נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

Summary

דרוזופילה רשתית היא סריג הגבישי דמוי המורכבים ממספר קטן של סוגי תאים שנוצרים באופן סטריאוטיפי ¹. amenability לניתוח גנטי מתוחכם מאפשר הלימוד של תוכניות התפתחותיות מורכבות. פרוטוקול זה מתאר ניתוחים ואימונוהיסטוכימיה של רשתית בשלושה שלבי התפתחות נפרדים, עם דגש על בידול photoreceptor.

Abstract

העין המורכבת של דרוזופילה melanogaster מורכב מכ 750 אומטידיה (עיני יחידה). כל אומטידיום מורכב מכ 20 תאים, כולל תאי מפרישי עדשה חרוט, תאי פיגמנט, תאי זיפים ושמונה photoreceptors (PRS) R1-R8 ^2. הפורטוריקנים יש מבנים מיוחדים, microvillar את rhabdomeres, המכילים פיגמנטים רגישים לאור, את Rhodopsins (RHS). את rhabdomeres של שישה הפורטוריקנים (R1-R6) בצורת טרפז ומכיל Rh1 ^{3 4.} את rhabdomeres של R7 ו R8 מוצב במקביל במרכז הטרפז ולשתף אותו הנתיב של אור. R7 והפורטוריקנים R8 stochastically להביע שילובים שונים של RHS בשני תתי סוגים עיקריים ^5: בתת סוג 'P', בעמ 'Rh3 R7s היא בשילוב עם Rh5 בעמ R8s, ואילו בתת הסוג "Y", בRh4 y R7s קשור RH6 בy R8s ^{6 7 8.}

מפרט מוקדם של הפורטוריקנים ופיתוח של אומטידיה מתחיל בדיסק זחל עיני מחושים הדמיוני monolayer של תאי האפיתל. גל של בידול חולף על פני הדיסק ⁹ ויוזם את ההרכבה של תאים לא עברו התמיינות לאומטידיה ^10-11. 'תא המייסד' R8 מצוין ראשון ומגייס R1-6 ולאחר מכן R7 ^12-14. לאחר מכן, במהלך התפתחות גלמים, בידול יחסי הציבור מוביל לשינויים נרחבים מורפולוגיים ^15, כולל היווצרות rhabdomere, synaptogenesis וסופו של דבר ביטוי RH.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות מוגדרות של התפתחות רשתית, אשר יכול להיות מיושמות על מנת לטפל במגוון רחב של שאלות הנוגעות להיווצרות רשתית ומסלולי התפתחות. כאן, אנו משתמשים בשיטות אלה כדי להמחיש את בידול יחסי הציבור ההדרגתי ברמת התא בודד בכל הר זחל, midpupal ומבוגרות רשתיות (

Protocol

1. מבוא

בסרטון הזה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות התפתחותיות מוגדרות: 3 instar הזחל, midpupal ושלב המבוגר. למרות שהפרוטוקול שלנו פועל גם עבור שלבי גלמים אחרים (לפרטים על שלבים מוקדמים יותר, ראה ^16), בחר בשלב midpupal, כפי שהוא אופטימלי להדמיה כל הפורטוריקנים במישור מוקד אחד והגרעינים שלהם הם קל לזיהוי, המאפשר הדמיה של דפוסי ביטוי של גורמי שעתוק. הנתיחה של גלמי רשתיות מאוחר דומה מאוד לנתיחה של רשתית בוגרת.

ראשית, אנו מדגימים כיצד לאסוף זחלים וגלמים בשלבים הרצויים. אז, תסבירו כיצד להשיג נתיחות אופטימליות של זחל ^17-18, midpupal ורשתיות בוגרות. שנית, אנחנו מדגימים איך לדמיין פיתוח יחסי הציבור בשלבים אלה באמצעות מיקרוסקופיה confocal ואימונוהיסטוכימיה.

s = "jove_title"> 2. בימוי ועריכת הדגימה

תקופת ההתפתחות של חרקים היא טמפרטורה תלויה. כדי להקל על היערכות לשחזור של זחלים וגלמים, אנו ממליצים להעלות את כל המניות לטוס ב25 ° C במחזור 12 hr/12 שעתי אור / חושך.

זחלים שלישי instar: כ 96 שעות לאחר הטלת ביצה (ב 25 ° C), האכלה מאוחר 3 instar זחלי תחנה ולשוטט על קירות בקבוקון המזון, שבו הם בסופו pupate. השתמש במברשת רכה או מלקחיים עדינים המסיר את זחל נדודים השלישי instar מקיר בקבוקון מזון.

