Субретинальной инъекция генной терапии векторы и стволовых клеток в мышь глаз

Резюме

Этот хирургический метод иллюстрирует введение генной терапии векторы и стволовых клеток в субретинальной пространство мыши глаз.

Аннотация

Потеря зрения затрагивает около 3,4 млн. человек в США и, как ожидается, увеличится в ближайшие годы. ^{1 Недавно,} генной терапии и трансплантации стволовых клеток стали ключевыми лечебного средства для лечения слепоты в результате дегенеративных заболеваний сетчатки. Несколько форм аутотрансплантации для возрастной макулярной дегенерации (ВМД), таких, как ирис пигментного эпителия клеточной трансплантации, вызвали обнадеживающие результаты, и человеческие клинические испытания начались для других форм терапии генов и стволовых клеток. ² Они включают в себя ген RPE65 замены терапии у пациентов с врожденным амаврозом Лебера и НПП трансплантации клеток с использованием человеческих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток при болезни Штаргардта. ^3-4 Теперь, когда есть генной терапии векторы и стволовых клеток для лечения пациентов с заболеваниями сетчатки, важно, чтобы проверить этих потенциальных методов лечения на животных моделях, прежде чем применятьING их в исследованиях на человеке. Мышь стала важной научной модели для проверки терапевтической эффективности генной терапии векторы и трансплантации стволовых клеток в глазу. ^5-8 В этом видео статье мы представляем технику для введения генной терапии векторы или стволовых клеток в субретинальной пространстве мышь глаз при сведении к минимуму повреждение окружающих тканей.

протокол

1. Сборка устройства для инъекций субретинальной

1. Покупка или сделать 100 мкм в диаметре иглы из стекла капиллярной трубке. Это можно сделать вручную с помощью Саттер Р-97 Съемник пипетки или другого подобного оборудования. В конце капилляра будет нагреваться и вытащил, пока не достигнет желаемого диаметра (100 мкм). Меньшего диаметра иглы могут быть использованы для вектора генной терапии, однако это рекомендуемый диаметр для инъекции клеток без повреждения клеток или глаз. По сравнению со стальными иглами, стеклянный капилляр игла имеет очень хорошо, но тупой наконечник, чтобы обеспечить визуализацию инъекции жидкости и доступ к субретинальной пространстве, не вызывая сетчатки поломки. Очистите эти вытащил иглы, при необходимости с использованием 70% этанола и хранят в стерильный контейнер. 15 см стерильную чашку культуре ткани с лентой, чтобы удерживать иглы в место является одним из способов, в которых сохранить инъекционных игл покрыты и в стерильных условиях. На данный момент, в сбореETE настройки в хирургической комнате, где процедура состоится. Легче всего поддерживать все оборудование в хирургическом номер в любое время, для того, чтобы оставаться стерильным, особенно если эта процедура проводится в течение барьер центр.
2. Аспирируйте силикона в инъекционной иглой и извлечение силиконовой чтобы оставить покрытия вдоль внутренней стены иглу. Силиконовое покрытие максимально прохождение клеток и вирусов через иглу отверстие, которое могло бы прилипают к внутренней стеклянной стенки капилляров.
3. Получите около 8 см длиной стерильные пластиковые трубы за счет сокращения на 25 ¾ калибра сбора крови устанавливается с Luer-Lock в точке непосредственно после иглой (удаление иглы из трубы).
4. Заполнить 1 мл Sub-Q 26 5/8-gauge скольжения наконечника шприц стерильным физиологическим раствором и удалить иглу от шприца.
5. Прикрепить инъекционной иглой, чтобы обрезанный конец пластиковой трубки и прикрепить шприц Luer-Lock на другойконца.
6. Аспирируйте стерильного физиологического раствора, чтобы заполнить пустое пространство в капиллярной трубки и иглы, выбрасывая некоторые солевой через иглу, чтобы убедиться, что он правильно прикреплен без какой-либо утечки. Далее, аспирации небольшой, примерно в 1 мкл количество воздуха, в кончик инъекционной иглой. Это позволит отделить солевой от введения жидкости и обеспечивают визуальный сигнал, указывающий на конец инъекции жидкости во время хирургической операции. Инъекций аппарата должны храниться на чистой поверхности протереть 70% этанола во время хирургической процедуры. Кроме того, все оборудование, используемое во время хирургической процедуры должны быть очищены до и после с 70% этанола, для исключения введения игл, которые уже должны быть стерильны и готовы к использованию. Эти иглы следует выбрасывать после операции, а не использовать повторно.
7. Наконец, аспирации раствор для инъекций, содержащие требуемый упакованных генной терапии вирусных векторов или стволовых клеток. Это может быть сделано путемвзяв раствор для инъекций в стерильный наконечник пипетки, затем пипеткой раствор на поверхность стерильную чашку для культивирования клеток. Решение может быть теперь легко атмосферный в инъекционной иглой с помощью шприца. Необходимая сумма будет варьироваться в зависимости от возраста мыши. Для наших целей мы используем послеродовой день 5 мышей, которые могут быть введены с 0.5-0.8 мкл инъекции жидкости. Меньшие количества, 0,5 мкл или менее, могут быть использованы для молодых мышей и больших количествах, такие как 1 мкл, могут быть использованы для взрослых мышей. Титр вируса или количество клеток должно быть определено на основе вируса / клетки, введенного и их желаемой ткани-мишени, так как слишком многие вирусные частицы или клетки в небольшом объеме может привести к токсичности для клеток сетчатки. В видео, для визуализации целей, мы использовали 1,5 мкл, большее количество красителя, чем необходимо для введения в глаз.

