Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

Özet

Drosophila Retina bir basmakalıp şekilde oluşturulan hücre tipleri az sayıda oluşan bir kristal kafes benzeri bir ¹. Sofistike genetik analizi için onun amenability kompleks gelişim programlarının çalışma sağlar. Bu protokol fotoreseptör farklılaşma odaklanarak, üç ayrı gelişim aşamalarında diseksiyonlarının ve retinanın immunohistokimyasal açıklar.

Özet

Drosophila melanogaster bileşik göz yaklaşık 750 küçük gözcüklerinin (birim göz) oluşur. Her bir ommatidium lens koni salgılayan hücreler, pigment hücreler, bir kıl hücresi ve sekiz fotoreseptör (PR) R1'in-R8 ² de dahil olmak üzere yaklaşık 20 hücreleri oluşur. PRs ışığa duyarlı pigmentleri, Rhodopsins (RHS) içeren özel microvillar yapıları, rhabdomeres var. Altı PRS rhabdomeres (R1-R6) bir yamuk oluşturur ve RH1 ^{3 4} içerir. R7 ve R8 rhabdomeres yamuk merkezi arka arkaya yerleştirilmiş ve ışık aynı yol paylaşırlar. R7 ve R8, PR stokastik olarak iki ana tipi ⁵ ST farklı kombinasyonlarını ifade eder: 'p' tipinde, s R7s içinde RH3 p R8s içinde RH5 ile bağlanmaktadır, "y" alt tipinde, y R7s içinde RH4 ile ilişkili iken y RH6 ^{6 7 8} R8s.

PRs ve küçük gözcüklerinin gelişimi erken belirtimi larva göz antennal hayalsel disk, epitel hücre tek tabaka başlar. Farklılaşma dalgası diski ⁹ genelinde süpürür ve küçük gözcüklerinin ^10-11 içine farklılaşmamış hücre montajı başlatır. 'Kurucusu hücre' R8 ilk olarak belirtilen ve R7 ^12-14 R1-6 ve sonra acemi. Edilir Daha sonra, pupa gelişme sırasında, PR farklılaşma rhabdomere oluşumu, sinaptogenez ve sonunda rh ekspresyonunu içeren kapsamlı morfolojik değişiklikler ^15, yol açar.

Bu protokol, biz retina oluşumu ve gelişme yollarını ilgili çeşitli sorular ele uygulanabilir Retina gelişimi üç tanımlandığı dönemlerde, retinal diseksiyonu ve immünohistokimya yöntemleri açıklanmaktadır. Burada, bütün montaj larva, midpupal ve yetişkin retina (içinde tek hücre düzeyinde aşamalı PR farklılaşma görselleştirmek için bu yöntemleri kullanabilirsiniz

Protokol

1. Giriş

Üçüncü dönem larva, midpupal ve yetişkinlik evresi: Bu video, biz üç tanımlanan gelişimsel dönemlerinde retina diseksiyonu ve immünohistokimya yöntemleri açıklanmaktadır. Bizim protokol aynı zamanda diğer pupa aşamalarında (önceki aşamalarında ilgili ayrıntılar için, ¹⁶⁾ için çalışıyor olsa da tek bir odak düzlemli ve onların çekirdekleri tüm PR ve görüntülenmesini kolaylaştırır, hangi kolayca tanımlanabilir görüntüleme için optimum olduğu gibi, biz, midpupal sahne seçti transkripsiyon faktörü ekspresyonu. Geç pupa retinanın diseksiyonu yetişkin retinanın diseksiyonu çok benzer.

İlk olarak, istenilen safhalarında larva ve pupa toplamak için nasıl gösterilmektedir. Sonra, larva ^17-18 midpupal ve yetişkin retina optimal diseksiyonları edinme açıklar. İkincisi, immünohistokimyasal ve konfokal mikroskopi kullanılarak bu aşamada PR gelişimi görselleştirmek nasıl gösterilmektedir.

2. Evreleme ve Numune Hazırlanması

Böceklerin gelişim dönemi sıcaklığa bağımlıdır. Larva ve pupa arasında tekrarlanabilir evreleme kolaylaştırmak için, biz 12 saat/12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında 25 tüm sinek stokları ° C yükseltilmesi önerilir.

