Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'œil de la souris

Résumé

Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'oeil de la souris.

Résumé

La perte de la vue affecte environ 3,4 millions de personnes aux États-Unis et devrait augmenter dans les années à venir. ¹ Récemment, la thérapie génique et les transplantations de cellules souches sont devenus les principaux outils thérapeutiques pour le traitement de la cécité due à des maladies dégénératives rétiniennes. Plusieurs formes de transplantation autologue pour la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), comme l'iris pigment transplantation de cellules épithéliales, ont généré des résultats encourageants, et les essais cliniques humains ont commencé pour d'autres formes de thérapies cellulaires de gènes et la tige. ² Il s'agit de remplacement de gène RPE65 chez des patients souffrant amaurose congénitale de Leber et une greffe de cellules RPE en utilisant de l'homme souches embryonnaires (ES) cellules dans la maladie de Stargardt. ^3-4 Maintenant qu'il ya des vecteurs de thérapie génique et les cellules souches disponibles pour le traitement de patients atteints de maladies rétiniennes, il est important de vérifier ces thérapies potentielles dans les modèles animaux avant d'appliquertion entre eux dans les études humaines. La souris est devenue un modèle important scientifique pour tester l'efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique et de la transplantation de cellules souches dans l'œil. ^5-8 Dans cet article, vidéo, nous présentons une technique pour injecter des vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'œil de la souris tout en minimisant les dommages aux tissus environnants.

Protocole

1. Dispositifs pour assembler l'injection sous-rétinienne

1. Acheter ou fabriquer une aiguille 100 um de diamètre à partir d'un tube capillaire en verre. Cela peut être fait manuellement à l'aide d'un extracteur de Sutter P-97 pipette ou tout autre équipement similaire. L'extrémité du tube capillaire est chauffé et tiré jusqu'à ce qu'il atteigne le diamètre souhaité (100 um). Une aiguille de diamètre plus petit peut être utilisé pour les vecteurs de thérapie génique, mais c'est le diamètre recommandé pour l'injection des cellules, sans endommager les cellules ou les yeux. Par rapport à aiguilles en acier, l'aiguille capillaire en verre a une pointe très fine, mais émoussé, afin de permettre la visualisation de l'injection de fluide et l'accès à l'espace sous-rétinien sans causer de bris de la rétine. Nettoyez ces aiguilles tiré si nécessaire à l'aide d'éthanol à 70%, et les entreposer dans un contenant stérile. Un plat de 15 cm stérile culture de tissu avec du ruban adhésif pour tenir les aiguilles en place est un moyen par lequel de garder les aiguilles d'injection couvert et dans un environnement stérile. À ce stade, complEté la mise en place au sein de la salle d'opération où la procédure aura lieu. Il est plus facile de garder tous les équipements de la salle de chirurgie en tout temps pour lui permettre de rester stérile, surtout si cette procédure est faite dans un établissement de barrière.
2. Aspirer de silicone dans l'aiguille d'injection et éjecter la silicone pour laisser un revêtement sur les parois internes de l'aiguille. Le revêtement de silicone maximise le passage des cellules et des virus à travers l'alésage d'aiguille, qui, autrement, se coller aux parois de verre capillaire interne.
3. Obtenir une longueur d'environ 8 cm de tube en plastique stérile en coupant une collection de sang 25 ¾ calibre réglé avec luer-lock au point directement après que l'aiguille (retirer l'aiguille de la tubulure).
4. Remplissez un 1 ml Sous-Q 26 5/8-gauge glissement embout de la seringue avec une solution saline stérile et retirer l'aiguille de la seringue.
5. Fixer l'aiguille d'injection à l'extrémité coupée du tube en plastique et fixer la seringue au Luer-Lok à l'autrefin.
6. Aspirer une solution saline stérile pour remplir l'espace vide dans la tubulure et aiguille capillaire, éjectant une solution saline à travers l'aiguille afin de s'assurer qu'il est correctement fixé sans aucune fuite. Ensuite, aspirer une petite quantité d'environ 1 microlitre d'air, dans la pointe de l'aiguille d'injection. Cela séparer le sérum du fluide d'injection et fournir un signal visuel indiquant la fin de l'injection du fluide au cours de l'intervention chirurgicale. Le dispositif d'injection doit être maintenu sur une surface propre essuyés avec de l'éthanol à 70% pendant l'intervention chirurgicale. De plus, tout le matériel utilisé au cours de l'intervention chirurgicale doit être nettoyé avant et après avec de l'éthanol 70%, pour l'exception des aiguilles d'injection qui doit être conservé déjà stérilisé et prêt à l'emploi. Ces aiguilles doivent être éliminés après la chirurgie, et non réutilisé.
7. Enfin, aspirer solution injectable contenant le vecteur désiré emballé thérapie génique virale ou les cellules souches. Cela peut être fait parprise de la solution d'injection dans une pointe de pipette stérile, puis la solution de pipetage sur la surface d'une boîte de culture cellulaire stérile. La solution peut maintenant être facilement aspiré dans l'aiguille d'injection à l'aide de la seringue. Le montant nécessaire varie en fonction de l'âge de la souris. Pour nos besoins, nous utilisons post-natales jour 5 souris, qui peuvent être injectés avec de 0,5 à 0,8 l de liquide d'injection. De plus petites quantités, 0,5 pi ou moins, peuvent être utilisés pour souris plus jeunes et de plus grandes quantités, tels que 1 pl, peut être utilisé pour les souris adultes. Le titre viral ou le nombre de cellules doit être déterminée sur la base des virus / cellules étant injectés et leur tissu cible désiré, comme un trop grand nombre de particules virales ou de cellules dans un petit volume peut conduire à une toxicité pour les cellules de la rétine. Dans la vidéo, à des fins de visualisation, nous avons utilisé 1,5 pl, une plus grande quantité de colorant que nécessaire d'injecter dans l'œil.

2. Accès à l'espace sous-rétinien

1. Dans la salle chirurgicale stérile,stabiliser ou anesthésier la souris selon le protocole de manipulation des animaux approuvés localement, qui varient selon l'âge de la souris. Anesthésie commun pour les souris adultes inclut l'utilisation du gaz isoflurane ou une injection intra-péritonéale de 0,1 poids corporel ml/10g de kétamine (100 mg / ml) et de xylazine (20 mg / ml) dans une solution saline stérile. Pour les souris périnatales, les techniques d'anesthésie communs incluent l'utilisation du gaz isoflurane ou cryoanesthesia (hypothermie). Toutes les techniques d'anesthésie doit être approuvé par le comité IACUC locale avant utilisation. Nous utilisons généralement post-natal jour (P) 5 souris, bien que des techniques similaires peuvent être appliquées à des souris dès l'âge de P0 ou à des souris adultes. L'intervention chirurgicale ne peut pas commencer tant que la souris a cessé bouger les membres et ne répond plus aux pieds pincées. Pour les souris périnatales, ils deviendront nettement plus légers en couleur depuis le flux sanguin va ralentir, une autre clé pour savoir qui ils sont entièrement sous anesthésie.
2. Chez les souris périnatales, utilisez des ciseaux Vannas droites à mefforcer d'environ 1,5 mm incision le long de la fissure couvercle fermé. Veillez à couper à la mise en retrait, où l'œil va naturellement ouvrir à l'avenir. Cela garantit que les couvercles va guérir et ouvrir correctement lors de l'élaboration de la souris. Une lame chirurgicale peut être utilisé à cette fin, même si nous préférons ciseaux Vannas car ils réduisent le risque de perforation de l'œil au cours de cette procédure. Dans la vidéo, les ciseaux ont été utilisés pour percer et couper directement le long de la marge de la paupière. Lors de l'apprentissage de cette technique, pince doit être utilisé pour soulever la paupière avant de couper et de réduire le risque d'endommager l'œil.
3. Séparez les paupières avec pinces à pansement courbes pour proptose l'œil et pincer les paupières légèrement en dessous de l'oeil pour le maintenir proptosed pour injection. Si l'incision couvercle faite en deux étapes est trop grande, l'œil de retomber sous les paupières et éviter une exposition adéquate au cours de la procédure d'injection. Pour les souris adultes, en appliquant une légère pression autour de l'œil avec le dresser pince peut tenir l'œil proptosed pour injection.
4. Faire une petite incision sclérale postérieure à ou à l'équateur du globe en grattant la surface avec une lame de microchirurgie de 15 degrés. Cette incision doit être juste assez grande pour passer la pointe de l'aiguille d'injection, mais pas plus que cela. Si l'on préfère, une petite aiguille pointue comme une aiguille d'acupuncture peut être utilisée pour faire cette incision dans l'espace sous-rétinien au lieu de la lame de microchirurgie. Chez les animaux pigmentation foncée, d'un brun foncé à pigmentation des tissus (la choroïde-rétine épithélium pigmentaire) deviendra visible au point d'incision. En plus légers souris albinos ou pigmentées, un stylo de marquage chirurgical peut être appliqué à la pointe de la lame de microchirurgie à laisser une tache d'encre indiquant le site d'incision. Si claires reflux de liquide (vitré) du site d'incision, la lame a été placée trop profondément et entra dans la cavité vitréenne et le virus thérapeutique ou cellules peuvent entrer dans l'espace lors de l'injection intravitréenne. Pour visualizatisur les fins, nous avons fait l'incision sur ce point dans la vidéo. Il est encore possible de remplir une injection sous-rétinienne dans ce cas, toutefois, le décollement de la rétine causée par la présence du fluide d'injection ne peut pas guérir complètement de cette souris. Par conséquent, des précautions doivent être prises pour ne couper que la surface externe de l'œil et non à travers la rétine avant l'injection.
5. Soigneusement insérer l'aiguille d'injection dans le site d'incision et de faire avancer ce parallèlement à la paroi externe de l'œil de pénétrer dans l'espace sous-rétinien. Avancer trop près de la paroi extérieure ou trop profondément dans l'œil dirigera l'injection dans le mauvais endroit. La meilleure méthode pour comprendre si l'aiguille est dans la position correcte consiste à pratiquer la technique. Pratiquer sur des souris albinos ou légèrement pigmentées peuvent aider à faire des injections précises et exactes dans l'espace sous-rétinien. C'est parce que le fluide d'aiguille et l'injection est visible dans ces yeux.