2. Доступ к субретинальной Космические

1. В стерильной хирургической комнате,стабилизировать или анестезию мыши в соответствии с утвержденным протоколом локально животных обработку, которая будет варьироваться в зависимости от возраста мыши. Общий наркоз для взрослых мышей включает в себя использование изофлуран газа или внутрибрюшинно инъекции 0,1 ml/10g веса тела кетамина (100 мг / мл) и ксилазина (20 мг / мл) в стерильный физиологический раствор. Для перинатального мышей, распространенных методов анестезии включают в себя использование изофлуран газа или cryoanesthesia (гипотермия). Все методы анестезии должны быть одобрены вашим местным IACUC комитета перед использованием. Обычно мы используем послеродовой день (P) 5 мышей, хотя подобные методы могут быть применены к мышам в возрасте P0 или взрослых мышей. Хирургическая процедура не может начаться, пока мышь перестала перемещения конечностей и больше не реагирует на носу соль. Для перинатального мышей, они станут заметно светлее, так как поток крови будет замедляться, еще один ключ к зная, что они находятся под полным наркозом.
2. В перинатальном мышей, использовать Vannas прямые ножницы маке приближенные 1,5 мм разрез вдоль замкнутых трещин крышкой. Будьте осторожны, чтобы сократить на отступы, где глаз естественным открыть в будущем. Это гарантирует, что веки будут лечить и правильно открыть при разработке мыши. Хирургические лезвия могут быть использованы для этой цели, хотя мы предпочитаем Vannas ножницы, так как они снижают риск прокола глаза во время этой процедуры. В видео, ножницы используются для непосредственного прокола и разрез по краю века. При изучении этой техники, щипцы должны быть использованы для подъема век до резки и снижения риска повреждения глаза.
3. Растащить век с изогнутым пинцетом повязку на proptose глаза и зажать веки немного под глаза, чтобы держать это proptosed для инъекций. Если крышка разрез, сделанный в шаге два слишком большой, глаза будет скользить назад под крышками и предотвращения адекватного воздействия во время инъекции процедуры. Для взрослых мышей, слегка надавив, вокруг глаз с докторомEssing щипцы можете держать глаза proptosed для инъекций.
4. Сделайте небольшой надрез склеры на или позади экватора земного шара, царапая поверхность с 15-градусный микрохирургии лезвие. Этот разрез должен быть только достаточно большим, чтобы пройти кончик инъекционной иглы, но не больше, чем это. Если предпочтительнее, маленькие, острые иглы, такие как иглоукалывание иглы могут быть использованы, чтобы сделать этот разрез в субретинальной пространство вместо лезвия микрохирургии. В темно пигментированные животные, темно-коричневый пигмент ткани (сосудистая оболочка-пигментного эпителия сетчатки), который будет виден в точке разреза. В легких пигментированные или белых мышей, хирургическим маркером может быть применен к кончик лезвия микрохирургии, чтобы оставить чернильное пятно с указанием разреза. Если ясно (стекловидный) жидкости рефлюксов от разреза, клинок был сделан слишком глубоко и вошел в полость стекловидного тела и терапевтические вирусы или клетки могут ввести интравитреальных пространства во время инъекции. Для visualizatiна цели, мы сделали надрез, чтобы этот момент на видео. Это еще можно завершить субретинальной инъекции в этом случае, однако отслойки сетчатки обусловлена ​​наличием системы впрыска жидкости не может полностью излечить в этой мыши. Таким образом, необходимо позаботиться, чтобы сократить только внешние поверхности глаза, а не через сетчатку перед инъекцией.
5. Осторожно вставьте инъекции иглу в место разреза и продвигать его параллельно внешней стене глаза, чтобы войти в субретинальной пространстве. Продвижение слишком близко к наружной стене или слишком глубоко в глаза направят инъекции в неправильном месте. Лучший способ понять, является ли игла находится в нужном месте, чтобы практиковать технику. Практика на слегка пигментированной или белых мышей может помочь сделать точный и аккуратный вливаний в субретинальной пространстве. Это происходит потому, иглы и инъекции жидкости виден в этих глазах.
