Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

Resumen

Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Resumen

La pérdida de visión afecta aproximadamente a 3,4 millones de personas en los Estados Unidos y se espera que aumente en los próximos años. ¹ Recientemente, la terapia génica y el trasplante de células madre se han convertido en importantes herramientas terapéuticas para el tratamiento de la ceguera como resultado de las enfermedades degenerativas de retina. Varias formas de trasplante autólogo para la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), como iris trasplante de células del epitelio pigmentario, han generado resultados alentadores, y los ensayos clínicos humanos han comenzado a otras formas de terapias con células madre y genes. ² Estos incluyen RPE65 sustitución de genes terapia en pacientes con amaurosis congénita de Leber y un trasplante de células RPE humanas usando madre embrionarias (ES) de células en la enfermedad de Stargardt. ^3-4 Ahora que hay vectores de terapia génica y células madre disponibles para el tratamiento de pacientes con enfermedades de la retina, es importante verificar estas terapias potenciales en modelos animales antes de aplicarIng. ellos en estudios con humanos. El ratón se ha convertido en un importante modelo científico para probar la eficacia terapéutica de los vectores de terapia génica y trasplante de células madre en el ojo. ^5-8 En este artículo de vídeo, se presenta una técnica para inyectar vectores de terapia génica o células madre en el espacio subretiniano de el ojo del ratón mientras que minimiza el daño al tejido circundante.

Protocolo

1. Montar dispositivos para la inyección subretiniana

1. Compre o haga una aguja de 100 m de diámetro de un tubo capilar de vidrio. Esto se puede hacer manualmente mediante el uso de un Sutter P-97 extractor de pipeta u otro equipo similar. El extremo del tubo capilar se calienta y se retiró hasta que alcanza el diámetro deseado (100 micras). Una aguja de diámetro más pequeño se puede utilizar para vectores de terapia génica, sin embargo, este es el diámetro recomendado para la inyección de células sin daño a las células o al ojo. En comparación con agujas de acero, la aguja capilar de vidrio tiene una punta muy fina, pero romo, para permitir la visualización de la inyección de fluido y el acceso al espacio subretiniano sin causar la rotura retiniana. Limpie estas agujas tiradas si es necesario el uso del 70% de etanol, y guárdelo en un recipiente estéril. A 15 cm estéril placa de cultivo de tejido con cinta adhesiva para sujetar las agujas en su lugar es una forma en que para mantener las agujas de inyección cubierto y en un ambiente estéril. En este punto, complete la puesta a punto dentro de la sala de operaciones donde el procedimiento se llevará a cabo. Es más fácil mantener todo el equipo en la sala quirúrgica en todo momento con el fin de que siga siendo estéril, sobre todo si este procedimiento se realiza dentro de una instalación de barrera.
2. Aspirar de silicona a la aguja de inyección y expulsar la silicona para dejar un revestimiento a lo largo de las paredes internas de la aguja. El revestimiento de silicona maximiza el paso de células y virus a través del orificio de agujas, que de otro modo se pegan a las paredes capilares de vidrio interiores.
3. Obtener una longitud de aproximadamente 8 cm de tubo de plástico estéril mediante la reducción de un 25 ¾ de calibre de recogida de sangre con luer-lock en el punto directamente después de la aguja (retirar la aguja de la tubería).
4. Llenar un 1 ml Sub-Q-26 5/8-gauge deslizamiento punta de la jeringa con solución salina estéril y retirar la aguja de la jeringa.
5. Coloque la aguja de inyección en el extremo cortado de la tubería de plástico y unir la jeringa al luer-lock en el otrofinal.
6. Aspirar solución salina estéril para llenar el espacio muerto de la aguja y el tubo capilar, expulsando algunos salina a través de la aguja para asegurarse de que esté correctamente colocado sin fugas. A continuación, se aspira una pequeña cantidad de aproximadamente 1 l de aire, en la punta de la aguja de inyección. Esto separa la solución salina desde el fluido de inyección y proporcionar una señal visual que indica el final de la inyección de fluido durante el procedimiento quirúrgico. El aparato de inyección debe mantenerse en una superficie limpia limpiados con etanol al 70% durante el procedimiento quirúrgico. Además, todo el equipo usado durante el procedimiento quirúrgico se debe limpiar antes y después con etanol al 70%, para la excepción de las agujas de inyección que ya debe mantenerse estéril y listo para su uso. Estas agujas deben desecharse después de la cirugía, y no volver a utilizarse.
7. Finalmente, aspirar solución inyectable que contiene el vector empaquetado deseado terapia génica viral o células madre. Esto se puede hacer portomando la solución de inyección en una punta de pipeta estéril, y después de pipeteado de la solución sobre la superficie de una placa de cultivo celular estéril. La solución puede ser fácilmente trasladada a la aguja de inyección con la jeringa. La cantidad necesaria variará dependiendo de la edad del ratón. Para nuestros propósitos utilizar post-natales día 5 ratones, que pueden ser inyectados con 0.5-0.8 l de fluido de inyección. Las cantidades más pequeñas, l 0,5 o menos, pueden ser utilizados para ratones más jóvenes y cantidades mayores, tales como 1 l, se puede utilizar para ratones adultos. El título viral o el número de células tiene que ser determinado con base en el virus / células se inyectan y el tejido objetivo deseado, como partículas virales de más o de células en un volumen pequeño puede conducir a la toxicidad para las células de la retina. En el vídeo, para propósitos de visualización, se han utilizado 1,5 l, una mayor cantidad de colorante que es necesario inyectar en el ojo.

2. Acceso al espacio subretiniano

1. Dentro de la sala quirúrgica estéril,estabilizar o anestesiar al ratón de acuerdo con el protocolo de manipulación de animales aprobado localmente, que varían según la edad del ratón. Anestesia común para ratones adultos incluye el uso de gas isoflurano o una inyección intra-peritoneal de 0,1 ml/10g peso corporal de ketamina (100 mg / ml) y xilazina (20 mg / ml) en solución salina estéril. Para los ratones perinatales, las técnicas comunes de anestesia incluyen el uso de gas isoflurano o crioanestesia (hipotermia). Todas las técnicas de anestesia debe ser aprobado por el comité local de IACUC antes de su uso. Por lo general el uso post-natal días (P) 5 ratones, aunque técnicas similares puede ser aplicada a los ratones tan jóvenes como P0 o ratones adultos. El procedimiento quirúrgico no puede comenzar hasta que el ratón ha dejado de mover las extremidades y ya no responde a los pies pellizcos. Para los ratones perinatales, se vuelven notablemente más ligero en color, ya que el flujo de sangre se ralentizará, otra de las claves para saber que están completamente bajo anestesia.
2. En ratones perinatales, use tijeras Vannas consecutivos para make un aproximado de 1,5 mm de incisión a lo largo de la fisura tapa cerrada. Tenga cuidado de cortar a la sangría, donde el ojo naturalmente se abrirá en el futuro. Esto asegura que las tapas se cura y abrir correctamente durante el desarrollo del ratón. Una cuchilla quirúrgica puede ser utilizado para este propósito, aunque preferimos tijeras de Vannas ya que reducen el riesgo de perforar el ojo durante este procedimiento. En el video, las tijeras se utilizan para pinchar directamente y corte a lo largo del borde del párpado. Cuando el aprendizaje de esta técnica, el fórceps se debe utilizar para levantar el párpado antes de cortar y reducir el riesgo de dañar el ojo.
3. Separar los párpados con pinzas curvas para vestirse proptose los ojos y apretar los párpados ligeramente por debajo del ojo para mantenerlo proptosed para inyección. Si la incisión tapa hecha en el paso dos es demasiado grande, el ojo se deslice de nuevo bajo las tapas y prevenir la exposición adecuada durante el procedimiento de inyección. Para los ratones adultos, aplicando una ligera presión alrededor de los ojos con el Dr.essing fórceps puede mantener el ojo proptosed para inyección.
4. Hacer una pequeña incisión escleral en o posterior al ecuador del globo por el rascado de la superficie con una cuchilla de microcirugía 15-grado. Esta incisión debe ser suficientemente grande para pasar la punta de la aguja de inyección, pero no más que eso. Si se prefiere, una aguja pequeña, afilado tal como una aguja de acupuntura se puede utilizar para hacer la incisión en el espacio subretiniano en lugar de la hoja de microcirugía. En los animales con pigmentación oscura, de color marrón oscuro-pigmentada tejido (la coroides-epitelio pigmentario retinal) se hará visible en el punto de incisión. En más ligeros ratones pigmentados o albino, un rotulador quirúrgico de marcado puede ser aplicado a la punta de la hoja de microcirugía para dejar una mancha de tinta que indica el lugar de la incisión. Si transparente (vítreo) reflujos de fluido desde el lugar de la incisión, la cuchilla se coloca demasiado profunda y entró en la cavidad vítrea y el virus terapéutico o células pueden entrar en el espacio durante la inyección intravítrea. Para visualizatien fin, hemos hecho la incisión hasta este punto en el video. Todavía es posible completar una inyección subretiniana en este caso, sin embargo, el desprendimiento de la retina causado por la presencia del fluido de inyección no puede curarse completamente en este ratón. Por lo tanto, se debe tener cuidado para cortar solamente la superficie exterior del ojo y no a través de la retina antes de la inyección.
5. Con cuidado, inserte la aguja en el sitio de la incisión y avanzar en paralelo a la pared externa del ojo para entrar en el espacio subretiniano. Avanzando demasiado cerca de la pared exterior o demasiado profundo dentro del ojo vaya a dirigir la inyección en el lugar equivocado. El mejor método para comprender si la aguja está en la ubicación correcta es practicar la técnica. Practicar en ratones ligeramente pigmentadas o albino puede ayudar a que las inyecciones precisas y exactas en el espacio subretiniano. Esto es porque el fluido de la aguja y la inyección es visible dentro de estos ojos.
