. Ortalama üç ayrı çalışır alınır.

4. Etil Asetat Hidrokarbon Ekstraksiyon ve Konsantrasyon Ölçümleri

1. Alkanların 6 ml deney için 2.5 ml çözelti, etil asetat (apolar çözücü) ilave edilerek sulu bir çözelti elde edilir. Dahili bir standart% 0.1 'lik bir konsantrasyonda (v / v) de çözücü ilave edilir. Standart (örn. siklo-dekan) ilgi doruklarına beklenen aralığına bağlı olarak değişmektedir.
2. Opsiyonel: Add TritonSulu karışım, X-100 ve uygun bir iki faz sistemi elde etmek için 4000 rpm'de 10 dakika için numune santrifüjlenir.
3. Girdap iki faz ayrı kadar 5 saniye (1,500 rpm) ile, oda sıcaklığında inkübe edin karışımı.
4. Organik katman (üst) arasında bir maksimum miktarda kaldırma ve susuz magnezyum sülfat ile çözücü kurutun.
5. Filtrasyon (0.2 mikron) tarafından _MgSO4 çıkarın ve -20 ° C'de ölçümleri için gaz kromatografisi şişeleri içine süzülen veya mağaza aktarmak
6. CP-SIL 5CB kolon (uzunluk = 5 kg) kullanılarak gaz kromatografisi ile konsantrasyonunun belirlenmesi. (1:10, 230 ° C) bölünmüş modda numune 10 ml enjekte edilir. 1 ml / dk (helyum) ile kolon gaz akış ayarlayın. Aşağıdaki fırın sıcaklık programı kullanılmıştır:

   Oran	Sıcaklık [° C]	Zaman [dk]
   0	50	7.5
   50	90	1.0
   50	110	2.0
   50	130	2.0
   50	145	2.0
   50	160	2.0
   50	170	2.0
   50	185	2.0
   50	210	2.0
   50	250	2.0
   50	320	2.0

7. Zirveleri entegre ve iç standart ile ilgili olarak konsantrasyonları düzeltin.

5. Alkol / Aldehit Dehidrogenaz Aktivitesi Testi

Bu tahlil, Kato ve diğerleri tarafından tarif edilen metoda göre esasen yapıldı.(2010).

1. Kültür E. ADH (eksprese coli hücreleri BBa_K398018 ) ya da ALDH ( BBa_K398030 ) geni ve bir boş vektör (taşıyan hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 50 mL LB ortam içinde).
2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.6 bir optik yoğunluğa ulaşıncaya kadar inkübe edilir.
3. 4 ° C'de 4,000 rpm'de 10 dakika santrifüjlenir ve 50 mM Tris tamponu, 5 ml içinde pelet tekrar süspansiyon.
4. 4 bir çıkış kontrolü (sonication sırasında buz üzerinde çözüm tutmak) ile% 40 görev devresi hücre çözümü sonikasyon.
5. ° C hücre tortularını çıkarmak üzere 4 az 4000 rpm'de 5 dakika için elde edilen karışım santrifüjleyin.
6. Göre belirlenir(: Protein bağlama önlemek için bir cam şişe kullanın Not) Bradford yöntemi ile hücre ekstreleri tal protein konsantrasyonu.
7. 180 ul 57 mM glisin tampon her bir kuyu içinde NAD (nihai konsantrasyon 1 mM, pH 9.5) ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka yerleştirin.
8. Kuyular için test edilecek olan alkol (aldehit) 5 ul ekle. Not: bir sıvı olması testin başlamasından önce ısı uzun zincirli alkoller. Her bir alkol (aldehit) alt tabaka olmadan bir kontrol (negatif kontrol) ilave edilmelidir. Buna ek olarak, hücre özütü olmaksızın substrat tampon ve bir karışımını içeren bir boş hazırlanır.
9. Ön ısıtma 37 'de 15 dakika için plaka okuyucu (Tecan Macellan v7.0) ve plaka ° C sisteminin denge sağlamak için.
10. Hücre ekstresi yeterli miktarda (Bradford deneyleri, 5 mg protein / l son konsantrasyon bağlıdır) ekleyin. No-proteini kontrol hazırlayın.
11. 340 nm dalga boyunda 37 1 saat için her 2-3 dakikada ° C
12. OD (340 nm) eğiminden NADH üretim hızını hesaplayın. Dikkate ışık yolu uzunluğu ve 6220 M ^-1 cm ^-1 NADH sönüm katsayısı atın. Protein toplam miktarına göre NADH üretim hızı bölme hücre özütü olarak dehidrogenaz reaksiyonu (U / mg tam hücre protein) aktivitesinin eklendi. Ortalama ve üç bağımsız çalışır gelen standart sapmayı hesaplayın.

6. pCaiF Karakterizasyonu

1. Kültür E. pCaiF-GFP construct (ifade coli hücreleri BBa_K398331 ) ve yalnız organizatörü (taşıyan hücreler BBa_K398326 uygun antibiyotik gecede 5 ml LB orta gecede).
2. 5 ml M9 gece boyunca kültürün 50 ul ile 10 g / l glukoz ve antibiyotik içeren inoküle ve gece boyunca büyümeye.
3. Gecede akıbet alt kültürünün 50 ul taze M9 with10 g / l ve inkübe 5 ml içine hücre bulanıklık 600 nm'de 0.2 optik yoğunluk ulaşana kadar.
4. Her bir kuyudaki test için karbon kaynağı, istenen miktarda içeren taze M9 ortam 100 ul ile bir 96 kuyulu plakanın yerleştirin. İstatistiksel değerlendirme için üç nüsha deneyler gerçekleştirin ve ilgili negatif kontroller (yabani tip E. coli K12) ekleyin.
5. Sıvısı içeren kuyucuklara gece boyunca kültür 5 ul ekle.
6. Büyüme eğrisi (OD ₆₀₀₎ ve bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresan (485 nm eksitasyon ve emisyon 520) 37 18 saat süreyle her 10 dakikada ° C sabit sallama ile ölçün.
7. Büyüme hızı ve ilgili ölçümlerden özel GFP miktarı hesaplanır ve kontrol karşılaştırın. Ortalama, en az üç bağımsız deneyin standart sapma hesaplanır.