6. Слегка надавите на поршень шприца и бытьджин введения желаемого жидкости. Если игла правильно размещены в субретинальной пространства, умеренное противодавление будет ощущаться. Если стрелка находится в стекловидное тело, там будет значительно меньше противодавление и, возможно, некоторое количество жидкости рефлюкса во время инъекции. Если есть значительное противодавление, держа иглу в место, по крайней мере еще на 15 секунд, прежде чем снимать иглу медленно. Это позволит высокое внутриглазное давление, чтобы уравнять вместо кипячения вводят вирус или клетки обратно разреза. Некоторые из воздуха и соленых может быть введен в субретинальной пространства в связи с увеличением давления, необходимого во время инъекции процедуры. Следует проявлять осторожность, чтобы не чрезмерно введения воздуха или физиологического раствора, так как он может избавиться от вируса или вводили клетки из глаз. Это также можно вызвать постоянное отслойки сетчатки с наличием слишком большого количества жидкости вводится в субретинальной пространстве. Для наглядности, избыток краски и воздуха вводили IntO субретинальной пространства в видео. Это можно ясно увидеть, как некоторые из красителя будут сброшены обратно из субретинальной пространства, если слишком много инъекций, но и как пузырек воздуха остается в пределах субретинальной пространстве и не исчезает в стекловидное тело. Это было использовано, чтобы подчеркнуть, что эти инъекции были все в правильное расположение глаз, так что можно представить, как игла должна войти в месте разреза. Все инъекции в субретинальной пространства вызвать временное отслойки сетчатки в связи с наличием системы впрыска жидкости. Если инъекция процедура выполнена правильно, это временное отслоение сетчатки будет заживать в течение 24 часов и мышей может быть использован для всех дальнейших экспериментов. Глаз может оставаться мягкой в ​​течение примерно одной недели в связи с хирургическим вмешательством, так второй инъекции следует избегать в этот период времени.
7. Для новорожденных мышей, использовать изогнутый пинцет повязку, чтобы мягко подтолкнуть глаза позади крышки и на орбиту. Это может быть полезнождать минуту для того, чтобы позволить вирусу поселиться в субретинальной пространстве и не привести к его вспыхнул из разреза при легком нажатии глаз обратно в свою орбиту. После операции, по одной капле 0,5% бупивакаина (маркаина) разбавляют до 0,25% в стерильный физиологический раствор из 25-игла может быть размещен в месте инъекции. Мыши не показывают явные признаки дистресса после субретинальной хирургии и использования бупивакаина в качестве длительно действующих актуальных обезболивающее было достаточно в течение предыдущих трех лет. Мыши всегда должны быть проверены после хирургической процедуры, чтобы искать любые признаки бедствия, такие, как инфекция, отек, или уменьшение в обычной повседневной деятельностью мыши. Если это произойдет, то ветеринар должен быть уведомлен об этом и дальнейших обезболивающих, таких как бупренорфин (0,05 мг / кг) может быть задана как внутрибрюшинного введения.
8. Звонок мышь от анестезии в соответствии с утвержденным протоколом локально обработку животных. Мышь должна находиться на отопление робъявление для поддержания нормальной температуры тела, как он просыпается от наркоза. Хирургическая процедура займет не более пяти минут, чтобы закончить, не считая времени для мыши пройти анестезии. Таким образом, грелки не надо во время фактической процедуры, но может быть необходима, а один обучения технике как процедура может занять более длительное время. Мышь не должно быть помещен обратно в чистую клетку, пока он не начал передвигаться на своих собственных. Для новорожденных, нежно щепотки ног поможет им в полной мере оправиться от наркоза, и они должны восстановить свои розового цвета и движения, прежде чем поместить обратно с матерью. Мыши должны быть проверены в течение долгого времени для любого признаки бедствия, перечисленные ранее.

