JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ال ذبابة الفاكهة شبكية العين هو الكريستال المشبك مثل تتألف من عدد صغير من أنواع الخلايا التي يتم إنشاؤها بطريقة نمطية 1. قابليته لالتحليل الجيني تطورا يسمح للدراسة البرامج التنموية المعقدة. يصف هذا البروتوكول تشريح والمناعية من شبكية العين في المراحل الثلاث المنفصلة التنموية، مع التركيز على التمايز مبصرة.

Abstract

العين ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا مجمع يتكون من نحو 750 ommatidia (عيون وحدة). ويتألف كل مقيلة من حوالي 20 الخلايا، بما في ذلك الخلايا المخروطية عدسة إفراز، الخلايا الصبغية، خلية الشعر الخشن وثمانية خلايا مستقبلة للضوء (PRS) R1-R8 2. استراتيجية الحد من الفقر لديها هياكل متخصصة microvillar، وrhabdomeres، والتي تحتوي على أصباغ حساسة للضوء، وRhodopsins (RHS). وrhabdomeres ستة المستفيدين الرئيسيين (R1-R6) تشكيل شبه منحرف وتحتوي على RH1 3 4. يتم وضع rhabdomeres من R7 R8 وجنبا إلى جنب في وسط شبه منحرف، وتقاسم نفس المسار للضوء. R7 R8 والمستفيدين الرئيسيين التعبير عن عشوائيا مجموعات مختلفة من RHS في نوعين الرئيسي 5: في النوع الفرعي 'ع'، ويقترن RH3 في R7s ف مع RH5 في R8s ف، في حين أنه في النمط الفرعي 'ذ'، ويرتبط RH4 في R7s Y مع RH6 في ذ R8s 6 7 8.

مواصفات الأولى من المستفيدين الرئيسيين وتطوير ommatidia يبدأ في القرص العين antennal اليرقات تخيلي، أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية. موجة من التمايز الاحتلالات عبر القرص 9 و يبدأ التجمع من خلايا غير متمايزة في ommatidia 10-11. ويتم تحديد R8 'خلية مؤسس' الأول وتجند R1-6 ثم R7 12-14. في وقت لاحق، خلال التنمية العذراء، PR التمايز يؤدي إلى تغيرات شكلية واسعة 15، بما في ذلك تشكيل rhabdomere، synaptogenesis والتعبير RH في نهاية المطاف.

في هذا البروتوكول، ونحن تصف أساليب تشريح الشبكية والمناعية في ثلاث فترات محددة من التنمية شبكية العين، والتي يمكن تطبيقها لمعالجة مجموعة متنوعة من المسائل المتعلقة بتشكيل الشبكية ومسارات التنمية. هنا، ونحن نستخدم هذه الأساليب لتصور التمايز التدريجي PR على مستوى وحيدة الخلية في جبل اليرقات كله، وشبكية العين midpupal الكبار (

Protocol

1. مقدمة

في هذا الفيديو، ونحن تصف أساليب تشريح الشبكية والمناعية في الفترات الثلاث التنموية المحددة: الطور اليرقي الثالث، midpupal ومرحلة الكبار. على الرغم من أن لدينا بروتوكول يعمل أيضا على مراحل أخرى العذراء (للاطلاع على تفاصيل المراحل السابقة، انظر 16)، اخترنا المرحلة midpupal، كما هو الأمثل لجميع المستفيدين الرئيسيين التصوير في طائرة واحدة والتنسيق النواة يمكن تمييزها بسهولة، مما يسهل تصور أنماط النسخ عامل التعبير. تشريح شبكية العين العذراء أواخر هي مشابهة جدا لتشريح شبكية العين الكبار.

أولا، نحن لشرح كيفية جمع اليرقات والعذارى في المراحل المطلوب. ثم، نشرح كيفية الحصول على تشريح الأمثل للاليرقات 17-18، وشبكية العين midpupal الكبار. ثانيا، نحن لشرح كيفية تصور PR التنمية في هذه المراحل باستخدام المجهر متحد البؤر والمناعية.

ق = "jove_title"> 2. التدريج وإعداد نموذج

فترة التنموية من الحشرات التي تعتمد على درجة الحرارة هو. لتسهيل انطلاق استنساخه من اليرقات والشرانق، نوصي رفع جميع المخزونات الطيران عند درجة حرارة 25 مئوية تحت لمدة 12 hr/12 دورة الضوء / الظلام ساعة.

الطور الثالث اليرقات: حول 96 ساعة وبعد وضع البيض (C ° في 25)، في وقت متأخر يرقات العمر 3 التغذية توقف والتجول على جدران القارورة الغذائية، حيث تخدر تصبح خادرة في نهاية المطاف. استخدام فرشاة ناعمة أو ملقط لإزالة بلطف يتجول يرقة الطور الثالث من جدار القارورة الغذاء.

ويلاحظ الشرانق 50٪ ('midpupae') حوالي 48 ساعة بعد التشرنق. التوقيت الدقيق ل، يمكنك وضع دائرة بيضاء فقط الشرانق التي شكلت مع علامة على القارورة الغذاء. بدلا من ذلك، نقل كافة الشرانق الأبيض إلى قارورة جديدة للحصول على قارورة من انطلاق موحدة (على التدريج من الشرانق باستخدام معايير شكلية، انظر 19). بعد 48 ساعة، REM بعنايةواوفه midpupae من القارورة باستخدام ملقط.

الذباب الكبار: تخدير الذباب الشباب البالغين (2-5 أيام بعد eclosion) على لوحة 2 CO. إزالة باستخدام ملقط رؤساء وتخزينها في وعاء زجاجي يحتوي على البارد جيدا 1X PBS.

3. إجراء تشريح (حوالي 1-2 ساعة في التجربة)

بعد جمع العينة، ووضعها في قطرة من PBS الباردة على طبق تشريح Sylgard. تشريح حوالي 10-15 شبكية العين في التركيب الوراثي.

يرجى الرجوع إلى المواد صحائف بيانات السلامة والصحة مؤسستكم للبيئة ومكتب السلامة للتعامل بشكل صحيح مع الكواشف والمعدات (انظر الجداول في نهاية هذا البروتوكول).

1. أقراص العين اليرقات تخيلي

  1. تحديد موقع نهاية الأمامي من اليرقة، التي تتضمن خطاطيف الفم. استخدام ملقط للضغط على الجزء الأوسط من يرقة بلطف ضد قاعدة الطبق Sylgard. استخدام عنوتإيه ملقط للاستيلاء على خطاطيف الفم وسحب بلطف وببطء بعيدا عن الجسم. تجاهل الجزء الرئيسي من الجسم واستخدام فمها أن يعقد الجزء الأمامي من أجل إزالة الأنسجة الدخيلة من الأقراص التي لا تزال تعلق تخيلي إلى الدماغ.
  2. نقل الدماغ مع أقراص تخيلي عن طريق الاستيلاء على خطاطيف الفم مع ملقط لPBS 1X في صحن الزجاج ثلاثة أيضا. تنفيذ الخطوة التثبيت (الخطوة 4.1.).
  3. بعد التثبيت، إزالة الغدد اللعابية والأنسجة الدهنية وسحب الدماغ بعيدا عن القرص العين antennal تخيلي. لتحسين إمكانية الحصول على الأجسام المضادة 'الصعب'، يمكن إزالة الغشاء peripodial، والذي يقع على سطح الظهارة، من خلال الضغط باستمرار على جزء من القرص antennal وتقشير الغشاء بعيدا مع دبوس تشريح. المقبل، نفذ المناعية (الخطوة 5.1.).