7. Tolerans Testi

1. KültürE. coli PhPFDα ve β gen (eksprese BBa_K398406 5 ml LB ortamı ve uygun antibiyotikler de ertesi sabaha kadar). E. Lada geni (eksprese coli BBa_K398017 ) negatif kontrol olarak kullanılmıştır.
2. Taze 5 LB ml (antibiyotik) ve inkübe içine gecede akıbet alt kültürünün 10 ul hücre bulanıklık 600 nm az 0,4 ile 0,3 arasındaki bir optik yoğunluk ulaşana kadar.
3. Bir 0,1 OD ₆₀₀ ulaşılıncaya kadar taze besiyeri ile kültürleri seyreltin.
4. Uygun antibiyotik ve üç kopya halinde toksik bileşik (örneğin, 0, 4, 8, n-heksan ve% 10) uygun bir şekilde nihai konsantrasyon ihtiva eden 180 ul M9 ortam ile bir 96 oyuklu plaka yerleştirin. Alkan-su karışımları iki fazlı sistemlerde yol açabilecek Çünkü (örneğin d plaka üzerinde uygun kontrollerin olması esastırifferent suşları ile ilgili boş deneyler).
5. Kuyulara kültürün 20 ul (kontrol) ilave edilir.
6. Sabit sallama bir plaka okuyucu 37 24 saat boyunca her 10 dakikada ° C kullanarak biyokütle konsantrasyonu (OD ₆₀₀₎ ölçün.
7. Farklı bir ajan konsantrasyonları için ilgili ölçümlerden büyüme oranları hesaplayın ve negatif kontrol ile karşılaştırıldığında. Ortalama ve en az üç bağımsız ishal standart sapmayı hesaplayın.

8. Homolog Etkileşim Haritalama

1. Uygulama HIM STRING veritabanı (akademik kullanım için ücretsiz) ²⁰ çalıştıran bir PostgreSQL sunucu üzerinde protein sorguları gerçekleştirmek için geliştirilmiştir. Homolog etkileşimi haritalama uygulaması STRING veritabanı kullanarak orijinal konak organizma etkileşen proteinleri tanımlar. Söz konusu etkileşim gen dizileri hedef organizma içinde homolog genlerin bulmak için bir patlama arama kullanılır. Cytoscape ⁴ haritalama sonucu görselleştirmek için kullanılır. : HIM yazılım aracı indirilebilir https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
2. Bir eşleme gerçekleştirmek için, (1) BioBrick kimliği girin ve uygulama otomatik olarak Standart Biyolojik parçaları ^9, veya uygulama (2) enter (macun) dizisi verilerin kayıt defterinden parçası dizisi veri indirecektir.
3. Girilen amino asit dizisi için STRING proteinin kimliğini bulmak için STRING Veritabanı web sitesini kullanın.
4. Yüksek bir homolojiye sahip bir protein BLAST kullanılarak tespit edilir. Daha sonra uygulama konak organizma içinde homologları (örn. E. coli) için kaynak organizma ve arama içinde bilinen her etkileşimli protein listeler.
5. Metin veya Cytoscape için oluşabilecek olası etkileşimi listesini verin.

Sonuçlar

Alkane conversion

The activity of the three oxidation steps from the alkane to the respective fatty acid was evaluated using resting cell assays and enzyme activity measurements. The results are presented following the pathway reactions (1) alkane hydroxylase, (2) alcohol dehydrogenase and (3) aldehyde dehydrogenase.
For the first step, different plasmids were constructed for medium and long-chain alkanes. The plasmid BBa_...

Tartışmalar

BioBrick prensibi alkan bozulması için bir şase oluşturmak için kullanılan ve araç setinin tek bileşenleri için ilkesinin bir kanıtı elde edildi. Bazı deneyler, in vivo ve alkan alçaltıcı enzimler yolu in vitro aktivite ölçmek için önerilmiştir. Sunulan çalışmalar başarılı bir konak organizma içinde E. enzim aktiviteleri ile ifade belirlemek için kullanılabilecek bir dizi yöntem göstermektedir Uygun BioBricks uygulanmasından sonra coli. Üstelik, BioBri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli K12	New England Biolabs	C2523H
Octane	Fluka	74822
Hexadecane	Fluka	52209
octanol-1	Fluka	95446
dodecanol-1	Sigma-Aldrich	126799
Hexane	Sigma-Aldrich	296090
NADH	Sigma-Aldrich	N4505
FMN	Sigma-Aldrich	F2253
MgSO4	J.T. Baker Casno	7487 889
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
T4 ligase	New England Biolabs	M0202L
Gas chromatograph
Cell disrupter	LA Biosystems	CD-019
Spectrophotometer	Amersham pharmacia	spec 2000
Plate reader	Tecan Group Ltd.	Magellan v7.0
Incubator	Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubB	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398014	Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398027	ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398018	ADH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398030	ALDH generator Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398326	pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398331	pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107-	Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts	BBa_K398406	Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol