Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

Zusammenfassung

Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.

Zusammenfassung

Der Verlust der Sehkraft betrifft etwa 3,4 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und wird voraussichtlich in den kommenden Jahren zu erhöhen. ¹ Kürzlich, Gentherapie und Stammzelltransplantationen sind zu den wichtigsten therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Blindheit infolge degenerativer Netzhauterkrankungen. Verschiedene Formen der autologen Transplantation für altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), wie Iris Pigmentepithel-Transplantation haben ermutigende Ergebnisse erzeugt und klinischen Studien am Menschen sind für andere Formen der Gen-und Stammzelltherapie begonnen. ² Dazu gehören RPE65 Genersatz Therapie bei Patienten mit angeborenen Amaurose Leber und einem RPE Zelltransplantation Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) in Stargardt-Krankheit. ^3-4 Da es mittlerweile Gentherapievektoren und Stammzellen für die Behandlung bei Patienten mit retinalen Erkrankungen ist es wichtig zu überprüfen, diese mögliche Therapien im Tiermodell vor geltenING sie in Studien am Menschen. Die Maus ist ein wichtiges wissenschaftliches Modell zur Prüfung der therapeutischen Wirksamkeit von Vektoren für die Gentherapie und Stammzelltransplantation in die Augen. ^5-8 In diesem Video Artikel präsentieren wir eine Technik, um Vektoren für die Gentherapie oder Stammzellen in den subretinalen Raum zu injizieren die Maus Auges minimiert Beschädigung des umgebenden Gewebes.

Protokoll

Ein. Montieren Sie Geräte für den subretinalen Injektion

1. Kauf oder eine 100 Mikrometer Durchmesser Nadel aus einer Glaskapillare. Dies kann manuell mit Hilfe eines P-97 Sutter Pipette Abzieher oder ähnliche Ausrüstung durchgeführt werden. Das Ende des Kapillarrohrs wird erhitzt und gezogen werden kann, bis er den gewünschten Durchmesser (100 um) erreicht. Ein kleinerer Durchmesser Nadel kann für die Gentherapie-Vektoren verwendet werden, jedoch ist dies die empfohlene Durchmesser für Zellinjektion ohne Schädigung der Zellen oder des Auges. Verglichen mit Stahlnadeln weist das Glas Kapillarnadel einen sehr feinen, jedoch stumpfe Spitze, zur Visualisierung der Injektionsflüssigkeit und Zugang zum Subretinalraum ohne retinalen Brechen ermöglichen. Reinigen Sie diese gezogen Nadeln bei Bedarf unter Verwendung von 70% igem Ethanol, und speichern Sie in einem sterilen Behälter. A 15 cm sterile Gewebekulturschale mit Klebeband, um die Nadeln in Position zu halten ist eine Art und Weise, halten die Injektionsnadeln abgedeckt und in einer sterilen Umgebung um. An diesem Punkt, komplete den Aufbau innerhalb des chirurgischen Raum, in dem das Verfahren stattfindet. Am einfachsten ist es, alle Geräte im Operationssaal zu allen Zeiten, damit es zu bleiben steril zu halten, vor allem, wenn dieses Verfahren innerhalb einer Barriere Anlage durchgeführt wird.
2. Anzusaugen Silikon in die Injektionsnadel und Auswerfen der Silikon um eine Beschichtung entlang der Innenwände der Nadel zu verlassen. Die Silikonbeschichtung maximiert den Durchtritt von Zellen und Viren durch die Nadelbohrung, die ansonsten zu den inneren Wänden würde Glaskapillare kleben.
3. Erhalten etwa 8 cm Länge von sterilen Kunststoffschlauch durch Schneiden eines 25 ¾-Gauge Blutentnahme mit Luer-Lock an dem Punkt eingestellt direkt nach der Nadel (Entfernen der Nadel aus der Schläuche).
4. Füllen Sie eine 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge Slip-Spitze Spritze mit steriler Kochsalzlösung und entfernen Sie die Nadel aus der Spritze.
5. Befestigen der Injektionsnadel an dem abgeschnittenen Ende des Kunststoffschlauchs und befestigen die Spritze mit dem Luer-Lock an dem anderenEnde.
6. Anzusaugen steriler Kochsalzlösung, um die toten Raum in der Rohrleitung und Kapillarnadel Ausschleudern einige Kochsalzlösung durch die Nadel, um sicherzustellen, dass sie korrekt ohne Leckage befestigt füllen. Weiter aspirieren eine kleine, ungefähr 1 ul Luftmenge in die Spitze der Injektionsnadel. Dadurch wird die Salzlösung aus der Injektionsflüssigkeit zu trennen und einen visuellen Hinweis, der das Ende der Injektionsflüssigkeit während der chirurgischen Prozedur. Das Injektionsgerät sollte auf einer sauberen Oberfläche hinunter mit 70% Ethanol während der chirurgischen Prozedur abgewischt gehalten werden. Außerdem sollten alle Einrichtung während der chirurgischen Prozedur verwendet sowohl vor und nach mit 70% Ethanol gereinigt werden, für die Ausnahme der Injektionsnadeln, die bereits steril gehalten und einsatzbereit sein sollen. Diese Nadeln sollten nach der Operation beseitigt werden, und nicht wieder verwendet werden.
7. Schließlich anzusaugen Injektionslösung, enthaltend die gewünschte verpackte Gentherapie viralen Vektor oder Stammzellen. Dies kann geschehen durchAufnehmen der Injektionslösung in einem sterilen Pipettenspitze, dann Pipettieren der Lösung auf die Oberfläche eines sterilen Zellkulturschale. Die Lösung kann nun problemlos in die Injektionsnadel mit der Spritze abgesaugt werden kann. Die benötigte Menge wird abhängig vom Alter des Maus variieren. Für unsere Zwecke verwenden postnatalen Tag 5 Mäusen, die mit 0,5 bis 0,8 ul Injektionsflüssigkeit injiziert werden kann. Kleinere Mengen, 0,5 ul oder weniger, für jüngere Mäusen und größere Mengen, wie 1 ul verwendet werden kann, kann für erwachsene Mäuse verwendet werden. Der virale Titer oder Anzahl der Zellen benötigt, um basierend auf den Virus / Zellen injiziert und ihre gewünschten Zielgewebe bestimmt werden können, da zu viele virale Partikel oder Zellen in einem kleinen Volumen der Toxizität für die Zellen der Netzhaut führen. In dem Video zur Visualisierung, haben wir 1,5 ul, eine größere Menge an Farbstoff als notwendig, um in das Auge injiziert verwendet.