6. Aplique una leve presión sobre el émbolo de la jeringa ygin inyección del fluido deseado. Si la aguja está colocada correctamente en el espacio subretiniano, la contrapresión moderado se sentía. Si la aguja está dentro del vítreo, habrá contrapresión significativamente menor y potencialmente algo de reflujo del fluido durante la inyección. Si hay contrapresión importante, mantenga la aguja en su lugar por lo menos durante otros 15 segundos antes de retirar la aguja lentamente. Esto permitirá que la alta presión intraocular para igualar en lugar de a reflujo el virus inyecta o células de nuevo fuera del sitio de la incisión. Parte del aire y la solución salina puede ser inyectado en el espacio subretiniano debido al aumento de la presión requerida durante el procedimiento de inyección. Se debe tener cuidado de no sobre-inyectar aire o solución salina, ya que puede eliminar el virus inyecta o células del ojo. También es posible hacer que el desprendimiento de retina permanente de la presencia de demasiado líquido inyectado en el espacio subretiniano. Para fines de visualización, el exceso de tinte y se inyectó aire into el espacio subretiniano en el vídeo. Se puede ver claramente cómo parte del tinte se enjuaga de nuevo fuera del espacio subretinal si se inyecta demasiado, sino también cómo la burbuja de aire permanece dentro del espacio subretinal y no desaparece en el vítreo. Esto se utiliza para enfatizar que estas inyecciones eran todos a la ubicación correcta de los ojos, así que uno puede visualizar cómo la aguja debe entrar en el sitio de la incisión. Todas las inyecciones en el espacio subretiniano causar un desprendimiento de retina temporal debido a la presencia del fluido de inyección. Si el procedimiento de inyección se ha completado correctamente, este desprendimiento de retina temporal se cura dentro de 24 horas y los ratones pueden ser utilizados para todos los experimentos posteriores. El ojo puede permanecer suave durante aproximadamente una semana debido a la intervención quirúrgica, por lo que una segunda inyección se deben evitar durante este período de tiempo.
7. Para los ratones recién nacidos, utilice las pinzas curvas aderezo para empujar suavemente el ojo detrás de los párpados y en la órbita. Puede ser útilesperar un minuto con el fin de permitir que el virus a establecerse dentro del espacio subretinal y no causar que sea purgada del sitio de la incisión cuando se presiona suavemente el ojo de vuelta a su órbita. Después de la cirugía, una gota de 0,5% de bupivacaína (marcaína) diluido al 0,25% en solución salina estéril con una aguja de calibre 25-puede ser colocado en el sitio de inyección. Los ratones no muestran signos evidentes de angustia después de la cirugía subretiniana y el uso de bupivacaína como un analgésico tópico de larga duración ha sido amplia en los últimos tres años. Ratones siempre deben ser controlados después del procedimiento quirúrgico para observar cualquier signo de peligro, tales como las infecciones, inflamación, o una disminución en las actividades cotidianas del ratón. Si esto ocurre, el veterinario debe ser notificado y otras medicaciones de dolor como la buprenorfina (0,05 mg / kg) puede administrarse como una inyección intraperitoneal.
8. Despierta el ratón de la anestesia local, según el protocolo aprobado manipulación de animales. El ratón se debe mantener en un p calefacciónanuncio para mantener la temperatura normal del cuerpo como se despierta de la anestesia. El procedimiento quirúrgico debe tomar menos de cinco minutos para completar, sin contar el tiempo para el ratón para someterse a la anestesia. Por lo tanto, una resistencia de calentamiento no es necesario durante el procedimiento en sí, pero puede ser necesaria mientras que uno está aprendiendo la técnica como el procedimiento podría tener una mayor duración de tiempo. El ratón no se debe volver a colocar en una jaula limpia hasta que ha comenzado a moverse por sí mismo. Para los recién nacidos, pellizcos suaves dedos le ayudará para que puedan recuperarse completamente de la anestesia, y deben recuperar su color rosado y el movimiento antes de ser colocado de nuevo con la madre. Los ratones deben ser controlados a través del tiempo en busca de signos de malestar como se indica anteriormente.

