تحت الشبكية حقن المتجهات العلاج الجيني والخلايا الجذعية في العين ماوس

Summary

هذه التقنية الجراحية يوضح حقن ناقلات العلاج الجيني والخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية للعين الماوس.

Abstract

فقدان البصر يؤثر على ما يقرب من 3.4 مليون شخص في الولايات المتحدة، ومن المتوقع أن تزداد في السنوات القادمة .. ¹ في الآونة الأخيرة، والعلاج الجيني زرع الخلايا الجذعية أصبحت أدوات العلاجية لعلاج العمى الرئيسية الناجمة عن الأمراض التنكسية الشبكية. وقد ولدت عدة أشكال من الزرع الذاتي للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، مثل زرع القزحية الصباغ الخلايا الظهارية، نتائج مشجعة، وتجارب اكلينيكية على البشر بدأت لأشكال أخرى من العلاج بالخلايا الجذعية والجينات .. ² وتشمل هذه RPE65 استبدال الجينات العلاج في المرضى المصابين بعمى جزئي خلقي وزرع الخلايا RPE باستخدام الجذعية الجنينية البشرية (ES) الخلايا في أمراض ستارغاردت ^3-4 الآن أن هناك ناقلات العلاج الجيني والخلايا الجذعية المتاحة لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض شبكية العين، فمن المهم للتحقق من هذه العلاجات المحتملة في تطبيق النماذج الحيوانية قبلجي لهم في الدراسات البشرية. الماوس أصبح نموذجا هاما العلمية لاختبار الكفاءة العلاجية للناقلات العلاج الجيني وزرع الخلايا الجذعية في العين ^5-8 في هذه المقالة الفيديو، نقدم تقنية لحقن ناقلات العلاج الجيني أو الخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية من العين الماوس مع تقليل الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها.