Üçüncü evre larvalar: 96 Hakkında yumurtlama sonra saat (25 ° C'de), geç Üçüncü dönem larva durağı beslenme ve sonunda pupa gıda flakon, duvarlarında dolaşmaya. Yavaşça gıda flakonun duvarına bir dolaşıp üçüncü evre larva kaldırmak için yumuşak bir fırça veya bir forseps kullanın.

En az% 50 pupa ('midpupae') pupa devresi sonra yaklaşık 48 saat gözlenmiştir. Kesin zamanlama için, gıda flakon bir işaretleyici ile sadece biçimli beyaz pupa daire. Alternatif olarak, düzgün bir sahneleme flakon (morfolojik kriterler kullanarak pupası evrelemesi için, ¹⁹⁾ elde etmek için yeni bir flakon tüm beyaz pupa taşıyın. Sonra 48 saat, dikkatle rembir forseps kullanarak flakondan midpupae ove.

Yetişkin sinekler: Bir CO ₂ pad üzerinde uyutmak genç yetişkin sinekler (2-5 gün eclosion sonra). Bir forseps kullanarak kafaları çıkarın ve bir bardak saklayabilirsiniz de soğuk 1x PBS içeren çanak.

3. Diseksiyon Prosedürü (Deney başına 1-2 Hakkında hr)

Örnek topladıktan sonra, bir Sylgard diseksiyon çanak soğuk PBS bir damla koyun. Genotip başına 10-15 retinaları hakkında teşrih.

Reaktifler ve ekipman doğru kullanımı için Malzeme Güvenlik Bilgi Formları yanı sıra kurum Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi (bu protokolün sonunda tabloya bakın) danışın.

1. Larva Göz hayalsel Diskler

1. Ağız kanca içeren larva, ön sonuna bulun. Sylgard çanak tabanı nazikçe larva orta kısmına basın bir forseps kullanın. Anoth kullanıner ağız kanca kapmak ve vücuttan hafifçe ve yavaşça çekin forseps. Gövde, ana kısım atılır ve beyin bağlı kalmasını hayali diskler, harici dokulardan çıkarmak için ön kısmı tutmak için ağız parçaları kullanır.
2. Üç sıra cam tabak 1x PBS bir forseps ile ağız kanca kapma hayali diskler ile beyin aktarın. Fiksasyon adımı (adım 4.1.) Gerçekleştirin.
3. Tespit edildikten sonra, yağ dokusu tükrük bezleri kaldırmak ve göz antennal hayalsel disk uzak beyin çekin. 'Zor' antikorların erişilebilirliğini artırmak için, epitel yüzeyinde bulunan peripodial membran, diskin anten kısmını basılı tutarak ve bir diseksiyon iğne ile uzak membran soyulması ile kaldırılabilir. Sonraki, immünohistokimyasal (adım 5.1.) Gerçekleştirin.

2. 50% pupa devresi / Midpupal retinaları

1. Bir forseps ile pupa davanın posterior ucundan tutun.Yavaşça başka bir forseps ile manikür kapma pupa halinde ön yüzeyi kaldırmak ve yavaş yavaş puparium uzağa çekin. Peel uzakta kafa maruz kalan kütikül.
2. Delmek dorsal anterior bölgede yatan, yumuşak çuval forsepsi 'ipuçlarını kullanın. Bu kafa erişim sağlar. Yavaşça yavaşça P20 pipet ile kafasını emerek torakstan başını ayırın. Taze soğuk 1x PBS içine pipet, baş kovduktan aşırı doku kaldırmak; baş manikür kapmak ve hortum çıkarın. Fiksasyon adımı (adım 4.1.) Geçin.
3. Sürekli doku bir diseksiyon iğne ile Pierce optik lob. Lamina ve lamina / optik lob retinanın ayrılması retina arasındaki diğer kesme pimini takın. Immünohistokimyasal (adım 5.1.) Gerçekleştirin.

