Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

Résumé

La Drosophila est un réseau cristallin de type composé d'un petit nombre de types de cellules qui sont produites d'une manière stéréotypée ¹. De la perméabilité à l'analyse génétique sophistiquée permet l'étude des programmes complexes de développement. Ce protocole décrit les dissections et immunohistochimie de rétines à trois stades de développement distincts, en mettant l'accent sur la différenciation des photorécepteurs.

Résumé

L'œil composé de Drosophila melanogaster est constitué d'environ 750 ommatidies (yeux unitaires). Chaque ommatidie est composé d'environ 20 cellules, dont les cellules sécrétrices cône lentille, les cellules pigmentaires, une cellule poils et huit photorécepteurs (PR) R1-R8 ^2. Les bénéficiaires principaux ont des structures spécialisées, les microvillosités rhabdomeres, qui contiennent des pigments sensibles à la lumière, les Rhodopsins (ERS). Les rhabdomeres de six PN (R1-R6) forment un trapèze et contiennent Rh1 ^{3 4.} Les rhabdomeres de R7 et R8 sont positionnées en tandem dans le centre du trapèze et partager le même chemin de lumière. R7 et R8 PR stochastique exprimer différentes combinaisons de Rhs en deux sous-types principaux ^5: Dans le sous-type 'p', p RH3 en R7s est couplé avec RH5 en p R8S, alors que dans le sous-type 'y', y Rh4 dans R7s est associée à rh6 en y R8S ^{6 7 8.}

Spécification précoce des PR et le développement des ommatidies commence dans les larves des yeux antennaire disque imaginal, une monocouche de cellules épithéliales. Une onde de différenciation balaie le disque ⁹ et déclenche l'ensemble de cellules indifférenciées en ommatidies ^10-11. R8 La «cellule fondateur est spécifiée en premier et recrute R1-6 et R7 ^12-14. Par la suite, au cours du développement nymphal, la différenciation PR conduit à d'importantes modifications morphologiques ^15, y compris la formation rhabdomere, la synaptogenèse et d'expression finalement rh.

Dans ce protocole, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes déterminées du développement de la rétine, qui peuvent être appliquées pour traiter une variété de questions concernant la formation de la rétine et les voies de développement. Ici, nous utilisons ces méthodes pour visualiser la différenciation progressive proportionnelle au niveau unicellulaire en tout montage des larves, adultes et midpupal rétines (

Protocole

1. Introduction

Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes de développement définis: le troisième stade larvaire, la midpupal et le stade adulte. Bien que notre protocole fonctionne aussi pour d'autres stades nymphal (pour plus de détails sur les étapes précédentes, voir ^16), nous avons choisi la scène midpupal, comme il est optimal pour l'imagerie tous les PR dans un plan focal et leurs noyaux sont facilement identifiables, ce qui facilite la visualisation des les modèles d'expression de facteurs de transcription. La dissection des rétines fin nymphe est très similaire à la dissection des rétines adultes.

Tout d'abord, nous montrer comment recueillir les larves et les nymphes aux étapes souhaitées. Ensuite, nous expliquons comment obtenir des dissections optimales de larves ^17-18, midpupal et rétines adultes. Deuxièmement, nous démontrons comment visualiser développement PR à ces étapes en utilisant la microscopie confocale et immunohistochimie.

2. Mise en scène et préparation des échantillons

La période de développement des insectes est dépendant de la température. Afin de faciliter la mise en scène reproductible des larves et des nymphes, nous vous recommandons de soulever tous les stocks de mouche à 25 ° C sous un 12 h/12 ​​h de lumière / obscurité cycle.

Troisième stade larvaire: Environ 96 heures après la ponte (à 25 ° C), à la fin du troisième stade d'arrêt d'alimentation des larves et se promener sur les parois du flacon alimentaire, où ils finissent par se nymphosent. Utilisez une brosse douce ou une pince pour enlever délicatement une errance de troisième stade larvaire de la paroi du flacon de nourriture.