גלמי 50% ('midpupae') הם נצפו כ 48 שעות לאחר התגלמות. לעיתוי מדויק, אתה יכול להקיף גלמים לבנים בנויים רק עם סמן על בקבוקון מזון. לחלופין, להעביר את כל הגלמים הלבנים לבקבוקון חדש לקבלת בקבוקון של בימוי אחיד (לבימוי של גלמים תוך שימוש בקריטריונים מורפולוגיים, ראה ^19). לאחר 48 שעות, בזהירות remאובת midpupae מהבקבוקון שמשתמש במלקחיים.

זבובים בוגרים: זבובים להרדים מבוגרים צעירים (2-5 ימים לאחר eclosion) על משטח CO _2. הסר את הראש באמצעותו מלקחיים ולאחסן אותם בכוס כן ​​קערה ובה הקר 1x PBS.

3. נוהל דיסקציה (1-2 שעות אודות לניסוי)

לאחר איסוף הדגימה, למקם אותם בטיפה הקרה PBS על צלחת נתיחת Sylgard. לנתח על 10-15 רשתיות לגנוטיפ.

נא להתייעץ את גיליונות בטיחות חומרי נתונים, כמו גם הבריאות והסביבה של המוסד שלך ומשרד ביטחון לטיפול הולם של החומרים כימיים והציוד (ראה טבלאות בסוף הפרוטוקול זה).

1. דיסקים דמותי Eye זחל

1. אתר את הקצה הקדמי של הזחל, המכיל את הקרסים בפה. השתמש במלקחיים כדי ללחוץ על החלק האמצעי של הזחל בעדינות בבסיס של מנת Sylgard. השתמש anothאה מלקחיים כדי לתפוס את קרסי הפה ומשוך בעדינות ובאיטיות מהגוף. השלך את החלק העיקרי של הגוף, ולהשתמש באיברי הפה כדי להחזיק את החלק הקדמי כדי להסיר רקמות מיותרות מהדיסקים הדמיוניים שנותרו צמוד למוח.
2. העברת מוח עם דיסקים דמותי ידי תופס את קרסי פה עם מלקחיים ל1x PBS בצלחת זכוכית של שלוש טובה. לבצע שלב קיבעון (שלב 4.1.).
3. לאחר קיבוע, להסיר בלוטות רוק, רקמת שומן ומושך את המוח מהדיסק הדמיוני עיני המחושים. כדי לשפר את הנגישות של נוגדנים 'קשים', קרום peripodial, הנמצא על פני השטח של האפיתל, ניתן להסיר על ידי לחיצה רצופה על חלק המחושים של הדיסק וקילוף הקרום משם עם סיכה לנתח. בשלב בא, לבצע אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.).

2. התגלמות / Midpupal רשתיות 50%

1. החזק קצה אחורי של מקרה גלמים עם מלקחיים.סור בעדינות את המשטח הקדמי של מקרה הגלמים שנאחז בציפורן עם מלקחיים עוד ולהתרחק באיטיות מpuparium. לקלף ציפורן שיורים לחשוף את הראש.
2. השתמש בעצות של המלקחיים כדי לדקור את השק הבסיסי, הרך באזור הקדמי הגבה. זה מספק גישה לראש. עדינות להפריד את הראש מבית החזה על ידי מציצה לאט את הראש עם פיפטה P20. לגרש את הראש מקצה פיפטה לתוך קר הטרי 1x PBS והסרת רקמה עודפת; לתפוס את הציפורן ולהסיר את ראש חוטם. המשך לצעד קיבעון (שלב 4.1.).
3. פירס האונה האופטית עם סיכת ביתור 1 כדי לייצב את הרקמות. הכנס את הסיכה לנתח האחרת בין lamina והרשתית להיפרד מרשתית lamina / האונה אופטית. בצע אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.).

