Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Сетчатки

Резюме

Drosophila Сетчатка представляет собой кристалл типа решетки состоят из небольшого числа типов клеток, которые образуются в стереотипно ¹. Его ответственность в сложный генетический анализ позволяет изучать сложные программы развития. Этот протокол описывает вскрытия и иммуногистохимии сетчатки на три отдельных стадий развития, с акцентом на фоторецептор дифференциации.

Аннотация

Соединение глаз дрозофилы состоит из около 750 омматидиев (блок глаз). Каждый ommatidium состоит из около 20 клеток, в том числе объектив-секретирующих клеток конуса, пигментные клетки, клетки щетины и восемь фоторецепторов (ОР) R1-R8 ^2. ОР имеют специализированные структуры микровиллярные, рабдомерами, которые содержат светочувствительные пигменты, родопсины (РИТ). Рабдомерами шесть ОР (R1-R6) образуют трапецию и содержат Rh1 ^{3 4.} Рабдомерами из R7 и R8 расположены в тандеме в центре трапеции и один и тот же путь света. R7 и R8 ОР стохастически выражают различные комбинации РИТ в двух основных подтипов ^5: В подтипа 'P', Rh3 в р R7s сочетается с Rh5 в р R8s, в то время как подтип 'у', у Rh4 в R7s связано с В Rh6 у R8s ^{6 7 8.}

Ранние спецификации ОР и развития омматидиев начинается в личиночной глаз усиков имагинальных дисков, монослой эпителиальных клеток. Волна дифференциация проводится над всей поверхностью диска ⁹ и инициирует собрание недифференцированных клеток в омматидиев ^10-11. R8 'основатель ячейки указан первым и принимает на работу R1-6, а затем R7 ^12-14. Впоследствии, во время развития куколки, PR дифференциация приводит к обширным морфологические изменения ^15, в том числе рабдомера образования, синаптогенез и в конечном итоге относительная влажность выражение.

В этом протоколе описываются методы вскрытия сетчатки и иммуногистохимии на трех определенные периоды развития сетчатки, которые могут быть применены для решения различных вопросов, касающихся сетчатки формирования и пути развития. Здесь мы используем эти методы для визуализации ступенчатой ​​дифференциации PR в одной клеточном уровне в целом крепление личиночной, midpupal и взрослых сетчатки (

протокол

1. Введение

В этом видео мы опишем методы вскрытия сетчатки и иммуногистохимии на трех определенных периодов развития: третьего возраста личиночной, midpupal и взрослой стадии. Хотя наш протокол работает и в других куколки (подробности на ранних стадиях, см. ^16), мы выбрали midpupal этапе, так как он является оптимальным для визуализации всех ОР в одной фокальной плоскости и их ядер легко идентифицировать, что облегчает визуализацию транскрипционных факторов шаблоны выражения. Рассечения конце куколки сетчатки очень похож на вскрытии взрослого сетчатки.

Во-первых, мы показали, как собирать личинки и куколки в нужной стадии. Тогда мы объясним, как для получения оптимального вскрытия личинок ^17-18, midpupal и взрослых сетчатки. Во-вторых, мы показали, как визуализировать PR развития на этих этапах использование иммуногистохимии и конфокальной микроскопии.

2. Постановка и подготовка образцов

Период развития насекомых зависит от температуры. Для облегчения воспроизводимых постановки личинок и куколок, мы рекомендуем повышения лету все запасы при 25 ° C при 12 часа hr/12 цикле свет / темнота.

Третий возраста личинок: Около 96 часов после откладки яиц (при 25 ° C), в конце третий возраст остановки подачи и бродить по стенам питание флакона, где они в конечном итоге окукливаются. Используйте мягкую щетку или пинцетом аккуратно удалить блуждающих третьего возраста личинка от стены пищевой флаконе.

50% куколок («midpupae) наблюдается около 48 ч после окукливания. Для точного времени, вы можете просто круг сформирован белые куколки с маркером на продовольствие флаконе. Кроме того, переместить все белые куколки в новый флакон для получения флакона равномерно постановка (для постановки куколок с использованием морфологических критериев, см. ^19). После 48 часов, тщательно бэрОве midpupae из флакона помощью пинцета.

Взрослые мухи: Anesthetize молодых взрослых мух (2-5 дней после вылупления) на CO ₂ площадки. Удалить глав помощью щипцов и хранить их в стеклянных и блюдо с холодным 1x PBS.

3. Препарирование процедуры (около 1-2 часов в эксперименте)

После сбора образца, поместите их в капли холодного PBS на блюдо рассечение Sylgard. Проанализируйте около 10-15 сетчатки в генотипе.

Пожалуйста, ознакомьтесь с данными по безопасности материалов, а также окружающей среды и здоровья вашей организации и безопасности Управления надлежащего обращения с реактивами и оборудованием (см. таблицу в конце этого протокола).

