Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

Özet

Bu cerrahi teknik fare gözün subretinal boşluk içine gen terapisi vektörleri ve kök hücrelerinin enjeksiyonu göstermektedir.

Özet

Görme kaybı Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 3.4 milyon insanı etkileyen ve önümüzdeki yıllarda daha da artacağı beklenmektedir. Son ^1, gen tedavisi ve kök hücre nakilleri retinal dejeneratif hastalıklardan kaynaklanan körlük tedavisinde önemli terapötik araç haline gelmiştir. Böyle iris pigment epitel hücre transplantasyonu gibi yaşa bağlı makula dejenerasyonu için otolog transplantasyon çeşitli formları (AMD), ümit verici sonuçlar yarattı ve insan klinik gen ve kök hücre tedavileri diğer formları için başladık. ² Bunlar RPE65 gen değiştirme dahil Leber konjenital amarozu ve Stargardt hastalığında insan embriyonik kök (ES) hücreler kullanılarak RPE hücre nakli olan hastalarda tedavi. ^3-4 Şimdi gen tedavisi vektörleri ve retina hastalıkları olan hastaların tedavisinde kök hücre mevcuttur olduğunu, bunu doğrulamak için önemlidir hayvan modellerinde bu potansiyel tedavilerin önce başvurmalarıinsan çalışmalarında bunları ing. Fare göz gen tedavisi vektörleri ve kök hücre nakli tedavi etkinliğinin saptanması için önemli bir bilimsel model haline gelmiştir. Bu video makalede ^5-8, biz subretinal alana gen tedavisi vektörleri veya kök hücreleri enjekte için bir yöntem sunmak fare gözü çevreleyen doku hasarı en aza indirerek.

Protokol

1. Subretinal Enjeksiyon için cihazlar monte

1. Satın alma veya bir cam kapiller tüp bir 100 mikron çaplı iğne yapmak. Bu bir Sutter P-97 pipet çektirmesi veya diğer benzeri ekipman kullanarak elle de yapılabilir. Istenilen çapı (100 um) ulaşana kadar kılcal boru ucu ısıtılır ve çekilecektir. Daha küçük çaplı bir iğne gen terapisi vektörleri için de kullanılabilir, ancak bu hücreler veya göze zarar vermeden hücre enjeksiyon için önerilen bir çapa sahiptir. Çelik iğneleri ile karşılaştırıldığında, cam kılcal iğne retinal kopma neden olmadan, enjeksiyon sıvı ve retina altı alanı için erişim görselleştirilmesi için izin vermek için, bir çok ince, fakat küt uç vardır. Steril bir kap içinde% 70 etanol ve mağaza kullanarak gerekirse bu çekti iğne temizleyin. Yerde iğneler tutmak için teyp ile 15 cm steril doku kültürü çanak enjeksiyon iğneleri kaplı ve steril bir ortamda tutmak için hangi bir yoludur. Bu noktada, complprosedürü gerçekleşecek cerrahi oda içinde set-up ete. Bu prosedür bir bariyer tesis içinde yapılır, özellikle de steril kalması için her zaman cerrahi odasında tüm ekipman tutmak için en kolay yoldur.
2. Enjeksiyon iğne içine silikon aspire ve iğne iç duvarları boyunca bir kaplama bırakmak için silikon çıkarır. Silikon kaplama aksi iç cam kapiller duvarları sadık kalacağına iğne deliğinden hücreleri ve virüsler, geçişi artırır.
3. (Borudan iğne kaldırarak) doğrudan iğne sonrası noktada luer-lock ile ayarlanmış bir 25 ¾ gauge kan toplama keserek steril plastik boru yaklaşık 8 cm uzunluğunda edinin.
4. Steril serum fizyolojik ile 1 ml Alt-Q 26 5/8-gauge kayma ucu şırınga doldurun ve şırınga iğne çıkarılır.
5. Plastik boru kesik ucuna enjeksiyon iğne takın ve diğer uçta luer kilit için şırınga takmaksonu.
6. Boru ve kılcal iğne ölü boşluk, doğru herhangi bir sızıntı olmadan bağlı olduğundan emin olmak için iğne ile çıkarılması bazı salin doldurmak için steril salin aspire. Daha sonra, enjeksiyon iğne ucunun içine, küçük bir hava, yaklaşık olarak 1 ul miktarı aspire. Bu enjeksiyon sıvısı salin ayırmak ve cerrahi prosedür esnasında enjeksiyon sıvı sonunu gösteren bir görsel işaret temin edecektir. Enjeksiyon aparat cerrahi işlem sırasında% 70 etanol ile sildi temiz bir yüzey üzerinde tutulmalıdır. Ayrıca, cerrahi işlem sırasında kullanılan tüm ekipman hemen kullanıma hazır steril ve tutulması gereken enjeksiyon iğneleri dışındaki için, önce ve% 70 etanol ile sonra her iki temizlenmesi gerekir. Bu iğneler cerrahi sonrası elden değil, yeniden kullanılabilir. Edilmelidir
7. Son olarak, istenen ambalajlı gen tedavisi viral vektör veya kök hücreleri içeren enjeksiyon solüsyonu aspire. Bu yapılabilirdaha sonra bir steril hücre kültürü çanağı yüzeyi üzerine pipetle çözelti, bir steril pipet ucu içine enjeksiyon çözelti kaplamaz. Çözüm artık kolayca şırıngayla enjeksiyon iğnesi aspire edilebilir. Ihtiyaç duyulan miktar fare yaşına bağlı olarak değişir. Bizim amaçlarımız için biz enjeksiyon sıvısının 0.5-0.8 ul enjekte edilebilir doğum sonrası 5. gün fareler, kullanın. Daha küçük miktarlar, ul 0.5 ya da daha az, daha küçük olan fareler ve bu gibi 1 ul gibi büyük miktarlarda için kullanılabilir, yetişkin fareler için de kullanılabilir. Hücrelerin viral titresi veya sayı enjekte edilmiş virüs / hücre ve arzu edilen hedef dokuya göre tespit edilmesi gerekmektedir, küçük bir hacim içinde olduğu gibi çok sayıda viral partiküller ya da hücreler retina hücreleri için toksik yol açabilir. Video, görselleştirme amaçlı, biz 1.5 ul, göz içine enjekte etmek için gerekli olandan boya büyük bir miktarda kullanmışlardır.

2. Subretinal Uzay Erişme

1. Steril cerrahi odası içinde,fare yaşına göre değişir lokal olarak onaylanmış hayvan taşıma protokolüne uygun fare stabilize veya uyutmak. Yetişkin fareler İzofluran anestezi için ortak gaz veya 0,1 ml/10g vücut ağırlığının ketamin (100 mg / ml) ve steril tuzlu su içinde ksilazin (20 mg / ml) bir intra-peritoneal enjeksiyonu içerir. Perinatal fareler için ortak anestezi teknikleri isofluran gaz veya cryoanesthesia (hipotermi) kullanımını içerir. Tüm anestezi teknikleri kullanmadan önce yerel IACUC komitesi tarafından onaylanmış olmalıdır. Benzer teknikler P0 veya yetişkin fareler için genç olarak fareler için uygulanabilir ise de, tipik olarak (P), doğum sonrası 5. günde fareler kullanılır. Fare bacaklarda ve artık tutam tırnağa yanıt hareket sona kadar cerrahi işlem başlayamaz. Perinatal fareler için, onlar kan akımı tamamen anestezi altında olduğunu bilerek, başka bir tuşa yavaşlatacaktır beri renkli belirgin hafif olacak.
2. Perinatal farelerde için Vannas düz makas kullanın mkapağı kapalı fissür boyunca ake yaklaşık 1,5 mm kesi. Gözün doğal olarak gelecekte açılacak girinti de kesmek için dikkatli olun. Bu kapaklar iyileşmesi ve fare gelişimi sırasında düzgün açılacaktır sağlar. Biz, bu işlem sırasında göz delinmesiyle riskini azaltmak beri Vannas makas tercih rağmen bir cerrahi bıçak, bu amaç için kullanılabilir. Video, makas gözkapağı kenarı boyunca doğrudan ponksiyon ve kesim için kullanılmıştır. Bu tekniği öğrenirken, forseps kesim öncesi göz kapağı kaldırın ve gözün zarar verme riskini azaltmak için kullanılmalıdır.
3. Göz proptose ve hafifçe enjeksiyon için proptosed tutmak için göz altına kapaklarının çimdik kavisli soyunma forseps ile göz kapaklarını açarak çekin. Adım iki yapılan kapağı kesisi çok büyükse, göz kapaklarının altında geri kayma ve enjeksiyon işlemi sırasında yeterli pozlama önleyecektir. Dr ile göz çevresinde hafif bir basınç uygulayarak yetişkin fareler içinforseps essing enjeksiyon için proptosed göz tutabilir.
4. Küçük bir skleral az kesi veya 15 derecelik mikrocerrahi bıçak yüzeyi çizilmeye tarafından dünyanın en ekvatora posterior olun. Bu kesi enjeksiyon iğne ucu geçmek için yeterli sadece büyük, ama hayır bu daha büyük olmalıdır. Eğer tercih edilirse, bu gibi bir akupunktur iğne olarak küçük, keskin bir iğne yerine mikrocerrahi bıçağın subretinal boşluk içine bu kesik yapmak için kullanılabilir. Koyu pigmentli hayvanlarda, koyu kahverengi pigmentli doku (koroid-retina pigment epiteli) kesi noktada görünür hale gelecektir. Çakmak pigmentli ya da albino fareler, bir cerrahi işaretleme kalem kesi gösteren bir mürekkep yerinde bırakmak mikrocerrahi bıçak ucu ile uygulanabilir. Kesi yeri net (vitreus) sıvı reflüsü varsa, bıçak çok derin yerleştirilmiş ve vitreus boşluğu ve terapötik virüs veya hücre enjeksiyonu sırasında intravitreal boşluk girebilirsiniz girmiştir. Visualizati içinamaçlar için, biz video bu noktaya kesi yaptık. Bu durumda, bir retina altı enjeksiyon işlemini tamamlamak için yine de mümkündür, ancak enjeksiyon sıvı bulunmasından kaynaklanan retina dekolmanı tam olarak bu fare iyileşmeyen olabilir. Bu nedenle, bakım enjeksiyondan önce sadece dış göz yüzeyi ile değil, retina kesmek için özen gösterilmelidir.
5. Dikkatle kesi site içine enjeksiyon iğnesi takın ve subretinal boşluk girmek için dış gözün duvarına paralel ilerlemek. Göz içindeki dış duvara çok yakın veya çok derin ilerlemek konumu yanlış içine enjeksiyon yönetecek. İğne doğru konumda olup olmadığını anlamak için en iyi yöntem tekniği uygulamak için. Hafifçe pigmentli veya albino fareler üzerinde Pratiği subretinal alana kesin ve doğru enjeksiyon yapmak için yardımcı olabilir. Iğne ve enjeksiyon sıvısı bu gözlerin içinde görünür olmasıdır.
6. Şırınga pistonu hafif basınç uygulayın ve olmayacakİstenen sıvı cin enjeksiyonu. İğne doğru subretinal boşluk içinde yer almakta ise, ılımlı geri basınç hissedilecektir. Iğne vitröz içinde ise, enjeksiyon sırasında önemli ölçüde daha az geri basınçta ve potansiyel olarak bir sıvı geri akışta olacaktır. Anlamlı geri basınç varsa, yavaş yavaş iğne çıkarmak için en az bir ek 15 saniye için yerinde iğne tutun. Bu yüksek göz içi basıncı kesi dışarı geri enjekte virüs veya hücrelerin reflüyü yerine eşitlemek için izin verecektir. Hava ve tuzlu bazı enjeksiyon işlemi sırasında gerekli olan artan basınç nedeniyle subretinal boşluk içine enjekte edilebilir. Bakım bunun gözünden enjekte virüs veya hücrelerin dışarı yıkayın yana, hava veya salin aşırı enjekte etmek değil alınmalıdır. Bu, subretinal boşluk içine enjekte çok fazla sıvı varlığında ikinci kalıcı retina dekolmanı neden olması da mümkündür. Görüntüleme amaçları için, fazla boya ve hava enjekte edildi intvideo subretinal boşluk o. Açıkça hava kabarcığı subretinal boşluk içinde kalır ve vitreus içine geçmezse ne de çok fazla enjekte ise boya bazı subretinal boşluk geri atılır nasıl görülür, ama olabilir. Bu bu enjeksiyonları gözün doğru konuma içindeki bütün olduğunu vurgulamak için kullanılır, bu yüzden tek bir iğne kesi girmelidir nasıl tahayyül edebilirsiniz. Subretinal boşluk içine Tüm enjeksiyonlar enjeksiyon sıvı varlığı nedeniyle, geçici bir retina dekolmanı neden olur. Enjeksiyon prosedür doğru tamamlandığı takdirde, bu geçici retina dekolmanı diğer tüm deneyler için kullanılan 24 saat ve fareler içinde iyileşir. Göz cerrahi prosedür nedeniyle yaklaşık bir hafta boyunca yumuşak kalabilir, ikinci bir enjeksiyon zaman bu dönemde kaçınılmalıdır böylece.
7. Yenidoğan farelerin için hafifçe geriye kapaklarının arkasında ve yörüngeye göz itmek kavisli soyunma forseps kullanın. Bu yararlı olabilirvirüs subretinal boşluk içinde yerleşmek ve yavaşça onun yörüngesine geri göz iterek zaman kesi dışarı kızarmış neden değil izin vermek için bir dakika bekleyin. Ameliyattan sonra,% 0.5 bupivakain bir damla (Marcaine) enjeksiyon yerinde yerleştirilebilir bir 25-gauge iğne steril salin içinde% 0.25 'ye seyreltilir. Fare subretinal cerrahi sonrası sıkıntı belirgin belirti görünmüyor ve uzun etkili bir topikal analjezik olarak bupivakain kullanımı önceki üç yıl için yeterli olmuştur. Enfeksiyon gibi, şişme veya fare normal günlük aktiviteler bir azalma; Fareler her zaman herhangi bir sıkıntı belirtileri aramak için cerrahi işlem sonrası takip edilmelidir. Bu meydana gelirse, veteriner haberdar edilmelidir ve bu buprenorfin (0.05 mg / kg) olarak daha fazla ağrı kesici ilaçlar intraperitoneal enjeksiyon şeklinde verilebilir.
8. Lokal olarak onaylanmış hayvan taşıma protokolüne göre anestezi fare uyandır. Fare bir ısıtma p üzerinde tutulmalıdırBu anestezik modundan gibi reklam, normal vücut ısısını korumak için. Cerrahi, anestezi fare zamanı saymazsak, tamamlamak için en az beş dakika sürer. Bu nedenle, bir ısıtma pedi asıl işlem sırasında gerekli değildir, fakat bu işlem daha uzun bir süre sürebilir gibi bir yöntem öğrenme sırasında ihtiyaç olabilir. Kendi başına hareket etmeye başlamıştır kadar fare temiz bir kafes içine geri konulmamalıdır. Yenidoğanlar için, yumuşak ayak tutam tamamen anestezi kurtarmak için onlara yardımcı olacak ve onlar annesi ile geri konuyor önce pembe renk ve hareket kazanmak gerekir. Olarak listelenen önceden Fare sıkıntı herhangi bir işaret için zaman içinde izlenmelidir.

