애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

요약

Drosophila 망막은 틀에 박힌 방식으로 생성 된 세포 유형의 소수로 구성된 크리스탈과 같은 격자입니다 ¹. 정교한 유전자 분석에의 복종 할 의무는 복잡한 개발 프로그램의 연구를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoreceptor 차별화를 중심으로 세 이산 발달 단계에서 dissections와 망막의 immunohistochemistry에 대해 설명합니다.

초록

Drosophila melanogaster의 화합물 눈은 약 750 ommatidia (단위 눈)으로 구성되어 있습니다. 각 ommatidium는 렌즈 분비 콘 세포, 안료 세포, 억센 털 셀 및 8 photoreceptors (푸에르토 리코 놈들) ^R1-R8이 포함 약 20 세포로 구성되어 있습니다. 푸에르토 리코 놈들은 빛에 민감한 안료, Rhodopsins을 (RHS)를 포함 전문 microvillar 구조, rhabdomeres을 수 있습니다. 여섯 푸에르토 리코 놈들의 rhabdomeres (R1-R6)는 사다리꼴을 형성하고 Rh1 ^{3 4이} 포함되어 있습니다. R7 및 R8의 rhabdomeres는 사다리꼴의 중심에 직렬로 위치와 빛의 동일한 경로를 공유 할 수 있습니다. R7 및 R8 푸에르토 리코 놈들은 stochastically 두 가지 하위 유형 ⁵ RHS의 다른 조합을 표현 : 'P'하위 유형에서, P R7s의 Rh3는 P R8s에 Rh5와 결합되어, 'Y'하위 유형에 Y R7s의 Rh4이 연관된 반면, Y의 Rh6는 ^{6 7 8} R8s.

푸에르토 리코 놈들과 ommatidia 개발의 초기 사양은 애벌레의 눈 antennal imaginal 디스크, 상피 세포의 monolayer에서 시작됩니다. 차별화의 파도가 디스크 ^9에서 쓸어과 ommatidia ^10-11로 undifferentiated 세포의 조립을 시작합니다. '설립자 셀'R8 먼저 지정하고 R7 ^12-14 R1-6 그리고 모집합니다.합니다 그 후, pupal 개발하는 동안, 홍보 차별화 rhabdomere 형성, synaptogenesis 결국 RH 표현을 포함한 다양한 형태학의 변화 ^15로 연결됩니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 망막 형성과 발달 경로에 관한 질문의 다양한 해결하기 위해 적용 할 수있는 망막 개발의 세 정의 된 기간에서 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 여기, 우리는 전체 마운트 애벌레의, midpupal 및 성인 망막 (의 단일 셀 레벨에서 stepwise PR 차별화를 시각적으로 이러한 방법을 사용

프로토콜

1. 소개

세 번째 instar 애벌레의, midpupal과 성인 무대 :이 동영상에서는, 우리는 세 가지 정의 개발 기간의 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 우리 프로토콜 다른 pupal 단계 (초기 단계에 대한 자세한 내용은, ^{16 참조)를} 위해 일이지만 하나의 초점 평면과 핵의 모든 푸에르토 리코 놈들이의 시각화을 용이하게하는, 쉽게 식별 할 수있는 이미지에 적합하므로, 우리는 midpupal 단계를 선택 전사 인자의 발현 패턴. 후반 pupal 망막의 해부는 성인 망막의 해부와 매우 유사합니다.

첫째, 우리는 원하는 단계에서 유충과 pupae를 수집하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음, 우리는 애벌레의 ^17-18, midpupal 및 성인 망막의 최적 dissections를 얻는 방법에 대해 설명합니다. 둘째, 우리는 immunohistochemistry와 공 촛점 현미경을 사용하여 이러한 단계에서 PR 개발을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

2. 스테이징과 표본의 작성

곤충의 발달 기간은 온도에 따라 달라지게된다. 애벌레와 pupae의 재현 준비를 촉진하기 위해, 우리는 12 hr/12 시간의 빛 / 어둠의주기에 따라 25의 모든 비행 주식 ° C를 양육하는 것이 좋습니다.

공급 instar의 애벌레 : 96에 대해 알 부설 후 시간 (25 ° C에서), 늦은 셋째 instar의 애벌레 정류장 먹이하고 결국 번데기가되다 식품 유리 병의 벽에 산책. 부드럽게 식품 유리 병의 벽에서 방황 제 instar 애벌레를 제거하는 부드러운 브러쉬 나 집게를 사용하십시오.