6. Appliquez une légère pression sur le piston de la seringue et êtregin injection du fluide désiré. Si l'aiguille est correctement placée dans l'espace sous-rétinien, contre-pression modérée se fera sentir. Si l'aiguille se trouve dans le corps vitré, il y aura beaucoup moins de contre-pression et éventuellement certains reflux de fluide lors de l'injection. S'il ya contre-pression importante, maintenir l'aiguille en place depuis au moins 15 secondes supplémentaires avant de retirer l'aiguille lentement. Cela permettra à la haute pression intra-oculaire pour égaliser au lieu de reflux du virus injecté ou cellules vers le site de l'incision. Partie de l'air et de solution saline peut être injecté dans l'espace sous-rétinien dû à l'augmentation de la pression nécessaire au cours de la procédure d'injection. Il faut prendre soin de ne pas trop injecter de l'air ou de sérum physiologique, car il peut éliminer le virus injecté ou des cellules de l'œil. Il est également possible de provoquer un décollement de rétine permanente de la présence de trop de liquide injecté dans l'espace sous-rétinien. Aux fins de visualisation, la teinture et de l'air a été injecté into la sous-rétinien dans l'espace vidéo. Il peut être clairement vu comment certains de colorant seront évacués de retour de l'espace sous-rétinien si trop est injecté, mais aussi comment la bulle d'air reste dans l'espace sous-rétinien et ne disparaît pas dans le corps vitré. Il a été utilisé pour souligner que ces injections étaient tous dans l'emplacement correct de l'œil, si l'on peut visualiser comment l'aiguille doit entrer dans le site de l'incision. Toutes les injections dans l'espace sous-rétinien de provoquer un décollement de la rétine temporaire en raison de la présence du fluide d'injection. Si la procédure d'injection est correctement rempli, ce détachement temporaire rétine va guérir dans les 24 heures et la souris peut être utilisée pour toutes les autres expériences. L'œil peut rester doux pendant environ une semaine en raison de l'intervention chirurgicale, donc une deuxième injection doit être évitée au cours de cette période de temps.
7. Pour souriceaux nouveau-nés, utilisez les pinces à pansement courbes pour pousser doucement les yeux derrière les paupières et dans l'orbite. Il peut être utileattendre une minute afin de permettre au virus de s'installer dans l'espace sous-rétinien et non l'amener à être évacuée du site d'incision quand poussant doucement l'œil en arrière sur son orbite. Après la chirurgie, une goutte de bupivacaïne à 0,5% (marcaïne) diluée à 0,25% dans une solution saline stérile à partir d'une aiguille de calibre 25 peut être placé sur le site d'injection. Les souris ne présentent pas de signes évidents de détresse après la chirurgie sous-rétinienne et l'utilisation de la bupivacaïne comme un analgésique à action prolongée actualité a été suffisant pour les trois années précédentes. Les souris doivent toujours être surveillés après l'intervention chirurgicale pour rechercher des signes de détresse; telles que l'infection, une enflure ou une diminution dans les activités journalières habituelles de la souris. Si ceci se produit, le vétérinaire doit être notifié et d'autres médicaments contre la douleur tels que la buprénorphine (0,05 mg / kg) peut être administré par injection intrapéritonéale.
8. Réveillez la souris de l'anesthésie selon le protocole de manipulation des animaux approuvée localement. La souris doit être maintenu sur une p chauffageannonce à maintenir la température normale du corps car il se réveille de l'anesthésie. La procédure chirurgicale devrait prendre moins de cinq minutes à remplir, sans compter le temps de la souris pour subir une anesthésie. Par conséquent, un coussin chauffant n'est pas nécessaire lors de la procédure proprement dite, mais il peut être nécessaire alors que l'on apprend la technique que la procédure pourrait prendre une plus longue durée de temps. La souris ne doit pas être remis dans une cage propre jusqu'à ce qu'il a commencé à se déplacer tout seul. Pour les nouveau-nés, pincées orteils doux aidera pour eux de se remettre complètement de l'anesthésie, et ils devraient retrouver leur couleur rose et le mouvement avant d'être remis à la mère. Les souris doivent être suivies dans le temps pour détecter tout signe de détresse comme indiqué précédemment.