2. 50٪ التشرنق / Midpupal شبكية العين

  1. عقد نهاية الخلفي من حالة العذراء مع ملقط.إزالة بلطف السطح الأمامي للقضية عن طريق الاستيلاء العذراء إهاب مع آخر ملقط وسحب ببطء بعيدا عن puparium. قشر بعيدا بشرة المتبقية لفضح الرأس.
  2. استخدام ملقط النصائح 'لاختراق الأساسية، كيس لينة في المنطقة الأمامية الظهرية. هذا يوفر الوصول إلى الرأس. فصل الرأس بلطف من الصدر ويمتص ببطء في الرأس مع ماصة P20. طرد رئيس من طرف ماصة جديدة في 1X PBS الباردة وإزالة الأنسجة الزائدة؛ الاستيلاء على بشرة الرأس وإزالة خرطوم. انتقل إلى الخطوة التثبيت (الخطوة 4.1.).
  3. بيرس الفص البصري مع واحد دبوس تشريح إلى النسيج ثابتة. إدراج دبوس الأخرى تشريح بين الصفيحة والشبكية لفصل الشبكية من الصفيحة / الفص البصري. أداء المناعية (الخطوة 5.1.).

3. الكبار العيون

  1. الاستيلاء على مركز الكبسولة الخلفية مع رئيس ملقط وإزالة أجزاء الفم (خرطوم)، TISS الدهونرق والقصبات الهوائية.
  2. الاستيلاء على بشرة الرأس الظهرية واحد ملقط واستخدام أخرى لفصل العينين من أنسجة المخ عن طريق سحب بلطف جانبية. في معظم الحالات، تبقى متصلة الصفيحة، غمد رقيقة وشفافة من neuropil الدماغ، إلى شبكية العين. أنه من الأسهل لإزالة الصفيحة بعد التثبيت.
  3. إزالة إهاب على هامش العين، ولكن ترك قطعة صغيرة خلف لتسهيل نقل شبكية العين إلى حلول مختلفة. أداء التثبيت (الخطوة 4.1.).
  4. إزالة الصفيحة عن طريق الاستيلاء عليه في جانب واحد مع ملقط وسحب بلطف جانبية مع ملقط الأخرى دون المساس شبكية العين. إزالة إهاب المتبقية، لأنه يمكن أن أضعاف على شبكية العين أثناء التركيب. هاتين الخطوتين هي الحاسمة لتصور خلايا مستقبلة للضوء، والتي لولاها أن تحجب من قبل الصفيحة وبقايا بشرة أثناء عملية التصوير. انتقل إلى المناعية (الخطوة 5.1.).

4. تثبيت واشينانوغرام (حوالي 1 ساعة)

  1. تخزين شبكية العين في تشريح PBS 1X في طبق زجاج وضعت ثلاثة جيدا على الجليد في حين تستعد طازجة مثبت (40 microliters تخفيف من محلول الفورمالديهايد 37٪ مع 360 ميكرولتر من 1X PBS، دوامة ومتجر على الجليد). نوصي المضي قدما في تثبيت بروتوكول وتجنب أوقات طويلة على الجليد التخزين (> 15 دقيقة).
  2. استبدال 1X PBS مع 200 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد 3.7٪. تأكد من النسيج المغمور في مثبت. هذا أمر بالغ الأهمية، وإلا فإنه قد لا تكون ثابتة بشكل صحيح. إذا لزم الأمر، وإزالة فقاعات الهواء والقصبات الهوائية مع ملقط.
  3. احتضان شاكر على لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. استبدال مثبت مع 1X PBS وشطف مرتين مع PBS 1X. تواصل الغسيل في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة (على شاكر، في درجة حرارة الغرفة).
  5. استبدال PBS مع PBST. شطف مرتين مع PBST.
  6. المضي قدما في إزالة الغشاء peripodial من الأقراص العين اليرقات (3.1.3.) وlaminas من midpupal / الكبار شبكية العين (3.2.3.، 3.3.4).