Protocol

1. تجميع الأجهزة لحقن تحت الشبكية

1. شراء أو تقديم قطرها ميكرون 100 إبرة من أنبوب زجاجي الشعرية. ويمكن أن يتم ذلك يدويا باستخدام سوتر P-97 مجتذب الماصة أو معدات أخرى مماثلة. سيكون ساخنا نهاية الأنبوب الشعري وسحبت حتى تصل إلى القطر المطلوب (100 ميكرون). ويمكن استخدام إبرة أصغر قطر لناقلات العلاج الجيني، ولكن هذا هو قطر الموصى به لحقن الخلايا دون الأضرار التي لحقت الخلايا أو العين. مقارنة الإبر الصلب، الزجاج الإبرة الشعرية لديه معلومات دقيقة جدا، ولكن بصراحة، للسماح لرؤية حقن السائل والوصول إلى الفضاء تحت الشبكية دون أن تسبب الكسر في شبكية العين. تنظيف هذه الإبر سحبت إذا لزم الأمر باستخدام الايثانول 70٪، وتخزينها في وعاء معقم. A 15 سم زراعة الأنسجة المعقمة الطبق مع الشريط لعقد الإبر في مكان واحد الطريقة التي للحفاظ على حقن الإبر وغطت في بيئة معقمة. عند هذه النقطة، كومبلمؤسسة التدريب الأوروبية في انشاء داخل غرفة العمليات الجراحية حيث الإجراء سوف تحدث. فمن الأسهل للحفاظ على جميع المعدات في غرفة العمليات الجراحية في جميع الأوقات من أجل أن تبقى عقيمة، لا سيما إذا كان ذلك الإجراء داخل مرفق الجدار.
2. نضح السيليكون في إبرة حقن السيليكون وإخراج لترك الطلاء على طول الجدران الداخلية للإبرة. طلاء السيليكون يزيد من مرور الخلايا والفيروسات من خلال إبرة تحمل، والتي ستلتزم على نحو آخر مع الجدران الزجاجية الداخلية الشعرية.
3. الحصول على ما يقرب من 8 سم طول أنابيب بلاستيكية معقمة من خلال خفض بنسبة 25 جمع الدم ¾ عيار مع مجموعة قفل الأنبوب عند نقطة مباشرة بعد الإبرة (إزالة الإبرة من أنابيب).
4. 1 مل ملء الفرعية س 26 5/8-gauge زلة تلميح المحاقن مع ملحي معقم وإزالة الإبرة من الحقنة.
5. إبرة حقن إرفاق إلى نهاية قطع من انابيب البلاستيك ونعلق المحقنة إلى الأنبوب قفل في الطرف الآخرنهاية.
6. نضح ملحي معقم لملء الفراغ القتلى في الإبرة والأنابيب الشعرية، إخراج بعض المالحة من خلال إبرة لضمان أن يتم إرفاق بشكل صحيح من دون أي تسرب. المقبل، نضح صغير، حوالي 1 ميكرولتر من كمية الهواء، في رأس الإبرة الحقن. وهذا فصل من السوائل المالحة وتوفير الحقن مؤشرا مرئيا تشير إلى نهاية السائل الحقن أثناء إجراء العمليات الجراحية. يجب أن تبقى جهاز الحقن على سطح نظيف محو أسفل مع الايثانول 70٪ خلال إجراء العمليات الجراحية. بالإضافة إلى ذلك، يجب تنظيف جميع المعدات المستخدمة أثناء إجراء العمليات الجراحية قبل وبعد مع الايثانول 70٪، للاستثناء من الإبر الحقن التي يجب أن تبقى عقيمة بالفعل وجاهزة للاستخدام. يجب التخلص من هذه الإبر من بعد الجراحة، وليس إعادة استخدامها
7. وأخيرا، نضح حل الحقن التي تحتوي على المطلوب العلاج الجيني الفيروسي ناقلات المعلبة أو الخلايا الجذعية. ويمكن أن يتم ذلك عن طريقتناول الحقن في حل تلميح الماصة المعقمة، ثم pipetting الحل على سطح الخلية طبق الثقافة العقيمة. ويمكن الآن أن يستنشق الحل بسهولة في إبرة الحقن باستخدام محقنة. فإن المبلغ اللازم تختلف تبعا للعمر من الفأرة. لأغراضنا نحن نستخدم ما بعد الولادة 5 أيام الفئران، والتي يمكن حقنها مع 0،5-0،8 ميكرولتر من السائل الحقن. يمكن استخدام كميات صغيرة، 0.5 ميكرولتر أو أقل، ويمكن استخدامها لصغار الفئران ومبالغ أكبر، مثل 1 ميكرولتر، لفئران بالغة. وعيار الفيروسية أو عدد الخلايا بحاجة إلى أن تحدد على أساس خلية / فيروس يتم حقنه وأنسجتهم الهدف المنشود، كما يمكن أن الجسيمات الفيروسية أو الخلايا كثيرة جدا في حجم صغير يؤدي إلى سمية للخلايا الشبكية. في الفيديو، لأغراض التصور، وقد استخدمنا 1،5 ميكرولتر، أكبر كمية من الصبغة مما هو ضروري لحقن في العين.

2. الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية

1. داخل غرفة العمليات الجراحية المعقمة،استقرار أو تخدير الماوس وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوان وافق محليا، والتي سوف تختلف حسب العمر من الفأرة. التخدير مشتركة لفئران بالغة تتضمن استخدام الغاز أو الحقن isoflurane داخل الصفاق من 0.1 ml/10g وزن الجسم من الكيتامين (100 ملغ / مل) وزيلازين (20 ملغ / مل) في ملحي معقم. لفترة ما حول الولادة الفئران، وتقنيات التخدير شيوعا تشمل استخدام الغاز isoflurane أو تخدير بالبرد (انخفاض حرارة الجسم). يجب الموافقة على جميع تقنيات التخدير من قبل لجنتكم IACUC المحلية قبل الاستخدام. نستخدم عادة بعد الولادة اليوم (P) 5 الفئران، على الرغم من إمكانية تطبيق تقنيات مماثلة لالفئران في سن P0 أو لفئران بالغة. يمكن إجراء العمليات الجراحية لم يبدأ حتى الماوس توقف تحريك أطرافه ولم يعد يستجيب إلى أخمص القدمين القرصات. لفترة ما حول الولادة الفئران، فإنها تصبح أخف وزنا بشكل ملحوظ في اللون منذ تدفق الدم سوف تبطئ، مفتاح آخر لمعرفة أنهم تحت التخدير الكامل.
2. في فترة ما حول الولادة الفئران، استخدم مقص Vannas مباشرة إلى مأك تقريبي شق 1.5 مم على طول الشق غطاء مغلقة. كن حذرا لخفض المسافة البادئة في، حيث سيتم فتح العين بشكل طبيعي في المستقبل. هذا يضمن أن الأغطية سوف تلتئم بشكل صحيح وفتح أثناء وضع الماوس. ويمكن استخدام شفرة جراحية لهذا الغرض، على الرغم من أننا نفضل مقص Vannas لأنها تقلل من خطر ثقب العين خلال هذا الإجراء. في الفيديو، استخدمت مقص لقطع ثقب مباشرة وعلى طول هامش الجفن. عندما تعلم هذه التقنية، يجب استخدام ملقط لرفع الجفن قبل القطع والحد من مخاطر الإضرار بالعين.
3. مزق الجفون مع ملقط خلع الملابس منحنية لproptose العين والجفون قرصة قليلا تحت العين لأنه عقد proptosed للحقن. إذا شق غطاء المحرز في الخطوة الثانية هي كبيرة جدا، وسوف تنزلق العين تحت الجفن ومنع التعرض الكافي أثناء إجراء الحقن. لفئران بالغة، وتطبيق ضغط خفيف حول العين مع الدكتوريمكن essing ملقط الاستمرار على العين proptosed للحقن.
4. جعل شق صغير في الصلبة أو الخلفي لخط الاستواء في العالم من خلال خدش سطح بشفرة المجهرية 15-درجة. وهذا ينبغي أن تكون كبيرة شق ما يكفي فقط لتمرير غيض من إبرة الحقن، ولكن لم أكبر من ذلك. إذا فضلت، يمكن استخدام صغيرة، إبرة حادة مثل الإبر الوخز بالإبر لجعل هذا شق في الفضاء تحت الشبكية بدلا من شفرة المجهرية. في الحيوانات المصطبغة نحو مظلم، مظلم والبني المصطبغة الأنسجة (الشبكية والمشيمية ظهارة الصباغ) تصبح مرئية عند نقطة شق. في أخف الفئران مصطبغة أو البيضاء، يمكن تطبيق قلم الجراحية بمناسبة لغيض من شفرة المجهرية لترك بقعة الحبر تشير إلى موقع شق. إذا اضحة refluxes السائل (زجاجي) من موقع شق، وضعت شفرة عميق جدا ودخل تجويف الجسم الزجاجي وفيروس العلاجية أو الخلايا قد تدخل الفضاء intravitreal خلال الحقن. لvisualizatiعلى الأغراض، وجعلنا من شق إلى هذه النقطة في الفيديو. لا يزال من الممكن لإكمال الحقن تحت الشبكية في هذه الحالة، ومع ذلك يجوز للانفصال الشبكية الناجم عن وجود حقن السائل لا شفاء تماما في هذا الماوس. ولذلك، يجب الحرص على قطع فقط السطح الخارجي للعين وليس من خلال شبكية العين قبل الحقن.
5. إدراج بعناية الإبرة الحقن في موقع شق ودفعها موازية لجدار العين الخارجي لدخول الفضاء تحت الشبكية. وسوف تقدم قريبة جدا من الجدار الخارجي أو عميق جدا داخل العين توجيه الحقن في موقع خاطئ. أفضل طريقة لفهم ما إذا كانت الإبرة في الموقع الصحيح لممارسة هذه التقنية. يمكن ممارسة على الفئران البيضاء أو فاتح اللون تساعد على جعل حقن دقيقة ودقيقة في الفضاء تحت الشبكية. وذلك لأن السائل إبرة الحقن ومرئيا داخل هذه العيون.