Pupes de 50% («midpupae ') sont observées environ 48 heures après la nymphose. Pour timing exact, vous pouvez entourer juste formé pupes blanc avec un marqueur sur le flacon de nourriture. Vous pouvez également déplacer les pupes blanc à un nouveau flacon pour obtenir un flacon de mise en scène uniforme (pour la stadification des pupes à l'aide des critères morphologiques, voir ^19). Après 48 heures, bien réelsove l'midpupae du flacon à l'aide d'une pince.

Les mouches adultes: anesthésier les mouches adultes jeunes (2-5 jours après l'éclosion) sur un pad CO _2. Enlever les têtes à l'aide d'une pince et de les stocker dans un verre bien plat froid contenant du PBS 1x.

3. Procédure Dissection (À propos de 1-2 heures par expérience)

Après la collecte du spécimen, les placer dans une goutte de PBS froid sur un plat de dissection Sylgard. Disséquer environ 10-15 rétines par génotype.

S'il vous plaît consulter les fiches signalétiques ainsi que la santé environnementale de votre institution et sécurité pour la manipulation des réactifs et du matériel (voir les tableaux à la fin de ce protocole).

1. Disques yeux larvaires Imaginal

1. Localiser l'extrémité antérieure de la larve, qui contient les crochets buccaux. Utilisez une pince à appuyer sur la partie centrale de la larve doucement contre le fond du plat Sylgard. Utilisez another Pince pour saisir les crochets buccaux et tirez doucement et lentement loin du corps. Jeter la partie principale du corps et utiliser les pièces buccales pour maintenir la partie antérieure afin d'éliminer les tissus étrangers à partir des disques imaginaux qui restent attachées au cerveau.
2. Transfert du cerveau avec des disques imaginaux en saisissant les crochets buccaux avec une pince à 1x PBS dans une cuve en verre de trois puits. Effectuez l'étape de fixation (étape 4.1.).
3. Après fixation, enlever les glandes salivaires, le tissu adipeux et tirez le cerveau loin du disque œil-antennaire imaginale. Pour améliorer l'accessibilité des anticorps "difficiles", la membrane peripodial, qui se trouve sur la surface de l'épithélium, peut être enlevé en appuyant sur la partie du disque antennaire et le pelage de la membrane de distance avec une broche de dissection. Ensuite, effectuez l'immunohistochimie (étape 5.1.).

2. 50% nymphose / Midpupal Rétines

1. Tenez extrémité postérieure de la coque de nymphose avec une pince.Retirez délicatement la surface antérieure de la coque de nymphose en saisissant la cuticule avec un autre pince et tirer lentement loin de la pupe. Décollez cuticule résiduelle pour exposer la tête.
2. Utilisez les conseils forceps »pour percer le sous-jacent, sac mou dans la région dorsale antérieure. Ceci permet d'accéder à la tête. Séparez délicatement la tête du thorax par aspirer lentement la tête avec une pipette P20. Expulser la tête de la pointe de la pipette dans du PBS frais froid 1x et enlever l'excès de tissu; saisir la cuticule tête et retirer trompe. Passez à l'étape de fixation (étape 4.1.).
3. Percer le lobe optique avec une broche de dissection pour stabiliser le tissu. Insérer la goupille d'autres dissection entre la lame et la rétine de séparer la rétine de la lame / lobe optique. Effectuer immunohistochimie (étape 5.1.).

3. Yeux adultes

1. Prenez le centre de la capsule postérieure de la tête avec une pince et retirer des pièces buccales (trompe), Tiss graisseue et trachées.
2. Prenez la cuticule dorsale tête avec une pince et utiliser l'autre pour séparer les yeux du tissu cérébral en tirant doucement sur le côté. Dans la plupart des cas, la lame, une gaine mince et transparente des neuropile cerveau, restera attaché à la rétine. Il est plus facile d'enlever la lame après fixation.
3. Retirer cuticule à la marge œil, mais laisser un petit morceau arrière pour faciliter le transfert de la rétine à des solutions différentes. Effectuer la fixation (étape 4.1.).
4. Retirer la lame en le saisissant sur un côté avec une pince et tirant légèrement sur le côté avec les pinces autres sans nuire à la rétine. Retirer cuticule résiduelle, car il pourrait se replier sur la rétine lors du montage. Ces deux étapes sont essentielles pour la visualisation de photorécepteurs, qui, autrement, seraient masqués par la lame et reste de la cuticule pendant le processus d'imagerie. Passez à l'immunohistochimie (étape 5.1.).