2. Zugriff auf den subretinalen Raum

1. Innerhalb des sterilen OP-Raum,stabilisieren oder zu betäuben die Maus nach dem örtlich genehmigten Umgang mit Tieren Protokoll, das durch das Alter der Maus variieren. Gemeinsame Anästhesie für erwachsene Mäuse umfasst die Verwendung von Gas oder einem Isofluran intraperitoneale Injektion von 0,1 ml/10g Körpergewicht Ketamin (100 mg / ml) und Xylazin (20 mg / ml) in steriler Kochsalzlösung. Für perinatalen Mäusen, gehören gemeinsame Anästhesietechniken die Verwendung von Isofluran Gas oder cryoanesthesia (Hypothermie). Alle Anästhesietechniken muss von Ihrem lokalen IACUC Ausschuss vor genehmigt werden. Wir verwenden typischerweise postnatalen Tag (P) 5 Mäusen, obwohl ähnliche Techniken an Mäuse im Alter von P0 oder an erwachsenen Mäusen angewendet werden können. Der chirurgische Eingriff kann erst beginnen, wenn die Maus nicht mehr bewegen die Gliedmaßen und reagiert nicht mehr auf Prisen Fuß. Für perinatalen Mäusen, werden sie merklich heller in der Farbe, da der Blutfluss verlangsamen, eine andere Taste, um zu wissen, dass sie vollständig unter Narkose sind.
2. In perinatalen Mäusen, verwenden Vannas geraden Schere make eine ungefähre 1,5 mm Inzision entlang der geschlossenen Lidspalte. Seien Sie vorsichtig bei der Vertiefung, wo das Auge natürlich in die Zukunft öffnet geschnitten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Lider heilen und öffnen Sie richtig bei der Entwicklung der Maus. Chirurgische Klinge kann für diesen Zweck verwendet werden, obwohl wir Vannas Schere da sie das Risiko von Punktieren des Auges während dieser Vorgang weniger bevorzugen. In dem Video wurden die Schere direkt Punktion und Schnitt entlang der Lidrand verwendet. Beim Lernen dieser Technik sollte verwendet werden, um die Zangen Augenlids vor dem Schneiden heben und das Risiko der Beschädigung des Auges werden.
3. Auseinanderziehen die Augenlider mit gebogenen Kornzange das Auge proptose und kneifen die Augenlider leicht unterhalb des Auges zu halten proptosed zur Injektion. Wenn der Deckel Einschnitt in Schritt zwei gemacht zu groß ist, wird das Auge schlüpfen wieder unter den Deckeln und damit eine ausreichende Belichtung während der Injektion. Für erwachsene Mäuse, mit leichtem Druck um die Augen mit drEssing Pinzette halten kann das Auge für die Injektion proptosed.
4. Machen Sie eine kleine Sklera Einschnitt am oder hinter dem Globus Äquators durch Kratzer auf der Oberfläche mit einem 15-Grad-Mikrochirurgie Klinge. Dieser Einschnitt sollte nur groß genug, um die Spitze der Injektionsnadel passieren, aber nicht größer als die. Falls gewünscht, kann eine kleine, spitze Nadel wie einer Akupunkturnadel verwendet, um dieses Einschnitts in den subretinalen Raum anstelle der Mikrochirurgie Klinge herzustellen. In dunkel pigmentierten Tieren wird eine dunkelbraun-pigmentierten Gewebebereich (die Aderhaut-Netzhautpigmentepithels) sichtbar an der Stelle des Einschnitts. In leichteren pigmentierte oder Albinomäusen, kann eine chirurgische Markierungsstiftes zur Spitze der Klinge Mikrochirurgie, um eine Tinte, die den Ort Inzisionsstelle gehandhabt werden können. Wenn klar (Glaskörper) Flüssigkeit Rückflüsse aus dem Inzisionsstelle wurde die Klinge gelegt zu tief und trat in den Glaskörperraum und die therapeutische Viren oder Zellen die intravitreale Raum während der Injektion geben. Für visualizatiauf Zwecke haben wir den Einschnitt zu diesem Punkt in dem Video. Es ist immer noch möglich, eine subretinale Injektion in diesem Fall zu vervollständigen, aber die Netzhautablösung durch die Anwesenheit der Injektionsflüssigkeit verursacht möglicherweise nicht vollständig in dieser Maus zu heilen. Daher muss darauf geachtet werden, nur die äußere Oberfläche des Auges und nicht durch die Retina vor der Injektion geschnitten werden.
5. Schieben Sie die Injektionsnadel in die Inzisionsstelle und fördern sie parallel zum äußeren Auges Wand, um den subretinalen Raum geben. Vorrücken zu nahe an der Außenwand oder zu tief innerhalb des Auges wird die Einspritzung in der falschen Stelle zu lenken. Das beste Verfahren zu verstehen, ob die Nadel in der richtigen Position ist, um die Technik zu praktizieren. Üben auf leicht pigmentiert oder Albinomäusen kann helfen, präzise und genaue Injektionen in den subretinalen Raum zu machen. Dies liegt daran, dass die Nadel und der Einspritzfluid sichtbar ist innerhalb dieser Augen.