Результаты

Рисунок мышью глаз показан с крупными структурами, предназначенного для ссылки, со стрелками отображаются места для интравитреальных и субретинальной инъекции хирургических процедур (наконечники стрел, рисунок 1). Генная терапия векторы, такие как LacZ лентивирусов векто?...

Обсуждение

Это видео техника дает инструкции по заполнению субретинальной инъекции хирургическую процедуру успешно, и обеспечение того, чтобы вектор генная терапия или стволовые клетки находятся в том месте, необходимо эффективное лечение офтальмологических заболеваний. Эта техника позволяет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Каталог	Комментарии
0.8-1.10 х 100 мм капиллярная трубка (стакан)	Кимбл Glass, Inc	34502 99
Flaming / коричневый микропипетки съемник	Саттер инструменты	P-97	Narishige microforge может быть использован вместо. Catalog # MF-900
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-25МЛ	Силиконовый
Фосфаты Dubecco в буферном растворе с хлорид кальция и хлорид магния	Gibco-Invitrogen	14040-133
Safety-Lok 3/4G 25 х 12 "; забор крови Set	BD Vacutainer	367298
1 мл Sub-Q 265/8G Slip-Tip Шприц	Becton-Dickinson	309597
0.5-10 мкл Finnpipette II Регулируемый том Pipetter	Fisherbrand	21-377-815
1-200 мкл природных Скошенные Советы	США Scientific, Inc	1111-1700
Discovery.V8 Стерео микроскоп	Zeiss	MC1500
60 мм х 15 мм Стиль Обработанные полистирола культуре клеток Dish	Corning Incorporated	430166
Vannas Прямо ножницы	Storz Ophthalmics	E3383 S
Изогнутые корнцанг с зубцами Нежные	Storz Ophthalmics	E1408
15 градусов Микрохирургия нож	Wilsна офтальмологическая корпорации	091204
Кетамин	Ketaset III	NADA # 45-290
Ксилазин	Lloyd лабораторий	NADA # 139-236
Бупивакаина (маркаина)	AstraZeneca	N / A
Бупренорфин	Sigma Aldrich	B9275