1. Личинок глаз имагинальных дисков

1. Найдите передний конец личинки, которая содержит рот крючки. Используйте пинцет, чтобы нажать на среднюю часть личинки мягко к основанию блюдо Sylgard. Используйте anothэ щипцы, чтобы захватить устье крючки и тянуть мягко и медленно от тела. Откажитесь от основной частью тела и использовать ротовые держать переднюю часть, чтобы удалить посторонние ткани из имагинальных дисков, которые остаются прикрепленными к мозгу.
2. Передача мозга с имагинальных дисков, захватывая рот крючки с пинцетом 1x PBS в трех-и стеклянную посуду. Выполните фиксации шага (шаг 4.1.).
3. После фиксации, удалить слюнные железы, жировую ткань и вытащить мозг от глаз усиков имагинальных дисков. Для повышения доступности «трудных» антител, peripodial мембрана, которая находится на поверхности эпителия, могут быть удалены, удерживая усиков части диска и шелушение мембраны покончить с рассекает PIN-код. Далее выполните иммуногистохимии (шаг 5.1.).

2. 50% Окукливание / Midpupal Сетчатки

1. Держите заднем конце куколки случае с пинцета.Аккуратно снимите переднюю поверхность куколки случае, захватывая кутикулы с другой щипцы и медленно оторваться от пупария. Очистите от остаточной кутикулу, чтобы выставить голову.
2. Используйте советы щипцы "пробить основной, мягкий мешок в спинной передней части. Это обеспечивает доступ к голове. Аккуратно отделить голову от грудной клетки медленно сосать до головы с помощью пипетки P20. Выгнать головы от кончика пипетки в свежей холодной 1x PBS и удалить лишнюю ткань, возьмите голову кутикулу и удалите хоботок. Приступить к фиксации шага (шаг 4.1.).
3. Пирс оптической доле с одной рассекает булавку, чтобы стабилизировать ткани. Вставьте другой рассекает контактных между пластинкой и сетчатки отделить сетчатку от пластинки / оптический доли. Выполните иммуногистохимии (шаг 5.1.).

3. Взрослый Глаза

1. Возьмите центре задней капсулы голову щипцами и удалить рот частей (хоботок), жиры Tissие и трахеи.
2. Возьмите спинного кутикулы голову с одним пинцетом и использовать другие отделить глаза от ткани мозга, осторожно потянув в сторону. В большинстве случаев, пластинки, тонкую и прозрачную оболочку головного мозга нейропиля, будет оставаться прикреплены к сетчатке. Это легче удалить пластинки после фиксации.
3. Удалите кутикулу на глаз маржи, но оставить небольшой кусочек позади, чтобы облегчить передачу сетчатку различных решений. Выполните фиксации (шаг 4.1.).
4. Снимите пластинки, захватывая его в одну сторону с пинцетом и осторожно потянув бок с другими щипцами без ущерба для сетчатки. Удалите остатки кутикулы, как это могло сбросить на сетчатку во время монтажа. Эти два шага являются критическими для визуализации фоторецепторов, которые иначе были бы скрыты от пластинки и остатки кутикулы во время визуализации процесса. Приступить к иммуногистохимии (шаг 5.1.).

4. Фиксация и WashiNG (около 1 часа)

1. Хранить разрезанный сетчатки в 1x PBS в трех-и стеклянную посуду помещают на лед в то время как недавно подготовки фиксатора (разбавленной 40 мкл 37% раствора формальдегида с 360 мкл 1x PBS, вихрь и магазин на льду). Мы рекомендуем приступить к фиксации протокол и, чтобы избежать длительных сроков хранения на льду (> 15 мин).
2. Заменить 1x PBS 200 мкл 3,7% раствора формальдегида. Убедитесь, что ткань погружают в фиксатор. Это очень важно, так как в противном случае может не быть закреплены должным образом. При необходимости удалить пузырьки воздуха и трахеи с помощью пинцета.
3. Инкубируйте на шейкере в течение 15 мин при комнатной температуре.
4. Замените фиксатором с 1x PBS и промыть дважды 1x PBS. Продолжите мытье в PBS в течение 30 мин (на шейкере при комнатной температуре).
5. Заменить PBS с PBST. Промыть два раза PBST.
6. Далее с удалением peripodial мембраны от личиночной дисков глаз (3.1.3.), А также пластин из midpupal / взрослый сетчатки (3.2.3., 3.3.4.).

5. Иммуногистохимия

1. Блокировка: Заменить PBS 200 мкл 5% нормальной сыворотки в PBST и инкубировать сетчатки в течение 20 минут на шейкере при комнатной температуре.
2. Заменить блокирующий раствор с первичным решением антител. Печать на три и блюдо с парафином и инкубировать в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.
3. Заменить решение с PBST и промыть 3 раза. Продолжить промывание PBST в течение как минимум 1 час на шейкере при комнатной температуре.
4. Трансфер в средней решение антитела и инкубировать в парафильмом уплотнением стекла и блюда на шейкере в течение ночи при комнатной температуре.
5. Заменить раствор антител с PBST и промыть три раза. Продолжить промывание PBST в течение как минимум одного часа на шейкере при комнатной температуре. Пробы могут храниться в PBST в течение нескольких дней, но это критическое, чтобы добавить свежую PBST по крайней мере, один раз в день, чтобы предотвратить их от высыхания.