Sonuçlar

Fare gözün bir çizim intravitreal ve subretinal hem enjeksiyon cerrahi işlemler (ok başları, Şekil 1) için yerleri gösteren oklar ile, referans için etiketli önemli yapıları ile gösterilir. Bu tür lacZ lentiviral vektörü (Şekil 2) gibi Gen tedavisi vektörleri, bu konumlar kullanılarak enjekte edilebilir. Ayrıca, bu tür fare embriyonik kök hücre (Şekil 3), kök hücreleri gibi, aynı zamanda, fare gözünde bu alanlardaki transplante edi...

Tartışmalar

Bu video tekniği başarıyla subretinal enjeksiyon cerrahi prosedürünü tamamladıktan ve gen terapi vektörü veya kök hücreleri verimli oftalmik hastalığı tedavi etmek için gerekli konuma yerleştirilir sağlanması ile ilgili yönergeler sağlar. Bu hücrelerin çevresinde gen terapisi vektörleri ya da kök hücresi kaynaklı dokuların yerleştirilir çünkü bu yöntem, böyle bir RPE ve fotoreseptör gibi retinal hücre hedefleme için olanak sağlar. Önceki yöntemler sıvı vitreus boşluğu içinde y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Katalog	Yorumlar
0,8-1,10 x 100 mm Kapiler Tüp (cam)	Kimble Cam, Inc	34502 99
/ Brown Mikropipet Çektirme Flaming	Sutter Instrument	P-97	Narishige microforge yerine kullanılabilir. Katalog # MF-900
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-25ml	Silikon
Dubecco en Fosfat Kalsiyum Klorür ve Magnezyum Klorür ile Tamponlu Salin	Gibco-Invitrogen	14040-133
Emniyet-Lok 25 3/4G x 12 "; Kan Toplama Seti	BD Vacutainer	367298
1 ml alt-Q-265/8G Slip-İpucu Şırınga	Becton-Dickinson	309597
0.5-10 ul Finnpipette II Ayarlanabilir Hacim Pipetter	Fisherbrand	21-377-815
1-200 ul Doğal Eğimli İpuçları	USA Scientific, Inc	1111-1700
Discovery.V8 Stereo Mikroskop	Zeiss	MC1500
60 mm x 15 mm Stil Tedavi Polistiren Hücre Kültürü Bulaşık	Corning Incorporated	430166
Vannas Düz Makas	Storz Ophtalmics'in	E3383 S
Narin tırtıklar Kavisli Giyinme Forseps	Storz Ophtalmics'in	E1408
15 Derece Mikrocerrahi Bıçak	WilsOftalmik Corp üzerine	091204
Ketamin	Ketaset III	NADA # 45-290
Ksilazin	Lloyd Laboratuvarlar	NADA # 139-236
Bupivakain (marcain)	AstraZeneca	N / A
Buprenorfin	Sigma Aldrich	B9275