6. Wenden Sie leichten Druck auf den Spritzenkolben und seinGin Injektion des gewünschten Fluids. Wenn die Nadel korrekt in den subretinalen Raum gestellt wird, moderate Gegendruck zu spüren sein. Wenn die Nadel in den Glaskörper, wird es deutlich weniger Gegendruck und möglicherweise etwas Fluid Rückfluß während der Injektion sein. Wenn eine erhebliche Gegendruck, halten die Nadel an Ort und Stelle für mindestens weitere 15 Sekunden vor dem Entfernen der Nadel langsam. Dies ermöglicht es dem hohen Augeninnendruck zu entzerren anstelle des Rückfluss des eingespritzten Virus oder Zellen wieder aus der Einschnittstelle. Ein Teil der Luft und Kochsalzlösung kann in den subretinalen Raum aufgrund des erhöhten Drucks während der Injektion benötigt injiziert werden. Es sollte darauf geachtet, nicht über injizieren Luft oder Kochsalzlösung, da es bündig kann das injizierte Virus oder Zellen aus dem Auge werden. Es ist auch möglich, dauerhafte Netzhautablösung aus dem Vorhandensein von zu viel Flüssigkeit in den subretinalen Raum injiziert verursachen. Zur Visualisierung wurde überschüssiger Farbstoff und Luft injiziert into die subretinalen Raum in dem Video. Es ist deutlich zu sehen, wie ein Teil des Farbstoffes Rücken wird gespült werden aus dem subretinalen Raum, wenn zu viel eingespritzt wird, sondern auch, wie die Luftblase im subretinalen Raum bleibt und nicht in den Glaskörper verschwinden. Dies wurde verwendet, um zu betonen, dass diese Injektionen alle innerhalb der richtigen Stelle des Auges waren, so kann man visualisieren, wie die Nadel den Einschnitt Website eingeben. Alle Injektionen in den subretinalen Raum zu einer vorübergehenden Netzhautablösung aufgrund des Vorhandenseins der Injektionsflüssigkeit. Wenn die Injektion Verfahren korrekt abgeschlossen ist, wird diese temporäre Netzhautablösung innerhalb von 24 Stunden und Mäuse heilen kann für alle weiteren Experimente verwendet werden. Das Auge kann bleiben für etwa eine Woche wegen des chirurgischen Eingriffs weich, so dass eine zweite Einspritzung während dieser Zeit sollte vermieden werden.
7. Für neugeborenen Mäusen, verwenden Sie die gebogenen Dressing Pinzette vorsichtig die Augen hinter den Lidern und in die Umlaufbahn. Es kann nützlichfür eine Minute, um zu ermöglichen, um das Virus innerhalb des subretinalen Raumes absetzen und nicht dazu führen, dass aus der Einschnittstelle gespült werden, wenn sanftes Drücken des Auges zurück in seine Umlaufbahn. Nach der Operation eines Tropfens 0,5% Bupivacain (Marcain) bis 0,25% in steriler Kochsalzlösung aus einer 25-Gauge-Nadel verdünnt können an der Injektionsstelle platziert werden. Mäuse zeigen keine offensichtlichen Anzeichen von Leiden nach subretinale Chirurgie und die Verwendung von Bupivacain als langwirksame aktuelles Analgetikum ist seit den letzten drei Jahren reichlich. Mäuse sollten immer nach dem chirurgischen Eingriff überwacht werden, um auf Anzeichen von Stress suchen; wie Infektionen, Schwellungen oder einer Abnahme der normalen täglichen Aktivitäten der Maus. Wenn diese auftreten, sollte der Tierarzt benachrichtigt und weitere Schmerzmittel wie Buprenorphin (0,05 mg / kg) kann als eine intraperitoneale Injektion verabreicht werden.
8. Wake the mouse aus der Narkose nach örtlich genehmigten Umgang mit Tieren Protokoll. Die Maus sollte auf einer Heizplatte p gehalten werdenad beizubehalten normale Körpertemperatur, wie es aus der Narkose aufwacht. Der chirurgische Eingriff sollte weniger als fünf Minuten in Anspruch nehmen, nicht mitgerechnet die Zeit für die Maus auf die Anästhesie unterziehen. Daher ist ein Heizkissen nicht während des eigentlichen Verfahrens notwendig, kann aber benötigt, während man das Erlernen der Technik, da das Verfahren eine längere Zeit dauern könnte. Die Maus sollte nicht wieder in einem sauberen Käfig gelegt werden, bis sie begonnen hat sich zu bewegen auf seine eigenen. Für Neugeborene wird sanften Fuß drückt ihnen helfen, in vollem Umfang von der Narkose erholen, und sie sollten ihre rosa Farbe und Bewegung, bevor sie wieder mit der Mutter gelegt zurückzugewinnen. Mäuse sollten im Laufe der Zeit auf Anzeichen von Stress überwacht werden, da zuvor aufgeführten.