3. עיניים מבוגרות

1. תפוס את מרכז כמוסת הראש האחורית עם מלקחיים ולהסיר חלקי פה (חוטם), tiss שומןue וtracheae.
2. תפוס את הציפורן עם הראש הגבה 1 מלקחיים ולהשתמש בזה כדי להפריד את עיניים מרקמת המוח על ידי משייכתו בעדינות צידה. ברוב המקרים, lamina, נדן דק ושקוף של neuropil המוח, יישאר מחובר לרשתית. זה קל יותר להסיר את lamina לאחר קיבוע.
3. הסרת ציפורן בשולי העין, אבל להשאיר חתיכה קטנה מאחור כדי להקל על העברת רשתיות לפתרונות שונים. לבצע קיבוע (שלב 4.1.).
4. הסר את lamina ידי תופס אותו בצד אחד עם מלקחיים ומושכים בעדינות צידה עם מלקחיים האחרים מבלי לפגוע ברשתית. הסרת ציפורן שיורים, כפי שאפשר לקפל לתוך הרשתית במהלך ההרכבה. שני צעדים אלה הם קריטיים להמחשת photoreceptors, שאחרת היה מוסתר על ידי lamina ושרידים של ציפורן במהלך תהליך ההדמיה. המשך אל אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.).

4. קיבעון וwashing (אודות 1 שעות)

1. אחסן את הרשתיות הגזורות ב1x PBS בכלי זכוכית גם שלושה מונחים על קרח בזמן הכנה טריה מקבעים (לדלל 40 microliters של 37% פתרון פורמלדהיד עם 360 μl של 1x PBS, מערבולת וחנות על קרח). אנו ממליצים להמשיך בפרוטוקול הקיבעון ולהימנע מזמני אחסון ארוכים על קרח (> 15 דקות).
2. החלף 1x PBS עם 200 μl של 3.7% פתרון פורמלדהיד. ודא הרקמה שקועה במקבע. זה קריטי, כפי שהוא עשוי אחרת לא ניתן לתקן כראוי. אם יש צורך, להסיר בועות אוויר וtracheae עם המלקחיים.
3. דגירה על ייקר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
4. החלף מקבעים עם 1x PBS ולשטוף פעמים עם 1x PBS. המשך כביסה ב PBS למשך 30 דקות (שבייקר, בטמפרטורת חדר).
5. החלף PBS עם PBST. שטוף פעמים עם PBST.
6. המשך בהסרת קרום peripodial מדיסקי זחל עיניים (3.1.3). וlaminas מרשתיות midpupal / מבוגר <חזק> (3.2.3., 3.3.4.).

5. אימונוהיסטוכימיה

1. חסימה: החלף PBS עם 200 μl של סרום הנורמלי של 5% בPBST ולדגור רשתיות במשך 20 דקות על שייקר בטמפרטורת חדר.
2. החלף פתרון חסימה עם פתרון נוגדן ראשוני. לאטום את הצלחת שלוש היטב עם parafilm ודגירת הלילה בייקר בטמפרטורת חדר.
3. החלף פתרון עם PBST ולשטוף 3 פעמים. המשך כביסה עם PBST למינימום של 1 שעה שבייקרה בטמפרטורת חדר.
4. העברה בפתרון שני נוגדנים ולדגור בצלחת parafilm אטומה היטב בכוס שייקרו לילה בטמפרטורת חדר.
5. החלף פתרון נוגדן עם PBST ולשטוף שלוש פעמים. המשך כביסה עם PBST למינימום של שעה אחת שבייקר בטמפרטורת חדר. הדגימות יכולות להיות כל זמן בPBST במשך כמה ימים, אבל זה קריטי להוסיף PBST טרי לפחות פעם ביום כדי למנוע מהם להתייבש.

6. Mounting

1. להרכבת עדשות של זחל וmidpupal, השתמש P20 להעביר רשתיות למרכז שקופית זכוכית נקיה. הסר PBST העודף. השתמש במלקחיים כדי ליישר את הרשתיות כדי לאפשר הדמיה.
2. הוסף 10 μl של הרכבה בינונית על גבי הרשתית. לכסות אותם בעדינות עם פתק כיסוי 24x40-1 וחותם עם לק השקוף.
3. למבוגרי רשתיות הרכבה, להכין 'הגשרים' ^20: להוסיף שתי טיפי μl 5 של גליצרול 50% בשני הקצוות של צד זכוכית ולכסות אותם בתלושי כיסוי 22x22-1 (0.13-0.17 מ"מ עובי).
4. הסר את PBST עם פיפטה P20; לוודא שהרשתית לא תתייבש. הוסף 20 μl של הרכבה בינונית עד טוב. השתמש בינוני גובר להעביר רשתיות עם P20 לשקופית 'הגשר' הזכוכית.
5. השתמש במלקחיים כדי לכוון (עדשות צריכות להתמודד שקופיות זכוכית) וליישר את הרשתיות כדי לאפשר הדמיה. אם יש צורך, להסיר בועות אוויר עם P20.
6. לאטמקום להחליק כיסוי 24x40-1 (0.13-0.17 מ"מ עובי) מצד אחד על גבי וקצוות חותמים עם לק השקוף או נייר דבק. דגימות חנות ב 4 ° C בתיבת שומר שקופית מיקרוסקופ (לשמור בחושך).