4. Fixation et Washing (environ 1 h)

1. Stocker les rétines disséqués dans du PBS 1x dans un plat en verre de trois puits placé sur la glace tout en préparant le fixateur frais (dilué 40 microlitres de solution de formaldéhyde à 37% avec 360 ul de PBS 1x, vortex et stocker de la glace). Nous vous recommandons de procéder à la fixation de protocole et d'éviter les longues périodes d'entreposage sur glace (> 15 min).
2. Remplacer 1x PBS avec 200 pi de solution de formaldéhyde à 3,7%. Assurez-vous que le tissu est immergé dans un fixateur. Cela est essentiel, car il ne peut être autrement fixé correctement. Si nécessaire, enlever les bulles d'air et les trachées avec la pince.
3. Incuber sur agitateur pendant 15 min à température ambiante.
4. Remplacer fixateur avec 1x PBS et rincer deux fois avec du PBS 1x. Continuer lavage dans du PBS pendant 30 min (le shaker, à la température ambiante).
5. Remplacer PBS avec du PBST. Rincer deux fois avec du PBST.
6. Procéder à l'enlèvement de la membrane peripodial de disques yeux larvaires (3.1.3.) Et les lamelles de midpupal / adulte rétines (3.2.3., 3.3.4.).

5. Immunohistochimie

1. Blocage: Remplacer PBS avec 200 pi de sérum normal de 5% dans du PBST et incuber rétines pendant 20 min sur agitateur à température ambiante.
2. Remplacer la solution de blocage avec une solution d'anticorps primaire. Sceller le plat de trois puits avec du parafilm et incuber une nuit sur agitateur à température ambiante.
3. Remplacer la solution avec du PBST et rincer 3 fois. Continuer lavage avec PBST pour un minimum de 1 heure sur agitateur à température ambiante.
4. Transfert dans une solution d'anticorps secondaire et incuber dans un plat en verre scellé parafilm et le shaker nuit à température ambiante.
5. Remplacer solution d'anticorps avec PBST et rincer trois fois. Continuer lavage avec PBST pour un minimum d'une heure sur agitateur à température ambiante. Les échantillons peuvent être conservés dans du PBST pendant plusieurs jours, mais il est essentiel d'ajouter PBST frais au moins une fois par jour pour les empêcher de se dessécher.

6. Montage

1. Pour le montage rétines larvaires et midpupal, utilisez la P20 pour transférer les rétines au centre d'une lame de verre propre. Retirer l'excès PBST. Utiliser une pince à aligner la rétine en vue de faciliter l'imagerie.
2. Ajouter 10 ul de milieu de montage sur le dessus de la rétine. Recouvrez-les délicatement avec un glissement 24x40-1 couvercle et le joint avec du vernis à ongles transparent.
3. Pour montage rétines adultes, préparer des «ponts» ^20: Ajoutez deux gouttes 5 ul de glycérol à 50% sur les deux extrémités d'un côté verre et recouvrez-les avec des lamelles de 22x22-1 (0,13 à 0,17 mm d'épaisseur).
4. Retirez le PBST avec une pipette P20, assurez-vous que les rétines ne se dessèchent pas. Ajouter 20 ul de milieu de montage pour le bien. Utilisez un milieu de montage pour transférer les rétines avec le P20 à la diapositive «pont» en verre.
5. Utilisez une pince à orienter (lentilles doivent faire face à la lame de verre) et aligner la rétine afin de faciliter l'imagerie. Si nécessaire, retirer les bulles d'air à la P20.
6. Lentementglissement lieu 24x40-1 couvercle (0,13 à 0,17 mm d'épaisseur) d'un côté sur le dessus et sceller les bords avec vernis à ongles ou du scotch. Conserver les échantillons à 4 ° C dans une boîte lame de microscope économiseur (garder dans le noir).

7. Les résultats représentatifs

A titre d'exemple de l'application de ce protocole, nous montrons des résultats représentatifs pour visualiser la différenciation des photorécepteurs dans les trois stades de développement dans la vidéo. Une larve eye-antennaire disque et une rétine midpupal ont été colorés avec des anticorps qui étiqueter types différents photorécepteurs au cours de leur développement (figure 1A, B) et une rétine adulte a été coloré avec des anticorps Rhodopsin deux sous-types de visualiser deux photorécepteurs (figure 1C).

Discussion

1. Dépannage

D'après notre expérience, les dissections requièrent de la pratique (plusieurs semaines) et sont facilitées par atteindre une position confortable à la main ²¹ par reposer les coudes et les avant-bras sur la table et avec les doigts en contact avec le plat de la dissection. De cette façon, les doigts, les pouces seulement, index et le majeur effectuer des mouvements subtils.

Retrait de la lame sans endommager les photorécepteurs e...

matériels

			Réactif
Tampon phosphate salin (PBS1x, pH 7,4)	Sigma		Préparer la solution mère 10x 20. Diluer avec de l'eau distillée pour obtenir PBS 1x et stocker à température ambiante. Laisser refroidir dans la glace avant dissections.
Triton-X 100	Sigma	9002-93-1	Attention: Irritant Porter des gants. Préparer 50 ml 1xPBS avec 0,3% de Triton X-100 (PBST). Conservez-la à température ambiante.
Solution de formaldéhyde à 37%	Fisher Scientific	F75P1GAL	Attention: toxique, cancérogène probable pour l'homme Porter des gants. Avant l'étape de fixation, fraîchement préparer une solution à 3,7% dans une hotte en diluant avec du PBS, magasin sur la glace.
5% de sérum normal de cheval	Jackson Immuno Research	008-000-001	Préparer 5% v / v de dilution dans du PBST. Conservez-la à quatre degrés.
Les anticorps primaires et secondaires (p. ex âne anti-mouton Alexa Fluor 488, Donkey anti-lapin Alexa Fluor 555, âne anti-souris Alexa Fluor 647)	Les sondes moléculaires Invitrogen	A11015 A31572 A31571	Diluer Anticorps secondaires 1:800 dans du PBST et conserver à quatre degrés.
Alexa Fluor 488 Phalloidin		A12379	Diluer à 1:100 dans une solution d'anticorps secondaire.
Réactif Slowfade Antifade Or	Les sondes moléculaires Invitrogen	S36936	Milieu de montage. Conserver à -20 degrés.
Glycerol	Fisher Scientific	G31-1	Pour le montage. Préparer 10 ml de dilution à 50% avec de l'eau, magasin distillée à la température ambiante.
CO 2			Pour anesthésier les mouches adultes.
			Équipement
Deux pinces pointues (Dumont # 55)	Outils Fine Science	11255-20
Sylgard 184 Kit élastomère silicone	Dow Corning		Préparer plat dissection Sylgard en remplissant un plat de Petri en plastique avec le mélange Sylgard.
Trois puits plats dissection de verre	Fisher Scientific	21-379
Two broches minuties de dissection (0,1 mm de diamètre) et deux pinholders (12 cm)	Outils Fine Science	26002-10	Insérer une broche de minuties dans chacun des deux pinholders et plier une des repères pour former un crochet.
Lamelles de microscope (22x22-1 et 24x40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Lames de microscope (25x75x1.0 mm; préalablement nettoyé)	Fisher Scientific	12-550-143
Tubes de 1,5 ml microtubes
Effacer vernis à ongles ou du scotch
Agitateur orbital	Bellco
Boîte de support de diapositives	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
Pinceau mince
P20 et P200 micropipette et de
Microscope à dissection
Petit seau avec de la glace			Pour refroidir les plaques de verre, ainsi disséquées rétine et les solutions.