Ergebnisse

Eine Zeichnung der Maus Auge mit großen Strukturen als Referenz bezeichnet gezeigt, mit Pfeilen Darstellung der Standorte für beide intravitrealen und subretinale Injektion chirurgischen Eingriffen (Pfeilspitzen, Abbildung 1). Gentherapie-Vektoren, wie das lacZ lentiviralen Vektor (Figur 2), kann unter Verwendung dieser Positionen injiziert werden. Zusätzlich können Stammzellen, wie embryonalen Stammzellen der Maus (Abbildung 3), auch an diesen Stellen in d...

Diskussion

Dieses Video-Technik enthält Anweisungen zum Ausfüllen des subretinalen Injektion chirurgischen Eingriff erfolgreich, und sicherzustellen, dass die Gentherapie-Vektor oder Stammzellen in der Lage erforderlich sind, um effizient behandeln die Augenerkrankung platziert werden. Diese Technik erlaubt die Targeting von Retinazellen wie RPE oder Photorezeptoren, da es die Gentherapievektoren oder Stammzellen abgeleiteten Geweben stellt sich in der Nähe dieser Zellen. Frühere Verfahren involviert intravitreale Injektionen,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Firma	Katalog	Kommentare
0,8-1,10 x 100 mm Kapillarrohr (Glas)	Kimble Glass, Inc.	34502 99
Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung	Sutter Instrument	P-97	Narishige microforge kann stattdessen verwendet werden. Catalog # MF-900
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-25ML	Silikon
Dubecco die Phosphate Buffered Saline mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid	Gibco-Invitrogen	14040-133
Safety-Lok 25 3/4G x 12 "; Blutentnahme-Set	BD Vacutainer	367298
1 ml Sub-Q 265/8G Slip-Tip Spritze	Becton-Dickinson	309597
0,5-10 ul Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetten	Fisherbrand	21-377-815
1-200 ul Natürliche abgeschrägten Spitzen	USA Scientific, Inc.	1111-1700
Discovery.V8 Stereomikroskop	Zeiss	MC1500
60 mm x 15 mm Style Behandelte Polystyrol Zellkultur Schale	Corning Incorporated	430166
Vannas Gerade Schere	Storz Ophthalmics	E3383 S
Gebogene Pinzette mit Serrations Delicate	Storz Ophthalmics	E1408
15 Grad Mikrochirurgie Knife	Wilsam Ophthalmic Corp	091204
Ketamin	Ketaset III	NADA # 45-290
Xylazin	Lloyd Laboratories	NADA # 139-236
Bupivacain (Carbostesin)	AstraZeneca	N / A
Buprenorphin	Sigma Aldrich	B9275