6. تطبيق الضغط الخفيف على المكبس حقنة ويكونحقن الجن من السائل المطلوب. إذا ما وضعت بشكل صحيح الإبرة داخل الفضاء تحت الشبكية، سيتم شعرت احداهما معتدلة. إذا كانت الإبرة داخل الجسم الزجاجي، وسيكون هناك أقل بكثير احداهما وربما بعض الجزر السوائل أثناء الحقن. إذا كان هناك احداهما كبيرة، أمسك إبرة في المكان لمدة لا تقل عن 15 ثانية إضافية قبل إزالة الإبرة ببطء. وهذا سوف يسمح ارتفاع الضغط داخل العين لادراك التعادل بدلا من refluxing الفيروس حقن الخلايا أو العودة إلى موقع شق. ويمكن حقن بعض الهواء والمياه المالحة في الفضاء تحت الشبكية بسبب زيادة الضغط المطلوب أثناء إجراء الحقن. وينبغي الحرص على عدم الإفراط في ضخ الهواء أو المالحة، لأنها يمكن أن طرد الفيروس حقن الخلايا أو من العين. ومن الممكن أيضا أن يسبب انفصال الشبكية دائمة من وجود الكثير من السوائل تحقن في الفضاء تحت الشبكية. لأغراض التصور، تم حقن الصبغة الزائدة وكثافة العمليات الجويةيا الفضاء تحت الشبكية في الفيديو. يمكن ان ينظر اليها بشكل واضح كيف سيتم مسح بعض الصبغة مرة أخرى للخروج من الفضاء تحت الشبكية إذا تم حقن الكثير، ولكن أيضا كيف أن تبقى فقاعة الهواء داخل الفضاء تحت الشبكية و لا تختفي في الجسم الزجاجي. وقد استخدم هذا التأكيد على أن هذه الحقن كانوا جميعا داخل الموقع الصحيح للعين، لذلك يمكن للمرء أن يتخيل كيف أن تدخل الإبرة في موقع شق. جميع الحقن في الفضاء تحت الشبكية يؤدي إلى انفصال الشبكية مؤقتة بسبب وجود السائل الحقن. إذا تم الانتهاء من إجراء الحقن بشكل صحيح، وهذا انفصال الشبكية مؤقتة شفاء في غضون 24 ساعة والفئران يمكن استخدامها لجميع التجارب الأخرى. العين قد تبقى لينة لمدة أسبوع تقريبا بسبب العملية الجراحية، ولذلك يجب تجنب حقن الثانية خلال هذه الفترة من الزمن.
7. بالنسبة للفئران حديثي الولادة، ملقط خلع الملابس استخدام المنحني برفق لدفع العين مرة أخرى وراء الأغطية وإلى المدار. قد يكون من المفيدالانتظار لمدة دقيقة وذلك للسماح للفيروس لتسوية في غضون تحت الشبكية وليس التسبب في مسح بها للموقع عند الضغط بلطف شق العين مرة أخرى إلى مداره. بعد الجراحة، قطرة واحدة من بوبيفاكايين 0.5٪ (marcaine) المخفف إلى 0.25٪ في ملحي معقم من إبرة قياس 25-يمكن وضعها في موقع الحقن. الفئران لا تظهر علامات الشدة العلني بعد الجراحة تحت الشبكية واستخدام بوبيفاكايين كمسكن طويل المفعول الموضعية كانت وافرة للسنوات الثلاث السابقة. وينبغي دائما أن تراقب الفئران بعد العملية الجراحية للبحث عن أي علامات الضائقة؛ مثل العدوى، وتورم، أو انخفاض في الأنشطة اليومية المعتادة من الفأرة. إذا حدث وحصل، ينبغي إخطار الطبيب البيطري ويمكن إعطاء عقاقير مضادة للألم مثل البوبرينورفين مزيد (0.05 مغ / كغ) كما حقنة داخل الصفاق.
8. تنبيه الفار من التخدير المعتمدة محليا وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوان. يجب أن تبقى الماوس على ع التدفئةإعلان للحفاظ على درجة حرارة الجسم طبيعية لأنه يستيقظ من التخدير. يجب إجراء العمليات الجراحية تستغرق أقل من خمس دقائق لإكمال، من دون وقت للخضوع الماوس التخدير. لذلك، وسادة التدفئة ليس من الضروري أثناء إجراء الفعلية، ولكن قد تكون هناك حاجة في حين واحد هو تعلم تقنية والإجراء قد يستغرق مدة أطول من الزمن. لا ينبغي أن توضع الماوس مرة أخرى إلى قفص نظيفة حتى بدأت التحرك من تلقاء نفسها. لحديثي الولادة، والقرصات إصبع لطيف لمساعدة تستعد عافيتها بشكل كامل من التخدير، ويجب أن تستعيد لونها الوردي وحركة قبل وضعها مرة أخرى مع الأم. وينبغي رصد الفئران بمرور الوقت عن أي علامات الضائقة كما هو موضح سابقا.