50 % pupae ( 'midpupae'는) pupation 후 48 시간을 관찰합니다. 정확한 타이밍를 들어, 음식 유리 병에 마커로 그냥 형성된 흰색 pupae를 동그라미 수 있습니다. 또한, 균일 한 준비의 병을 (형태학의 기준을 사용하여 pupae의 준비를 위해, ^{19 참조)} 얻기 위해 새로운 유리 병에 모든 흰색 pupae 이동합니다. 후 48 시간 신중하게 수치집게를 사용하여 유리 병에서 midpupae을 ove.

성인 파리 : CO ₂ 패드에 마취 젊은 성인 파리 (2~5일 eclosion 이후). 집게를 사용하여 헤드를 제거하고 유리에 보관이 잘 차가운 1X PBS를 포함하는 요리.

3. 분해 절차 (실험 1-2에 대해 시간)

표본을 수집 한 후, Sylgard의 분해 요리에 차가운 PBS의 드롭에 배치합니다. 유전자형 당 10-15 망막에 대한 해부.

시약 및 장비의 적절한 처리에 대한 물질 안전 데이터 시트뿐만 아니라 교육 기관의 환경 보건 및 안전 사무소 (이 프로토콜의 끝에 테이블을 참조) 참조하십시오.

1. 애벌레의 눈 Imaginal 디스크

1. 입 후크를 포함하는 유충의 앞쪽 끝을 찾습니다. Sylgard 요리의 기본에 대해 부드럽게 유충의 가운데 부분을 눌러 집게를 사용하십시오. anoth를 사용하여응급실은 입 후크를 움켜 잡고 몸에서 부드럽게하고 서서히 끌어 포셉. 신체의 주요 부분을 취소하고 뇌에 첨부 된 상태로 유지 imaginal 디스크에서 필요없는 조직을 제거하기 위해 앞 부분을 보유하는 mouthparts을 사용합니다.
2. 3 잘 유리 접시에 1X PBS에 집게로 입 갈고리를 잡아서 imaginal 디스크로 뇌를 전송합니다. 고정 단계 (단계 4.1). 수행합니다.
3. 고정 후, 지방 조직을 침샘을 제거하고 눈 antennal imaginal 디스크에서 떨어져 뇌를 당긴다. '어려운'항체의 접근성을 개선하기 위해 상피의 표면에있는 peripodial 막은, 디스크의 antennal 부분을 누른 상태 해부 핀을 멀리 멤브레인을 필링으로 제거 할 수 있습니다. 다음으로, immunohistochemistry (단계 5.1). 수행합니다.

2. 50 % Pupation / Midpupal 망막

1. 집게와 pupal 가지 경우 뒤쪽 끝을 잡아.부드럽게 다른 집게로 큐티클을 잡아서 pupal 사건의 앞쪽 표면을 제거하고 천천히 번데기에서 떨어져 당긴다. 물러 머리를 노출하는 잔류 큐티클.
2. 피어스 등쪽의 앞 지역의 기본, 부드러운 자루에 포셉 '팁을 사용하십시오. 이 머리에 액세스 할 수 있습니다. 부드럽게 천천히 P20의 피펫으로 머리를 빨아하여 가슴에서 머리를 분리. 신선한 차가운 1X PBS에 피펫 팁의 머리를 추방하고 초과 조직을 제거하고, 머리 표피를 잡아 코를 제거합니다. 고정 단계 (단계 4.1.)로 진행합니다.
3. 안정된 조직 한 해부 핀 피어스는 광 엽. 얇은 판과 얇은 판 / 광 엽에서 망막을 분리하기 위해 망막 사이에 다른 해부 핀을 삽입합니다. immunohistochemistry (단계 5.1). 수행합니다.

3. 성인 눈

1. 집게와 함께 뒤쪽 머리 캡슐의 중심을 잡고 입 부품 (코), 지​​방 tiss를 제거UE와 tracheae.
2. 한 집게로 등쪽의 머리 표피를 잡고 부드럽게 옆으로 당겨 뇌 조직에서 눈을 분리하는 다른을 사용합니다. 대부분의 경우, 얇은 판, 뇌 neuropil의 얇고 투명한 피복은 망막에 부착 남아있을 것입니다. 그것은 고정 후 얇은 판을 제거하는 것이 더 쉽습니다.
3. 눈 여백에 큐티클을 제거하지만, 다른 솔루션에 망막의 전송을 촉진하기 위하여 뒤에 작은 조각을 두십시오. (단계 4.1.) 고정을 수행합니다.
4. 집게로 한쪽에서를 쥐어 조심스럽게 망막을 혼란하게 다른 집게로 옆으로 당겨 얇은 판을 제거합니다. 가 장착되는 동안 망막에 접어 될 수 있으므로 잔류 큐티클을 제거합니다. 이 두 단계는 달리 얇은 판으로 덮여 있으며 이미징 과정에서 표피의 유적 될 photoreceptors을 시각화 중요하다. immunohistochemistry (단계 5.1.)로 진행합니다.

4. 고정 및 와시NG (약 1 시간)

1. 갓 (1X PBS, 얼음에 소용돌이 및 매장 360 μl 37 %의 포름 알데히드 용액의 40 microliters을 희석) 정착액을 준비하는 동안 얼음에 위치 3 잘 유리 접시에 1X PBS에서 해부하는 망막를 저장합니다. 우리는 고정 프로토콜을 진행하고 얼음 (> 15 분)에 긴 저장 시간을 방지하는 것이 좋습니다.
2. 3.7 %의 포름 알데히드 용액 200 μl와 1X PBS를 교체하십시오. 조직 정착액에 잠겨되어 있는지 확인하십시오. 이 달리 제대로 고정되지 않을 수 있으므로 이것은 중요합니다. 필요한 경우, 포셉과 기포와 tracheae를 제거합니다.
3. 실온에서 15 분에 쉐이커에 품다.
4. 1X PBS로 정착액을 교체하고 1X PBS로 두 번 씻어. 30 분 (셰이커에, 상온에서)을 PBS에 세척 계속합니다.
5. PBST로 PBS를 교체하십시오. PBST로 두 번 씻어.
6. 애벌레의 눈 디스크 (3.1.3.)와 midpupal / 성인 망막에서 laminas에서 peripodial 멤브레인을 제거 진행 (3.2.3., 3.3.4.).

5. Immunohistochemistry

1. 차단 : 상온에서 흔드는 20 분에 PBST 및 배양 망막 5 % 정상 혈청 200 μl와 PBS를 교체하십시오.
2. 기본 항체 솔루션을 차단 솔루션을 대체합니다. parafilm으로 세 잘 요리를 밀봉하고 실온에서 흔드는을 하루 아침에 품다.
3. PBST로 솔루션을 교체하고 3 번 씻어. 상온에서 흔드는에서 1 시간의 최소 PBST로 세척 계속합니다.
4. 실온에서 하룻밤 흔드는에 parafilm - 밀폐 된 유리 잘 요리의 보조 항체 솔루션과 배양에 전송.
5. PBST로 항체 솔루션을 교체하고 세 번 씻어. 상온에서 흔드는에서 한 시간의 최소 PBST로 세척 계속합니다. 샘플은 여러 가지 일 PBST에 보관하지만, 밖으로 건조에서 그들을 방지하기 위해 적어도 하루에 한 번 신선한 PBST를 추가하는 것이 중요합니다 수 있습니다.

6. 엠ounting

1. 애벌레의와 midpupal 망막를 장착 들어, 깨끗한 유리 슬라이드의 중심에 망막을 전송할 P20를 사용합니다. 초과 PBST를 제거합니다. 영상을 촉진하기 위해 망막을 정렬 집게를 사용하십시오.
2. 망막의 상단에 미디어를 마운트의 10 μl를 추가합니다. 투명 매니큐어와 24x40-1 커버 슬립과 도장 부드럽게을 다룹니다.
3. 마운트 성인 망막를 들어, ^'다리'(20) 준비 : 유리 측의 양쪽에 50 % 글리세롤의 두 5 μl 방울을 추가하고 22x22-1 커버 용지 (두께 0.13-0.17 mm)로을 다룹니다.
4. P20의 피펫으로 PBST를 제거하고, 망막 아웃 건조하지 있는지 확인하십시오. 잘에 매체를 장착 20 μl를 추가합니다. '다리'유리 슬라이드에 P20와 망막을 전송하는 설치 매체를 사용하십시오.
5. 방향에 집게를 사용합니다 (렌즈는 유리 슬라이드에 직면한다) 및 이미징을 촉진하기 위해 망막을 맞 춥니 다. 필요한 경우, P20과 기포를 제거합니다.
6. 천천히투명 매니큐어 또는 스카치 테이프 상단과 인감 가장자리에 한쪽 곳에서 24x40-1 커버 슬립 (두께 0.13-0.17 mm). 스토어 샘플 4에 ° 현미경 슬라이드 보호기 상자에 C (어둠 속에서 유지).