6. Mounting

1. Для монтажа личинок и midpupal сетчатки, используйте P20 для передачи сетчатки в центре чистое предметное стекло. Удалите излишки PBST. Используйте щипцы для выравнивания сетчатки в целях облегчения изображения.
2. Добавить 10 мкл монтаж среды на верхней части сетчатки. Покройте их осторожно 24x40-1 покровным стеклом и печать с прозрачного лака для ногтей.
3. Для монтажа взрослой сетчатке, подготовить 'мосты' ^20: Добавьте две капли 5 мкл 50% глицерина на обоих концах боковые стекла и покрыть их 22x22-1 покровные стекла (0,13 до 0,17 мм).
4. Снимите PBST с помощью пипетки P20, убедитесь, что сетчатка не высыхают. Добавить 20 мкл монтажа средних и хорошо. Используйте монтажную среду для передачи сетчатки с P20 на «мост» стекло.
5. Используйте пинцет, чтобы ориентировать (линзы должны быть обращены к стеклу) и совместите сетчатки в целях облегчения изображения. При необходимости удаления пузырьков воздуха с P20.
6. МедленноМесто 24x40-1 покровного стекла (0,13 до 0,17 мм) с одной стороны на верхней и уплотнения края прозрачным лаком для ногтей или скотч. Магазин образцов при температуре 4 ° C в микроскоп окно слайд заставки (имейте в темноте).

7. Представитель Результаты

В качестве примера применения этого протокола, мы показываем представитель результатов для визуализации фоторецепторов дифференциации на трех стадиях развития в видео. Личиночные глаза усиков диска и midpupal сетчатки окрашивали антителами, которые обозначения различных типов фоторецепторов в процессе их развития (рис. 1а, б) и взрослых сетчатки окрашивали антителами с двумя Родопсин визуализировать два фоторецептора подтипы (рис. 1С).

Обсуждение

1. Поиск и устранение неисправностей

По нашему опыту, требующие вскрытия практике (до нескольких недель) и способствует достижению удобное положение рук ^21, отдыхая локтями и предплечьями на стол и с помощью пальцев контакта с рассечение блюдо. Таким образом, только п...

Материалы

			Реагент
Фосфат-солевой буфер (PBS1x, рН 7,4)	Сигма		Подготовка 10x раствора 20. Развести дистиллированной водой до получения 1x PBS и хранить при комнатной температуре. Охладить на льду до вскрытия.
Triton-X 100	Сигма	9002-93-1	Внимание: Раздражает перчатках. Подготовка 50 мл 1xPBS с 0,3% Тритон Х-100 (PBST). Хранить при комнатной температуре.
37% раствор формальдегида	Fisher Scientific	F75P1GAL	Осторожно: ядовитый, вероятно канцерогенных для человека перчатках. Перед фиксацией шаг, только подготовиться 3,7% раствора в химическом вытяжном шкафу путем разбавления PBS, магазин на льду.
5% нормальной лошадиной сыворотки	Джексон Иммуно исследований	008-000-001	Подготовить 5% объем / объем разведения в PBST. Хранить в четыре градуса.
Первичные и вторичные антитела (например Donkey анти-овцы Alexa Fluor 488, Осел-анти кролика Alexa Fluor 555, Осел анти-мышиных Alexa Fluor 647)	Invitrogen молекулярных зондов	A11015 A31572 A31571	Развести вторичные антитела 1:800 в PBST и хранить при четырех градусов.
Alexa Fluor 488 фаллоидином		A12379	Развести 1:100 в средней решение антитела.
Slowfade Золотой Antifade реагентов	Invitrogen молекулярных зондов	S36936	Монтаж среды. Хранить при температуре -20 градусов.
GlyceРОЛ	Fisher Scientific	G31-1	Для монтажа. Подготовка 10 мл 50% раствора в дистиллированной воде, хранить при комнатной температуре.
CO 2			Для обезболивающее взрослых мух.
			Оборудование
Два резких щипцы (Дюмон # 55)	Средства изобразительных наук	11255-20
Sylgard 184 Силиконовый эластомер Kit	Dow Corning		Подготовка Sylgard рассечение блюдо, заполняя пластиковые чашки Петри со смесью Sylgard.
Трех-и блюд стекло рассечение	Fisher Scientific	21-379
Twо minutien рассекает контактами (0,1 мм в диаметре) и два pinholders (12 см)	Изобразительных инструментов науки	26002-10	Вставьте один minutien штифт в каждом из двух pinholders и согните один из контактов, чтобы сформировать крючком.
Микроскоп покровные стекла (22x22-1 и 24x40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Микроскопа (25x75x1.0 мм, предварительно очищенные)	Fisher Scientific	12-550-143
Пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных
Снимите лак для ногтей или скотч
Орбитальный шейкер	Bellco
Коробка держателя слайдов	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
Тонкая кисть
P20 и P200 микропипетки и советы
Препаровальная лупа
Малый ведерко со льдом			Для охлаждения стекла и плиты, расчлененные сетчатки и решений.