النتائج

ويرد الرسم من العين الفأر مع الهياكل الرئيسية مرقوم للإشارة، مع السهام عرض المواقع لإجراءات حقن كل intravitreal وتحت الشبكية الجراحية (النصال، الشكل 1). ويمكن حقن العلاج الجيني النواقل، مثل ناقلات lentiviral lacZ (الشكل 2)، وذلك باستخدام هذه المواقع. بالإضا?...

Discussion

هذه التقنية الفيديو يقدم تعليمات على استكمال إجراءات الحقن تحت الشبكية الجراحية بنجاح، وضمان أن يتم وضع ناقلات العلاج الجيني أو الخلايا الجذعية في الموقع اللازمة لعلاج هذا المرض بكفاءة العيون. هذا الأسلوب يسمح للاستهداف خلايا الشبكية مثل RPE أو خلايا مستقبلة للضوء، ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	شركة	فهرس	تعليقات
0،8-1،10 X 100 ملم أنابيب شعرية (زجاج)	كيمبل الزجاج، وشركة	34502 99
المشتعلة / براون Micropipette بولير	سوتر الصك	P-97	ويمكن استخدام Narishige microforge بدلا من ذلك. كتالوج # MF-900
Sigmacote	سيغما الدريتش	SL2-25ML	سيليكون
التخزين المؤقت للفوسفات Dubecco المالحة مع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم	Gibco-إينفيتروجن	14040-133
بالسلامة لوك 25 × 12 3/4G "، وجمع الدم مجموعة	BD Vacutainer	367298
1 مل الفرعي Q 265/8G الانزلاق تلميح الحقنة	بيكتون ديكنسون	309597
0،5-10 ميكرولتر Finnpipette II قابل للتعديل الحجم Pipetter	Fisherbrand	21-377-815
1-200 ميكرولتر نصائح مشطوف الطبيعية	USA العلمية، وشركة	1111-1700
Discovery.V8 ستيريو المجهر	زايس	MC1500
60 مم X 15 مم شكل المعالجة زراعة الخلايا طبق البوليستيرين	كورنينج للإعلام	430166
مقص مستقيم Vannas	STORZ Ophthalmics	E3383 S
منحني الملقط خلع الملابس مع التسنين حساس	STORZ Ophthalmics	E1408
15 درجة سكين المجهرية	Wilsعلى شركة العيون	091204
الكيتامين	Ketaset III	NADA # 45-290
زيلازين	لويد المختبرات	NADA # 139-236
بوبيفاكايين (Marcaine)	استرا زينيكا	N / A
البوبرينورفين	سيغما الدريتش	B9275