7. 대표 결과

이 프로토콜의 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 우리는 동영상에 세 발달 단계에서 photoreceptor의 차별화를 시각화를위한 대표적인 결과를 보여줍니다. 애벌레의 눈 antennal 디스크 및 midpupal 망막들은 개발 (그림 1A, B) 동안 다른 photoreceptor 유형을 라벨 및 성인 망막는 두 photoreceptor의 하위 유형 (그림 1C)을 시각화 두 Rhodopsin 항체 물들 된 항체 물들했다.

토론

1. 문제 해결

우리의 경험에서 dissections가 연습 (최대 몇 주까지)이 필요하고 테이블에 팔꿈치와 팔을 쉴 의해 손가락 분해 요리와 접촉을 갖춘 편안한 손의 위치 ²¹ 달성에 의해 촉진된다. 이렇게 만 엄지 손가락, 색인 및 중간 손가락이 미묘한 움직임을 수행합니다.

photoreceptors를 손상시키지 않고 얇은 판을 제거하면 아마도 가장 어려운 단계입니?...

자료

			시약
(PBS1x, 산도 7.4) 생리 인산염 버퍼	시그마		10X 재고 솔루션 (20)를 준비합니다. 실온에서 1X PBS와 상점을 얻기 위해 증류수로 희석. dissections 전에 얼음에 냉각.
트리톤 - X 100	시그마	9002-93-1	주의 :! 자극 장갑을 착용한다. 와 0.3 % 트리톤 X-100 (PBST). 50 ML의 1xPBS 준비 실온에서 보관하십시오.
37%의 포름 알데히드 용액	피셔 과학	F75P1GAL	주의 :! 독성, 가능성이 인간의 발암 물질이 장갑을 착용한다. 고정 단계 전에, 신선한 얼음에 PBS로 diluting하여 화학 퓸 배출 후드에 매장을 3.7 % 용액을 준비.
5% 정상적인 말 혈청	잭슨 Immuno 연구	008-000-001	PBST 5 % V / V 희석을 준비합니다. 네도에서 보관하십시오.
기본 및 보조 항체 (예 : 돈키 안티 - 양, 알렉사 형석 488, 동키 - 반 토끼, 알렉사 형석 555, 돈키 안티 - 마우스 알렉사 형석 647)	Invitrogen 분자 프로브	A11015 A31572 A31571	네도에서 PBST과 매장에서 1:800 보조 항체를 희석.
알렉사 형석 488 Phalloidin		A12379	차 항체 용액에 1:100을 희석.
Slowfade 골드 Antifade 시약	Invitrogen 분자 프로브	S36936	매체를 장착. -20도에서 보관하십시오.
Glycerol	피셔 과학	G31-1	장착하십시오. 온도는 실온에서 증류수, 상점과 50 %의 희석의 10 ML를 준비합니다.
CO 2			파리 성충을 anesthetizing하십시오.
			장비
두 날카로운 집게 (뒤몽 # 55)	정밀 과학 도구	11255-20
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우 코닝		Sylgard 혼합으로 플라스틱 페트리 접시를 작성하여 Sylgard의 분해 요리를 준비합니다.
세 잘 유리 분해 요리	피셔 과학	21-379
TWO minutien 해부 핀 (0.1 mm 직경)와 두 개의 pinholders (12 ㎝)	정밀 과학 도구	26002-10	두 pinholders의 각 한 minutien 핀을 삽입하고 후크를 형성하기 위해 핀 중 하나를 구부린다.
현미경 커버 용지 (22x22-1과 24x40-1)	피셔 과학	12 542A
현미경 슬라이드 (25x75x1.0 mm, precleaned)	피셔 과학	12-550-143
1.5 ML의 microcentrifuge 관
폴란드어 또는 스카치 테이프를 손톱 삭제
궤도 셰이커	Bellco
슬라이드 홀더 상자	피셔 과학
Parafilm	Bemis	PM996
얇은 붓
P20와 P200 micropipettes 및 팁
현미경을 해부
얼음과 작은 양동이			유리 잘 판, 해부하는 망막과 솔루션을 냉각하십시오.