3. Yetişkin Gözler

1. Bir forseps ile posterior kafa kapsül merkezinde tut ve ağız parçaları (hortum), yağ tiss kaldırue ve trakea.
2. Tek bir forseps ile dorsal baş manikür tut ve hafifçe yanlara doğru çekerek beyin dokusundan gözleri ayırmak için diğer kullanın. Çoğu durumda, tabaka, beyin nöropil bir ince, şeffaf kılıf, retina bağlı kalacaktır. Bu tespit sonrası lamina kaldırmak daha kolaydır.
3. Göz marjdaki kütikül çıkarın, ancak farklı çözümler retinanın transferini kolaylaştırmak için arkasında küçük bir parça bırakın. (Adım 4.1.) Fiksasyon gerçekleştirin.
4. Bir forseps ile bir tarafında o kapma ve yavaşça retinanın bozmadan diğer forseps ile yanlara çekerek lamina çıkarın. Bu montaj sırasında retina üzerine katlayın olabilir gibi, rezidüel manikür çıkarın. Bu iki adım aksi lamina tarafından engellenir ve görüntüleme işlemi sırasında kütikül kalır olacaktır fotoreseptör, görselleştirme için kritik öneme sahiptir. Immünohistokimyasal (adım 5.1.) Geçin.

4. Fiksasyon ve Washing (Hakkında 1 saat)

1. Taze (1x PBS, buz üzerinde girdap ve mağaza 360 ul% 37 formaldehit solüsyonu 40 mikrolitre sulandırmak) fiksatif hazırlanırken buz üzerine yerleştirilir üç sıra cam tabak 1x PBS disseke retinaları saklayın. Biz fiksasyon protokolü ile devam etmek ve buz (> 15 dk) uzun saklama süreleri önlemek için tavsiye.
2. % 3,7 formaldehit solüsyonu 200 ul 1x PBS değiştirin. Doku fiksatif batmış olduğundan emin olun. Aksi takdirde düzgün sabit olabilir gibi bu önemlidir. Gerekirse, forseps ile hava kabarcıklarını çıkarmak ve trakea.
3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karıştırma cihazı üzerinde inkübe edin.
4. 1x PBS ile fiksatif değiştirin ve 1x PBS ile iki kez yıkayın. 30 dk (çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında) PBS içinde yıkama devam edin.
5. PBST ile PBS değiştirin. PBST ile iki kere yıkayın.
6. Larva göz diskleri (3.1.3.) Ve midpupal / yetişkin retina gelen laminalar gelen peripodial zarı çıkarmadan devam edin (3.2.3., 3.3.4.).

5. İmmünohistokimya

1. Engelleme: Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, 20 dakika için PBST ile inkübe retina% 5, normal serum ve 200 ul PBS ile değiştirin.
2. Primer antikor çözümü engelleme çözümü değiştirin. Parafilm ile üç kuyu çanak mühürleyin ve oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, gece boyunca inkübe edilir.
3. PBST ile çözüm değiştirin ve 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, 1 saat arasında, en az PBST ile yıkama devam edin.
4. Gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde parafilm-mühürlü cam sıra çanak sekonder antikor çözüm ve inkübe Transfer.
5. PBST ile antikor çözüm değiştirin ve üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, bir saat arasında, en az PBST ile yıkama devam edin. Numuneler, birkaç gün için PBST içinde tutulur ama kurumasını önlemek için en az bir gün başına bir defa PBST taze eklemek için kritik olabilir.

6. Mounting

1. Larva ve midpupal retina montaj için, temiz bir cam slayt merkezine retina aktarmak için P20 kullanılır. Aşırı PBST çıkarın. Görüntüleme kolaylaştırmak amacıyla retinaları hizalamak için bir forseps kullanın.
2. Retina üstüne orta montaj 10 ul ekleyin. Net oje ile 24x40-1 kapak kayma ve mühür ile onları hafifçe örtün.
3. Montaj yetişkin retina için, 'köprüler' ²⁰ hazırlamak: Bir tarafı cam her iki ucuna% 50 gliserol iki 5 ul damlacıkları ekleyin ve 22x22-1 kapak camları (kalın 0,13-0,17 mm) ile bunları kapatın.
4. Bir P20 pipet ile PBST çıkarın; retina kurumasına yok emin olun. Iyi orta montaj 20 ul ekleyin. 'Köprü' cam slayt P20 ile retina aktarmak için montaj ortamı kullanın.
5. Yönlendirmek için bir forseps kullanın (lensler cam slayt bakmalıdır) ve görüntüleme kolaylaştırmak için retina hizalayın. Gerekirse, P20 ile hava kabarcıklarını çıkarmak.
6. Yavaş yavaşnet oje veya seloteyp ile üst ve conta kenarları bir tarafında yer 24x40-1 kapak kayma (kalın 0,13-0,17 mm). Mağaza numuneler 4 ° bir mikroskop lamı koruyucu kutusuna C (karanlıkta tutmak).