5. المناعية

  1. حظر: استبدال PBS مع 200 ميكرولتر من الدم العادي 5٪ في شبكية العين وPBST احتضان لمدة 20 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  2. استبدال الحل مع حظر حل الأجسام المضادة الأولية. ختم طبق بشكل جيد مع ثلاثة parafilm واحتضان بين عشية وضحاها على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  3. استبدال الحل مع PBST وشطف 3 مرات. تواصل مع الغسيل PBST مدة لا تقل عن 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  4. نقل الأجسام المضادة الثانوية في حل واحتضان في صحن الزجاج parafilm مختومة جيدا على شاكر بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  5. استبدال الحل مع الأجسام المضادة PBST وشطف ثلاث مرات. تواصل مع الغسيل PBST لمدة لا تقل عن ساعة واحدة شاكر في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن تظل العينات في PBST لعدة أيام، ولكن من الأهمية بمكان إضافة PBST جديدة على الأقل مرة واحدة يوميا لمنعهم من الجفاف.

6. Mounting

  1. لتركيب شبكية العين اليرقات وmidpupal، استخدم P20 لنقل شبكية العين إلى وسط شريحة زجاجية نظيفة. إزالة PBST الزائدة. استخدام ملقط لمحاذاة شبكية العين من أجل تسهيل التصوير.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على رأس شبكية العين. تغطيتها بلطف مع زلة-1 24x40 الغطاء وختم مع طلاء الأظافر واضحة.
  3. لشبكية العين الكبار تصاعد مستمر، وإعداد 'الجسور' 20: إضافة قطرات اثنين من 5 ميكرولتر من الجلسرين 50٪ على طرفي جانب الزجاج وغطاء لهم مع تغطية زلات 22x22-1 (0،13 حتي 0،17 مم).
  4. إزالة PBST مع ماصة P20؛ تأكد من أن شبكية العين لا تجف. إضافة 20 ميكرولتر من تصاعد المتوسط ​​إلى البئر. استخدام المتوسطة المتزايدة لنقل شبكية العين مع P20 إلى الشريحة 'جسر' الزجاج.
  5. استخدام ملقط لتوجيه (العدسات يجب أن تواجه شريحة زجاجية) ومحاذاة شبكية العين من أجل تسهيل التصوير. إذا لزم الأمر، وإزالة فقاعات الهواء مع P20.
  6. ببطءزلة مكان 24x40-1 الغطاء (0،13 حتي 0،17 مم) من جانب واحد على رأس وختم حواف مع طلاء الأظافر واضحة أو لاصق شفاف. عينات المحل في 4 درجات مئوية في مربع الشريحة التوقف المجهر (نضع في الظلام).

7. ممثل النتائج

كمثال لتطبيق هذا البروتوكول، وتبين لنا نتائج ممثلة لتصور التمايز مبصرة في المراحل الثلاث التنموية في الفيديو. كانت ملطخة A اليرقات العين antennal القرص وشبكية العين مع الأجسام المضادة التي midpupal تسمية أنواع مختلفة مبصرة خلال تنميتها (الشكل 1A، B) وكانت ملطخة شبكية الكبار مع الأجسام المضادة رهودوبسن سنتين إلى تصور أنواع فرعية مبصرة اثنين (الشكل 1C).

Discussion

1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها

في تجربتنا، تتطلب تشريح الممارسة (تصل إلى عدة أسابيع) ويسر من خلال تحقيق موقف اليد مريحة القرن 21 يستريح المرفقين والساعدين على الطاولة ومع الأصابع إجراء اتصالات مع طبق تشريح. وبهذه الطريقة، الابها?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل الزمالة ايرمان لHY. H.، تابوت جين الصندوق التذكاري لزمالة تشايلدز البحوث الطبية ما بعد الدكتوراه لRJJ، NIH منح F32EY016309 إلى DV، زمالة جامعة ولاية نيويورك العميد أطروحة لDJ، NIH GrantR01 EY13010 إلى CD وزمالة DFG إلى JR (RI 2208/1- 1). نشكر نينا فوغت وBoodram باميلا للتعليقات على المخطوط.