7. נציג תוצאות

כדוגמה ליישום של פרוטוקול זה, אנו מראים תוצאות יציגות להמחשת בידול photoreceptor בשלושת שלבי ההתפתחות בוידאו. דיסק עיני מחושי זחל ורשתית midpupal הוכתמו נוגדנים מטביעים סוגי photoreceptor שונים במהלך התפתחותם (איור 1 א ', ב') ורשתית מבוגר הייתה מוכתמת בשני נוגדני rhodopsin לדמיין שתי תת photoreceptor (התרשים 1C).

Discussion

1. פתרון בעיות

מניסיוננו, נתיחות דורשות תרגול (עד מספר שבועות) והם הקלו על ידי השגת עמדת יד נוחה של ²¹ על נח את המרפקים ואמות על השולחן ובאצבעות יצירת קשר עם צלחת הניתוח. אצבעות בדרך זו, רק אגודלים, אינדקס ובינוניים לבצע תנועות עד...

Materials

			מגיב
פוספט נאגר מלוח (PBS1x, 7.4 pH)	סיגמא		הכן את פתרון המניות 10x 20. לדלל במים מזוקקים להשיג 1x PBS וחנות בטמפרטורת חדר. לקרר בקרח לפני הניתוחים.
טריטון X-100	סיגמא	9002-93-1	זהירות:! גירוי ללבוש כפפות. הכן 50 המ"ל 1xPBS עם 0.3% Triton X-100 (PBST). לאחסן בטמפרטורת חדר.
37% תמיסת פורמלדהיד	הפישר סיינטיפיק	F75P1GAL	זהירות:! מסרטן רעיל, צפוי אדם להשתמש בכפפות. לפני צעד הקיבעון, טרי להכין תמיסת 3.7% במנדף כימי על ידי דילול עם PBS, חנות על קרח.
5% סרום סוס רגיל	ג'קסון חיסוני מחקר	008-000-001	הכן 5% דילול v / v בPBST. אחסן בארבעה תארים.
נוגדנים ראשוניים ומשניים (לדוגמא דונקי אנטי כבשי Alexa פלואוריד 488, דונקי אנטי הארנב Alexa פלואוריד 555, דונקי אנטי עכבר Alexa פלואוריד 647)	בדיקות מולקולריות Invitrogen	A11015 A31572 A31571	דלל נוגדנים 1:800 בPBST וחנות בארבעה תארים משניים.
Alexa פלואוריד 488 Phalloidin		A12379	דלל 1:100 בפתרון נוגדנים משני.
מגיב Antifade זהב Slowfade	בדיקות מולקולריות Invitrogen	S36936	הרכבה בינונית. אחסן ב-20 מעלות.
Glycerol	הפישר סיינטיפיק	G31-1	להרכבה. הכן 10 מ"ל של דילול 50% במים, חנות מזוקקת בטמפ 'החדר.
CO 2			להרדמת זבובים בוגרים.
			ציוד
שני מלקחיים חדים (דומון # 55)	כלי מדע פיין	11255-20
ערכת אלסטומר Sylgard 184 סיליקון	Dow Corning		הכן צלחת נתיחת Sylgard ידי מילוי צלחת פטרי פלסטיק עם תערובת Sylgard.
מנות נתיחת הזכוכית שלוש גם	הפישר סיינטיפיק	21-379
Two minutien סיכות מבתרות (0.1 מ"מ קוטר) ושתי pinholders (12 סנטימטר)	כלי מדע פיין	26002-10	הכנס סיכה אחת minutien בכל אחד משני pinholders ולכופף את אחד מהפינים בצורת קרס.
תלושי כיסוי מיקרוסקופ (22x22-1 ו24x40-1)	הפישר סיינטיפיק	12-542A
שקופיות מיקרוסקופ (25x75x1.0 מ"מ; precleaned)	הפישר סיינטיפיק	12-550-143
1.5 צינורות מ"ל microcentrifuge
נקה לק או נייר דבק
אורביטל שייקר	Bellco
תיבת מחזיק שקופיות	הפישר סיינטיפיק
Parafilm	Bemis	PM996
מכחול דק
P20 וP200 micropipettes וטיפים
ביתור מיקרוסקופ
דלי קטן עם קרח			לקירור לוחות הזכוכית, גם הרשתית גזורה והפתרונים.