Resultados

Un dibujo del ojo del ratón se muestra con grandes estructuras marcadas para referencia, con flechas que muestran las ubicaciones de los procedimientos de inyección intravítrea tanto subretinal y quirúrgicos (puntas de flecha, Figura 1). Vectores de terapia génica, tales como el vector lentiviral lacZ (Figura 2), se puede inyectar el uso de estas ubicaciones. Además, las células madre, tales como células madre embrionarias de ratón (Figura 3), también...

Discusión

Esta técnica de vídeo proporciona instrucciones para completar el procedimiento de inyección subretiniana quirúrgica con éxito, y asegurar que el vector de terapia génica o de células madre se colocan en la posición necesaria para tratar eficazmente la enfermedad oftálmica. Esta técnica permite la focalización de las células de la retina tales como el RPE o fotorreceptores, puesto que coloca los vectores de terapia génica o tejidos derivados de células madre en la proximidad de estas células. Los métodos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Catálogo	Comentarios
0.8-1.10 x 100 mm Tubo capilar (vidrio)	Kimble Glass, Inc.	34502 99
Flaming / Brown Micropipeta Puller	Sutter Instrument	P-97	Narishige microforge se puede utilizar en su lugar. Catálogo # MF-900
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-25ML	Silicona
Fosfato de Dubecco salina tamponada con cloruro de calcio y cloruro de magnesio	Gibco-Invitrogen	14040-133
Safety-Lok 3/4G 25 x 12 ", set de muestras de sangre	BD Vacutainer	367298
1 ml Sub-Q 265/8G Slip-punta de la jeringa	Becton-Dickinson	309597
0.5-10 l Finnpipette II-Volumen ajustable pipeteador	Fisherbrand	21-377-815
1-200 mu l puntas biseladas Naturales	EE.UU. Scientific, Inc.	1111-1700
Discovery.V8 Microscopio estéreo	Zeiss	MC1500
60 mm x 15 mm Estilo de células tratadas placa de cultivo de poliestireno	Corning Incorporated	430166
Vannas rectas Tijeras	Storz Ophthalmics	E3383 S
Pinza Dressing curva con dientes delicados	Storz Ophthalmics	E1408
15 Grado Cuchillo Microcirugía	Wilsen Oftálmica Corp.	091204
La ketamina	Ketaset III	NADA # 45-290
Xilazina	Lloyd Laboratorios	NADA # 139-236
Bupivacaína (bupivacaína)	AstraZeneca	N / A
La buprenorfina	Sigma Aldrich	B9275