7. Temsilcisi Sonuçlar

Bu protokolün uygulanması için bir örnek olarak, video üç gelişim aşamalarında fotoreseptör farklılaşma görselleştirmek için temsili sonuçlar göstermektedir. Bir larva göz antennal disk ve midpupal retina gelişimini (Şekil 1A, B) sırasında farklı fotoreseptör tipleri etiket ve bir yetişkin retinanın iki fotoreseptör alt (Şekil 1C) görselleştirmek için iki rodopsin antikor ile boyandı antikorları ile boyandı.

Tartışmalar

1. Sorun Giderme

Bizim tecrübelerimize göre, diseksiyonlar uygulamada (birkaç haftaya kadar) gerektirir ve masada dirsek ve ön kol bekleterek ve parmak diseksiyon çanak ile temas rahat bir el pozisyonu ²¹ elde kolaylaştırılmaktadır. Bu şekilde, sadece başparmak, işaret ve orta parmakları ince hareketleri gerçekleştirin.

Fotoreseptörler zarar vermeden lamina Çıkarma muhtemelen en zor adımdır. Lamina kırmızı göz pigmentasyon karşı ...

Malzemeler

			Reaktif
(PBS1x, pH 7.4) ile tuzlu su, fosfat tamponlu	Sigma		10x stok solüsyonu 20 hazırlayın. Oda sıcaklığında 1x PBS ve mağaza almak için distile su ile seyreltin. Diseksiyonlar önce buz üzerinde soğutun.
Triton-X 100	Sigma	9002-93-1	Dikkat: Tahriş edici eldiven giyin. Ile% 0.3 Triton X-100 (PBST). 50 ml 1xPBS hazırlanması Oda sıcaklığında saklayın.
% 37 formaldehit solüsyonu	Fisher Scientific	F75P1GAL	Dikkat: Toksik, muhtemel insan kanseri eldiven giyin. Fiksasyon adım önce, taze buz üzerine, PBS ile seyrelterek bir kimyasal davlumbaz mağaza% 3.7 solüsyon hazırlanır.
% 5, normal at serumu	Jackson Immuno Araştırma	008-000-001	PBST içinde% 5 v / v seyreltme hazırlayın. Dört derece saklayın.
Birincil ve ikincil antikorlar (örn. Donkey anti-koyun Alexa Fluor 488, Donkey anti-tavşan Alexa Fluor 555, Donkey anti-fare Alexa Fluor 647)	Invitrogen Moleküler Sondalar	A11015 A31572 A31571	Dört derece PBST ve mağaza 1:800 sekonder antikor seyreltin.
Alexa Fluor 488 Phalloidin		A12379	Sekonder antikor çözüm 1:100 seyreltin.
Slowfade Altın antifade reaktifi	Invitrogen Moleküler Sondalar	S36936	Orta Montaj. -20 Derecede saklayın.
Glycerol	Fisher Scientific	G31-1	Montaj için. Oda sıcaklığında distile su, mağaza ile% 50 seyrelme 10 ml hazırlayın.
CO2			Ergin sinek anestezi için.
			Ekipman
İki keskin forseps (Dumont # 55)	Güzel Bilim Araçları	11255-20
Sylgard 184 Silikon Elastomer Takımı	Dow Corning		Sylgard karışımı ile bir plastik Petri kabı doldurarak Sylgard diseksiyon çanak hazırlayın.
Üç sıra cam diseksiyonu yemekler	Fisher Scientific	21-379
Two minutien kesme pimler (0.1 mm çap) ve iki pinholders (12 cm)	Güzel Bilim araçları	26002-10	Iki pinholders her biri minutien pim ekleyin ve kanca oluşturmak üzere pimlerin bir viraj.
Mikroskop kapak slipi (22x22-1 ve 24x40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Mikroskop slaytlar (25x75x1.0 mm; precleaned)	Fisher Scientific	12-550-143
1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri
Lehçe veya seloteyp tırnak Temizle
Orbital çalkalayıcı	Bellco
Slayt tutucu kutusu	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
İnce fırça
P20 ve P200 mikropipetler ve ipuçları
Mikroskop Diseksiyon
Buz ile Küçük kovası			Cam kuyucuğu, disseke retina ve çözümler soğutma için.