Résultats

Un dessin de l'oeil de la souris est démontré à de grandes structures étiquetées à titre de référence, avec des flèches montrant les emplacements pour les procédures d'injection intravitréenne et sous-rétinien tant chirurgicales (pointes de flèches, figure 1). Vecteurs de thérapie génique, tels que le vecteur lentiviral lacZ (figure 2), peut être injecté à l'aide de ces endroits. En outre, les cellules souches, comme les cellules souches embryonnai...

Discussion

Cette technique vidéo fournit des instructions sur l'achèvement de la procédure chirurgicale injection sous-rétinienne avec succès, et veiller à ce que le vecteur de thérapie génique ou les cellules souches sont placés dans l'emplacement nécessaire pour traiter efficacement la maladie ophtalmique. Cette technique permet le ciblage des cellules de la rétine comme l'EPR ou photorécepteurs, car il place les vecteurs de thérapie génique ou de cellules souches dérivées de tissus dans le voisinage ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Catalogue	Commentaires
0,8 à 1,10 x 100 mm Tube capillaire (verre)	Kimble Glass, Inc	34502 99
Flaming / Brown Micropipette Puller	Instrument Sutter	P-97	Narishige microforge peut être utilisé à la place. Catalogue MF-900
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-25ML	Silicone
Phosphate Buffered Saline Dubecco de chlorure de calcium et chlorure de magnésium	Gibco Invitrogen-	14040-133
Safety-Lok 25 3/4G x 12 "; de prélèvement sanguin	BD Vacutainer	367298
1 ml Sous-Q 265/8G Slip-Tip Syringe	Becton-Dickinson	309597
0,5 à 10 ul Finnpipette II-Volume réglable Pipette	Fisherbrand	21-377-815
1-200 ul Conseils naturelles biseautés	USA Scientific, Inc	1111-1700
Discovery.V8 Microscope stéréo	Zeiss	MC1500
60 mm x 15 mm Style de traité vaisselle culture cellulaire Polystyrène	Corning Incorporated	430166
Ciseaux Vannas droites	Storz Ophthalmics	E3383 S
Curved Forceps Dressing avec des dentelures délicates	Storz Ophthalmics	E1408
15 Couteau microchirurgie Degré	Wilssur ophtalmique Corp	091204
La kétamine	Ketaset III	NADA # 45-290
Xylazine	Laboratoires Lloyd	NADA # 139-236
La bupivacaïne (Marcaïne)	AstraZeneca	N / A
La buprénorphine	Sigma Aldrich	B9275