Materials

كاشف
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS1x، ودرجة الحموضة 7.4) سيجما إعداد محلول المخزون 10X 20. تمييع مع الماء المقطر للحصول على 1X PBS وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تبرد على الجليد قبل تشريح.
تريتون-X 100 سيجما 9002-93-1 تنبيه:! مهيجة ارتداء قفازات. تجهيز 50 مل 1xPBS مع 0.3٪ تريتون X-100 (PBST). تخزين في درجة حرارة الغرفة.
37٪ الفورمالديهايد الحل فيشر العلمية F75P1GAL تنبيه:!، من المحتمل السامة مسرطن بشري ارتداء القفازات. قبل التثبيت الخطوة، إعداد طازجة حل 3.7٪ في غطاء الدخان الكيميائي عن طريق تمييع مع PBS، متجر على الجليد.
5٪ مصل الحصان العادي جاكسون المناعي بحوث 008-000-001 إعداد 5٪ V / V في التخفيف PBST. تخزين في أربع درجات.
الأجسام المضادة الأولية والثانوية (مثل حمار مكافحة الأغنام اليكسا فلور 488، حمار مكافحة الأرانب اليكسا فلور 555، المضادة للحمار الماوس اليكسا فلور 647) مجسات إينفيتروجن الجزيئي A11015
A31572
A31571 		تخفيف الأجسام المضادة الثانوية 1:800 في PBST وتخزينها في أربع درجات.
الكسا فلور 488 Phalloidin A12379 تمييع 1:100 في حل الضد الثانوية.
كاشف الذهب Slowfade Antifade مجسات إينفيتروجن الجزيئي S36936 تصاعد المتوسط. تخزين في -20 درجة.
Glyceرول فيشر العلمية G31-1 للتركيب. إعداد 10 مل من 50٪ مع تخفيف المقطر متجر، والمياه في درجة حرارة الغرفة.
CO 2 لتخدير الذباب الكبار.
معدات
اثنين ملقط حاد (دومون # 55) أدوات العلوم الجميلة 11255-20
Sylgard إلاستومر سيليكون 184 كيت داو كورنينج إعداد طبق تشريح Sylgard عن طريق ملء طبق بتري البلاستيكية التي تحتوي على خليط Sylgard.
ثلاثة أطباق الزجاج جيدا تشريح فيشر العلمية 21-379
TWس دبابيس تشريح minutien (0.1 مم) واثنين من pinholders (12 سم) أدوات العلوم الجميلة 26002-10 إدراج أحد minutien دبوس في كل من البلدين وpinholders ثني واحدة من دبابيس لتشكيل هوك.
تغطية زلات المجهر (22x22 24x40 و-1-1) فيشر العلمية 12-542A
الشرائح المجهر (25x75x1.0 مم؛ precleaned) فيشر العلمية 12-550-143
1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج
مسح طلاء الأظافر أو لاصق شفاف
شاكر المداري Bellco
الشريحة حامل مربع فيشر العلمية
Parafilm بيميس PM996
رقيقة الرسام
وP20 P200 micropipettes ونصائح
تشريح المجهر
دلو الثلج الصغيرة مع لتبريد ألواح الزجاج جيدا، تشريح شبكية العين والحلول.

References

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
  2. Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
  3. O'Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
  4. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
  5. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  6. Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
  7. Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
  8. Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
  9. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
  10. Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
  11. Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
  12. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
  13. Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
  14. Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
  15. Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
  16. Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
  17. Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
  18. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
  21. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
  22. Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
  23. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  24. Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
  25. Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
  26. Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
  27. Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
  28. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

69

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved