Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

النانوية النبات الفيروسية (VNPs) واعدة منصات لتقديم الطلبات في الطب الحيوي. هنا، نحن تصف الإجراءات لإكثار النبات VNP، وتنقية وتوصيف، وbioconjugation. وأخيرا، وتبين لنا تطبيق VNPs لصاروخ موجه الورم والتصوير باستخدام نموذج طعم أجنبي الماوس والتصوير مضان.

Abstract

استخدام المواد النانوية لديه القدرة على إحداث ثورة في مواد العلوم والطب. ويجري حاليا التحقيق في عدد من الجسيمات النانوية لتطبيقات مختلفة في مجال التصوير والعلاج. ويمكن اعتبار النانوية الفيروسية (VNPs) المشتقة من النباتات عن النفس تجميعها bionanomaterials مع أحجام محددة والأشكال. الفيروسات النباتية قيد التحقيق في المختبر شتاينميتز تشمل الجسيمات متعدد السطوح التي شكلتها فيروس تبرقش اللوبيا (CPMV) وفيروس تبرقش بروم (BMV)، وكلاهما 30 نانومتر في القطر. نحن نعمل على تطوير الهياكل أيضا على شكل قضيب والخيطية المستمدة من الفيروسات النباتية التالية: فيروس موزاييك التبغ (TMV)، والتي تشكل قضبان جامدة مع أبعاد 300 نانومتر بنسبة 18 نانومتر، والبطاطا X فيروس (PVX)، والتي تشكل الجزيئات الخيطية 515 نانومتر في الطول و 13 نانومتر في العرض (ويشار إلى القارئ الحكام. 1 و 2 لمزيد من المعلومات عن VNPs).

> من وجهة عالم المواد وجهة نظر، VNPs هي اللبنات جذابة لأسباب عدة: الجزيئات monodisperse، يمكن أن تنتج بسهولة على نطاق واسع في بلانتا، مستقرة للغاية، وحيويا. أيضا، VNPs هي "برمجة" وحدات، والتي صممت خصيصا يمكن استخدام أساليب التعديل الوراثي أو bioconjugation الكيميائية 3. ومن المعروف أن هيكل VNPs بالقرار الذرية، ويمكن أن يتم من تعديلات بدقة المكانية على المستوى الذري 4، مستوى من التحكم الذي لا يمكن أن يتحقق باستخدام المواد النانوية الاصطناعية مع تقنيات للدولة من بين الفن الحالي.

في هذه الورقة، ونحن تصف نشر CPMV، PVX، TMV، وBMV في ungiuculata فيجنا النباتات ونيكوتيانا benthamiana. وترد استخراج وتنقية بروتوكولات لكل VNP. يتم وصف طرق لتوصيف وتنقية VNPs كيميائيا المسمى. في هذه الدراسة، ونحن نركز على الفصلemical وسم VNPs مع fluorophores (مثل اليكسا فلور 647) والبولي ايثيلين جلايكول (PEG). الأصباغ تسهيل تتبع والكشف عن VNPs 5-10، ويقلل PEG المناعية البروتينية من الجسيمات النانوية مع تعزيز الدوائية من 8،11. علينا أن نبرهن الورم صاروخ موجه مضاد للفيروسات من VNPs باستخدام طعم أجنبي ورم نموذج الفأر. يتم استخدام مزيج من التصوير مضان من الأنسجة خارج الجسم باستخدام نظام تصوير مايسترو، الكمي مضان في الأنسجة المتجانس، والفحص المجهري متحد البؤر لدراسة biodistribution. يتم مسح VNPs عبر نظام شبكي بطاني (RES)؛ يتحقق الورم صاروخ موجه بشكل سلبي من خلال تعزيز النفاذية والاستبقاء (EPR) أثر 12. تكنولوجيا النانو هي قوية VNP المكونات وتلعب التكنولوجيا لصورة وعلاج المرض المواقع في الجسم الحي. نحن نعمل على تطوير المزيد من الشحنات للقيام VNPs المخدرات والأنصاف التصوير سريريا ذات الصلة، وكذلك بروابط الأنسجة محددة لاستهداف المستقبلات الجزيئية overexpressed في السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية.

Protocol

1. VNP (CPMV، BMV، PVX، وTMV) الدعوة

  1. تعيين غرفة النباتات الداخلية إلى 15 ساعة تتحكم اليوم (100٪ ضوء، 25 ° C والرطوبة 65٪) و 9 ساعة من الليل (ضوء 0٪، 22 ° C والرطوبة 60٪).
  2. تطعيم النباتات وفقا لجدول زمني في الجدول 1.
CPMV PVX، TMV، وBMV
اليوم 0: بذور اللوبيا النبات 3 / وعاء. اليوم 0: زيوت نباتية ~ 30 N. بذور benthamiana / وعاء. تسميد مرة في الأسبوع مع ملعقة الأسمدة 1/5 L المياه.
يوم 14: إعادة عاء N. benthamiana في 1 مصنع / وعاء.
يوم 10: تصيب الأوراق يترك الأولية مع CPMV (5 μg/50 ميكرولتر / نبات) عن طريق التلقيح الميكانيكي باستخدام ضوء الغبار من ساموري. يوم 28: تصيب ثلاثة إلى Fإيف يترك مع PVX، TMV، أو BMV (5 μg/50 ميكرولتر / نبات) عن طريق التلقيح الميكانيكي باستخدام ضوء الغبار من ساموري.
أوراق الحصاد وتخزينها في -80 درجة مئوية.: 20 يوما أوراق الحصاد وتخزينها في -80 درجة مئوية.: 42 يوما

الجدول 1. الجدول الزمني لزراعة واصابة، وحصاد الأوراق.

ملاحظة: ويتجلى فقط CPMV نشر كمثال على ذلك.

2. VNP (CPMV، BMV، PVX، وTMV) تنقية

ملاحظة: تتم جميع خطوات على الجليد أو من عند 4 ° C.

  1. 100 غرام من التجانس أوراق المجمدة في الخلاط القياسية باستخدام 2 مجلدات من العازلة الباردة (انظر الجدول 2). تصفية من خلال طبقات من القماش القطني 2-3.
  2. لPVX، وضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1 M. إضافة 0.2٪ (W / V) حمض الاسكوربيك و 0.2٪ (W / V) سلفي الصوديومالشركة المصرية للاتصالات.
  3. أجهزة الطرد المركزي الخام جناسة المصنع في 5500 x ج لمدة 20 دقيقة. جمع طاف.
  4. لBMV، طبقة 25 مل من طاف أكثر من 5 مل من 10٪ (W / V) حل السكروز. أجهزة الطرد المركزي في 9000 x ج لمدة ساعة الكريات و resuspend 3 في حل CSCL 38.5٪ (W / V). مزيج من الهز لمدة 5 ساعة، ثم تابع مع الخطوة 2.12.
  5. استخراج المواد النباتية عن طريق إضافة كميات من 0،7 1:1 (V / V) كلوروفورم :1-بيوتانول. يحرك الخليط لمدة 30-60 دقيقة.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 5500 XG حل لمدة 20 دقيقة. جمع المرحلة العليا مائي.
  7. إضافة كلوريد الصوديوم إلى 0.2 M و 8٪ (W / V) PEG (MW 8،000). لTMV، أيضا إضافة 1٪ (V / V) تريتون X-100. يحرك المزيج لمدة 1 ساعة على الأقل، ثم ترك الجلوس لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
  8. أجهزة الطرد المركزي الحل على 15،000 XG لمدة 15 دقيقة. إعادة تعليق بيليه في 10 مل من العازلة. لPVX، إضافة β-0.1٪ واليوريا المركابتويثانول إلى 0.5 M.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 30 دقيقة وجمع طاف.
  10. نابذة فائقة السرعة طاف في 160،000 XG لمدة 3 ساعة. إعادة تعليق بيليه في 5 مل يا العازلةvernight.
  11. إعداد التدرج السكروز 10-40٪ باستخدام كميات متساوية من 10٪، 20٪، 30٪، 40٪ والسكروز في المخزن المؤقت (أثقل الأول). تسمح التدرج لتتوازن بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  12. نابذة فائقة السرعة معلق بيليه خلال التدرج في السكروز 100،000 XG لمدة 2 ساعة (24 ساعة لBMV).
  13. جمع ضوء الفرقة والتشتت dialyze ضد العازلة.
  14. تميز VNPs (أدناه) وتخزينها في 4 درجات مئوية. على المدى الطويل تخزين، تخزين على -80 درجة مئوية.
CPMV وTMV 0،1 فوسفات البوتاسيوم M العازلة (درجة الحموضة 7.0)
38.5 مم KH 2 PO 4
61،5 ملي K 2 HPO 4
PVX 0.5 م العازلة بورات (الرقم الهيدروجيني 7.8)
0،5 حمض البوريك M
ضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم
BMV مؤسسة النقد العربي السعودي العازلة (درجة الحموضة 4.5)
250 خلات الصوديوم ملي
10 ملم MgCl 2
β-2 مم المركابتويثانول (إضافة جديدة)

الجدول 2. المخازن المؤقتة وصفات لكل VNP.

ملاحظة: ويتجلى فقط CPMV نشر كمثال على ذلك.

3. VNP (CPMV، BMV، PVX، وTMV) توصيف

  1. أداء التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية / المرئية لتحديد تركيز VNPs.
    1. قياس الامتصاصية من 2 ميكرولتر من العينة باستخدام الطيف NanoDrop.
    2. تحديد تركيز الجسيمات والأصباغ باستخدام قانون بير لامبرت (A = εcl، حيث A هي الامتصاص، هو ε معامل الانقراض، ج هو التركيز، وL هو طول المسار). طول المسار هو 0.1 سم لNanoDrop.
      معاملات الانقراض VNP محددة هي:
      CPMV: 8.1 سم -1 ملغ -1 مل (في 260 نانومتر)
      PVX: 2.97 سم -1 ملغ -1 مل (في 260 نانومتر)
      TMV: 3.0 سم -1 ملغ -1 مل (في 260 نانومتر)
      BMV: 5.15 سم -1 ملغ -1 مل (في 260 نانومتر)
  2. تحليل جزيئات من الحجم الاستبعاد اللوني السائل سريع البروتين (FPLC).
    1. باستخدام Superose-6 المساحة استبعاد العمود ومستكشف AKTA، تحميل 50-100 ميكروغرام من VNPs في 200 ميكرولتر من 0.1 M الفوسفات العازلة البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 7.0).
    2. تعيين إلى 260 نانومتر للكشف عن (الحمض النووي)، 280 نانومتر (البروتين)، والطول الموجي الإثارة في أي الأصباغ المرفقة.
    3. تشغيل بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة لمدة 72 دقيقة.
    4. الملف الشخصى شطف وA260: A280 نانومتر إلى ما إذا كان إعداد VNP هو محض وما إذا الجسيمات وتجميعها سليمة.
      وA260 التالية: 280 النسب تشير إلى إعداد VNP النقي:
      CPMV: 1.8 ± 0.1
      PVX: 1.2 ± 0.1
      TMV:1.1 ± 0.1
      BMV: 1.7 ± 0.1
  3. أداء يبدل طبيعة (ما قبل الصب NuPAGE) مكرر تريس بولكرلميد هلام الانحدار 4-12٪ الكهربائي لتحليل نقاء إعداد وتصريف البروتينات إلى معطف الفردية.
    1. أضف 3 مل من عينة العازلة 4X LDS إلى 10 ميكروغرام من الجزيئات في 9 ميكرولتر من العازلة الفوسفات البوتاسيوم. إضافة أكثر 1 ميكرولتر من العازلة عينة LDS 4X و 3 ميكرولتر من المركابتويثانول-β لBMV للحد من عدد كبير من السندات ثاني كبريتيد.
    2. احتضان في كتلة الحرارة لمدة 5 دقائق عند 100 ° C.
    3. تحميل عينات على هلام SDS ل.
    4. تشغيل العينات في 200 V ل1 ساعة في اجتماعات الأطراف 1X تشغيل المخزن المؤقت.
    5. توثيق هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور البروتينات الفلورية معطف.
    6. لغير الفلورسنت البروتين، وصمة عار مع الأزرق Coomassie (0.25٪ (W / V) Coomassie بريليانت الأزرق R-250، وحامض الخليك 30٪ (V / V) الميثانول، و 10٪ (V / V)) لمدة 1 ساعة.
    7. يزيل اللون مع الميثانول 30٪، حمض الخليك 10٪ بين عشية وضحاها. تشانجنرال الكتريك الحل إذا لزم الأمر.
    8. توثيق هلام تحت الضوء الأبيض.
  4. تحليل سلامة الجزيئات بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (TEM).
    1. تخفيف العينات إلى 0،1-1 ملغ / مل في 20 ميكرولتر من المياه DI.
    2. وضع 20 قطرات ميكرولتر من العينات على Parafilm.
    3. تغطية قطرات مع شبكة TEM والسماح الجلوس لمدة 2 دقيقة. الفتيل من الحل الزائدة على الشبكة مع ورقة الترشيح.
    4. غسل الشبكة عن طريق وضع على قطرة ماء ثم فتل DI الجافة.
    5. وصمة عار على الشبكة عن طريق وضع بنسبة 20 ميكرولتر من 2٪ (W / V) خلات اليورانيل لمدة 2 دقيقة. الفتيل قبالة الزائدة وصمة عار مع ورق الترشيح.
    6. غسل الشبكة مرة أخرى في الماء.
    7. مراقبة الشبكة تحت الميكروسكوب الالكترونى النافذ.

4. اقتران الكيميائي للVNPs مع PEG وFluorophores وتنقية، وتوصيف

  1. لإجراء العمليات الحسابية لردود الفعل أدناه، كتلة مولية من VNPs هي:
    CPMV: 5.6× 10 6 ز / مول
    PVX: 35 × 10 6 ز / مول
    TMV: 41 × 10 6 ز / مول
    BMV: 4.6 × 10 6 ز / مول
  2. المتقارن الأصباغ وPEG لlysines سطح CPMV وPVX باستخدام خطوة واحدة N-هيدروكسي succinimide رد فعل اقتران: 2500 إضافة حكمه المولي (جميع التجاوزات المولي المولي تشير إلى فائض في VNP) من فلور اليكسا استر succinimidyl 647 و 4،500 من شبه NHS- PEG (MW 5،000) الذائبة في DMSO لCPMV في 0.1 M البوتاسيوم العازلة الفوسفات. عند العمل مع PVX، إضافة الزائدة 10000 ضرس NHS صباغة وNHS PEG-. ضبط كميات العازلة وDMSO بحيث تركيز النهائي من CPMV وPVX هو 2 ملغ / مل DMSO والمحتوى هو 10٪ من إجمالي حجم رد الفعل. احتضان خليط التفاعل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء. CPMV وPVX تضم 300 و1270 lysines عنونة، على التوالي. (ويشار إلى القارئ إلى المراجع التالية لمزيد من القراءة علىالتعديل الكيميائي للCPMV وPVX: 13-15).
  3. والأصباغ المتقارن PEG لtyrosines من TMV من اقتران الديازونيوم تليها النحاس (I)-حفز أزيد-الكاين الاضافه الحلقيه.
    1. إعداد الملح الديازونيوم (الكاين) عن طريق خلط 400 ميكرولتر من 0.3 M حمض مونوهيدرات ف تولوين، 25 ميكرولتر من النتريت 3،0 الصوديوم M، و 75 ميكرولتر من المقطر 0.68 M 3 ethynylaniline الذائبة في الأسيتونيتريل في C ° 4 ل 1 ساعة.
    2. إضافة 3.3 مل من بورات العازلة، ودرجة الحموضة 8.8، يحتوي على 100 ملي كلوريد الصوديوم إلى 1.25 مل من TMV (20 ملغ / مل محلول المخزون).
    3. الرد على TMV مع 450 ميكرولتر من محلول الديازونيوم (الكاين) الملح في حمام الثلج لمدة 3 ساعة إضافة إلى ربط الكاين التعامل مع TMV من اقتران الديازونيوم. سوف تتحول إلى الحل اللون البني الفاتح. TMV و2140 tyrosines المتاحة للاقتران.
    4. تنقية المنتج النهائي باستخدام وسادة السكروز كما هو موضح في الخطوة 4.4.
    5. إرفاق أزيد الوظائف اليكسا فلور 647 وPEG-أزيد (MW 5،000) النقيبز النحاس (I)-حفز أزيد-الكاين الاضافه الحلقيه (CuAAC). إضافة 2 حكمه صبغة وPEG-أزيد في معطف البروتين واحتضان مع كبريتات النحاس 1 ملم 4، 2 AMG ملم، و 2 مم أسكوربات الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ضبط مستوى الصوت العازلة مثل أن تركيز النهائي من رد فعل TMV هو 2 ملغ / مل. (ويشار إلى القارئ إلى المراجع التالية لمزيد من القراءة على التعديل الكيميائي للTMV: 16،17).
  4. المتقارن الأصباغ لlysines وPEG لcysteines من BMV السيستين متحولة (cBMV):
    1. إضافة حكمه المولي من 2000 استر ولاية أوريغون 488 الأخضر succinimidyl الذائبة في DMSO لcBMV في 0.1 M TNKM العازلة (50 ملي تريس قاعدة، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 5 ملم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.4). ضبط كميات العازلة وDMSO بحيث تركيز النهائي من BMV هو 1 ملغ / مل DMSO والمحتوى هو 10٪ من إجمالي حجم رد الفعل. احتضان خليط التفاعل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
    2. تنقية الجزيئات باستخدام centriمرشحات الفطريات والطفيليات كما هو موضح في الخطوة 4.4.
    3. إضافة 2000 الزائد من المولي PEG-maleimide (MW 2،000) باستخدام نفس ظروف التفاعل كما كان من قبل واحتضان الخليط لمدة 2 ساعة رد فعل عند 4 ° C. cBMV عنده 180 lysines رد الفعل وcysteines. (ويشار إلى القارئ إلى المراجع التالية لمزيد من القراءة على التعديل الكيميائي للBMV: 18).
  5. تنقية: تمرير الحل من خلال وسادة السكروز 40٪ (W / V) في مقابل 2.5 XG 160000 ساعة. إعادة حل بيليه في المخزن المؤقت. بدلا من ذلك، dialyze ضد العازلة المناسبة باستخدام 10 كيلو دالتون مرشحات تدور قطع.
  6. توصيف: يتم تحليل VNPs مضاد للفيروسات وfluorescently المسمى التي تستخدم الأساليب المذكورة أعلاه: UV / مرئية التحليل الطيفي، SDS الكهربائي للهلام، FPLC، وTEM (لا يظهر، ومع ذلك، تشير إلى أرقام 6 و 7).

5. الاستهداف الورم والتصوير باستخدام نموذج طعم أجنبي ماوس

  1. ثقافة HT-29 سرطان القولون خلايا الإنسان في المتوسط ​​RPMI تستكمل مع 5٪ FBS C 1٪ البنسلين الستربتوميسين، و 1٪ الجلوتامين L-عند 37 درجة، في 5٪ CO 2 باستخدام 175 الثقافة الخلية 2 القوارير.
  2. غسل الخلايا مرتين مع PBS معقمة والحصاد من قبل تفرخ مع 5 مل من التربسين EDTA-C ° 37 في لمدة 5 دقائق. إبطال نشاط التربسين مع 5 مل من المتوسط ​​RPMI. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. في 4 درجات مئوية و resuspend RPMI في جديدة على 5x10 المتوسطة cells/50 6 ميكرولتر (تحديد إجمالي عدد خلايا باستخدام عدادة الكريات التريبان الأزرق وأ). الاختلاط مع حجم مساو من matrigel قبل الحقن (منع جميع الحلول والكواشف عقيمة).
  3. شراء ستة أسابيع من العمر NCR نو / نو الفئران والمحافظة عليها على نظام غذائي البرسيم مجانا لمدة 2 اسابيع. [ملاحظة: جميع الإجراءات الحيوان يجب أن يكون وافق IACUC] تحفز الأعضاء المستمدة من الحيوانات الورم عن طريق الحقن تحت الجلد من 5x10 6 cells/100 ميكرولتر / ورم في جنباته (2 الأورام / الماوس) باستخدام مقياس 18 1/2 العقيمةإبرة. رصد الحيوانات بانتظام. قياس حجم الورم باستخدام الفرجار والسماح للأورام لتنمو إلى حجم متوسط ​​20 مم 3 (في غضون الأيام ال 12 المقبلة). تعيين الفئران إلى مجموعتين بشكل عشوائي مختلفة: PBS وVNP (ن = 3 حيوانات / مجموعة / الوقت نقطة). باستخدام مقياس 1 مل 28 حقنة الأنسولين، عن طريق الوريد إدارة ميكرولتر الوريد ذيل 100 حقن معقمة PBS أو 10 VNP صياغة ملغم / كغم.

ملاحظة: لن تجارب زراعة الأنسجة والدراسات مع الحيوانات الحية أن تظهر. التدريب العملي على مظاهرة سوف يكون مقصورا على معالجة الأنسجة والحصول على البيانات. للإشارة على الورم HT-29 نموذج طعم أجنبي، وعلى القارئ الرجوع إلى المرجع 19

وتستخدم ثلاث تقنيات لتقييم الورم صاروخ موجه من VNPs:

  1. مضان التصوير باستخدام نظام تصوير مايسترو: الفئران النحر في نقاط زمنية مختلفة (2، 24، و 72 ساعة) باستخدام CO 2الغاز. تشريح الحيوانات والمكوس جميع الأجهزة الرئيسية (الدماغ والقلب والرئتين والطحال والكلى والكبد) مع الأورام على الجناحين، ضع الأنسجة على parafilm، وتحليل الصك مع التصوير مضان باستخدام الإثارة الصفراء والمرشحات الانبعاثات (800 مللي التعرض) للكشف عن وجود إشارات الفلورسنت في الأنسجة (المستمدة من A647 إلى تسمية مترافق VNPs). حفظ الصور وتحليل شدة الفلورسنت باستخدام يماغيج 1.44o البرمجيات ( http://imagej.nih.gov/ij ). مقارنة نمط من امتصاص VNPs في الأورام مع الأنسجة الرئيسية الأخرى مع مرور الوقت.
  2. بعد التصوير، وقطع كل الأنسجة في نصف ونصف في تضمين مجمع أكتوبر للتحليل البرد باجتزاء ومتحد البؤر. جمع النصف الآخر في مرحلة ما قبل وزنه البرد قوارير وتجمد على الفور لهم باستخدام السائل N 2. المحل في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لمزيد من المعالجة.
  3. مضان الكمي: إعادةالحبل الأنسجة الأوزان. ذوبان الجليد الأنسجة المجمدة في درجة حرارة الغرفة ووضعها في أنابيب منفصلة 50 مل فالكون يحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني. باستخدام الخالط الأنسجة محمول وتجانس الأنسجة لمدة 2-3 دقيقة في PBS ثم نقل إلى أنابيب جناسة microfuge. أجهزة الطرد المركزي في الخليط لمدة 10 دقيقة في 13000 XG لإزالة غير المتجانس الأنسجة.
  4. الماصة 100 ميكرولتر من طاف من الأنسجة من كل مجموعة (PBS VNP وتركيبات / نقاط زمنية) في لوحة سوداء UV 384 أيضا. تقييم كثافة مضان (م ت / م الأطوال الموجية 600/665) باستخدام قارئ لوحة. تطبيع القيم التي تم الحصول عليها من قبل الفلورسنت الأوزان الأنسجة.
  5. المناعية: إعداد البرد مشراح أقسام (10 ميكرون) وتخزينها في -20 درجة C. وصمة عار أقسام الأنسجة لنوى الخلايا (دابي) وعلامة الخلية البطانية (FITC التي تحمل علامات الماوس المضادة للأجسام المضادة CD31). تنفيذ التحليل المجهري متحد البؤر لتعيين توطين الأوعية الدموية داخل الورم و-OF-VNP fluorescently المسمىق.

ملاحظة: لن يتم هذا الإجراء أثبت، وتظهر بيانات تمثيلية في الشكل 8. للإشارة على والطرق المناعية تلطيخ وصفها، وعلى القارئ الرجوع إلى المرجع 19

النتائج

figure-results-63
Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول نهج للالتعديل الكيميائي للVNPs وتطبيقاتها في مجال التصوير للورم الجسم الحي. تقنيات التصوير مضان الحيوان، الكمي مضان، والمناعية المقدمة هنا هي مفيدة لدراسة وتقييم الورم biodistribution صاروخ موجه. هذه التقنيات توفر معلومات قيمة فيما يتعلق بالوص...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIBIB EB009105 R00 المنح (لNFS) وEB011317 P30 (لNFS)، والمعاهد الوطنية للصحة / NIBIB التدريب منحة T32 EB007509 (لAMW)، وجامعة كيس وسترن ريزيرف للاستثمار التحالف التخصصات المنحة (لNFS)، وحالة المركز الشامل للسرطان P30 CA043703 منحة (لNFS). نشكر مختبر الباحثين شتاينميتز الطالب الجامعي لأيديهم على الدعم: نادية آيت، كيفن تشن، سوراف (SID) داي، أليس يانغ، ألكسندر سام، كريغ كروز D'، ستيفن هيرن، راندولف لورين، بريان لذلك، وبول Chariou .

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material NameCompanyCatalogue numberComments (optional)
   VNP production
Indoor plant chamberPercival ScientificE-41L2 
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5)Burpee51771A 
N. benthamiana seeds  N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
CarborundumFisherC192-500 
Pro-mix BX potting soilPremier Horticulture713400 
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite FertilizerJR Peters77860 
   Equipment
50.2 Ti rotorBeckman337901 
SW 32 Ti rotorBeckman369694 
Optima L-90K ultracentrifugeBeckman365672 
SLA-3000 rotorThermo Scientific07149 
SS-34 rotorThermo Scientific28020 
Sorvall RC-6 Plus centrifugeThermo Scientific46910 
Polypropylene bottleBeckman355607For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottleBeckman357002For SS-34 rotor
Ultra-Clear tubeBeckman344058For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottleBeckman355618For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometerThermo ScientificNanoDrop2000c 
PowerEase 500 pre-cast gel systemInvitrogenEI8675EU 
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion columnGE Healthcare17-5172-01 
ÄKTA Explorer 100 ChromatographGE Healthcare28-4062-66 
Allegra X-12RBeckman392302Benchtop centrifuge
CryostatLeicaCM1850 
Maestro 2Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-TearorBiospec Products985370-395 
Microplate readerTecanInfinite-200 
Transmission electron microscopeZEISSLibra 200FE 
FluoView laser scanning confocal microscopeOlympusFV1000 
   Chemicals and Reagents
3-ethynylanilineSigma Aldrich498289-5G 
384 well black plateBD Biosciences353285 
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gelInvitrogenNP0321BOX 
4X LDS sample bufferInvitrogenNP0008 
Acetic AcidFisherA385-500 
AcetonitrileSigma Aldrich271004-1L 
Alexa Fluor 647 azideInvitrogenA10277 
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20006 
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal FiltersMilliporeUFC50109610 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochlorideAcros Organics36891-0250 
Boric acidFisherA74-500 
Coomassie Brilliant Blue R-250FisherBP101-25 
CsClAcros Organics42285-1000 
DAPIMP Biomedicals157574 
Dimethyl sulfoxideFisherBP231-100 
Filter paperFisher09-801KP5 grade
FITC anti-mouse CD31BioLegend102406 
Goat serumInvitrogen16210-064 
KClFisherBP366-500 
L-ascorbic acid sodium saltAcros Organics35268-0050 
MethanolFisherA412P-4 
MgCl2FisherBP214-500 
Microscope slidesFisher12-544-3 
Microscope cover glassVWR48366-277 
MOPS bufferInvitrogenNP0001 
mPEG-malNanocsPG1-ML-2kMW 2000
mPEG-N3NanocsPG1-AZ-5kMW 5000
mPEG-NHSNanocsPG1-SC-5kMW 5000
NaClFisherBP358-212 
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer*InvitrogenO-6149 
p-toluenesulfonic acid monohydrateAcros Organics13902-0050 
PermountFisherSP15-100 
Potassium phosphate dibasicFisherBP363-1 
Potassium phosphate monobasicFisherBP362-1 
Sodium acetateFisherBP333-500 
Sodium nitriteAcros Organics42435-0050 
Sodium sulfiteAmresco0628-500G 
SucroseFisherS6-500 
TEM gridTed PellaFCF-400Cu 
Tris baseFisherBP152-500 
Triton X-100EMD ChemicalsTX1568-1 
β-mercaptoethanolFisherO3446I-100 
   Tissue Culture
Fetal bovine serumInvitrogen12483-020 
HemocytometerFisher0267110 
HT-29 cellsATCCHTB-38 
L-glutamineInvitrogen25030-080 
PBSCellgro21-040-CV 
Penicillin-streptomycinInvitrogen10378-016 
RPMI-1640Invitrogen31800-089 
Tissue culture flasksCorning431080175 cm2
Trypan BlueThermo ScientificSV30084.01 
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquidInvitrogen25300-054 
   Animal Studies
18% Protein Rodent DietHarlan TekladTeklad Global 2018SAlfalfa free diet
Insulin syringeBD Biosciences32941028 gauge
IsofluraneBaxterAHN3637 
Matrigel Matrix basement membraneBD Biosciences356234 
NCR nu/nu mice  CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringeBD Biosciences30519618 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT CompoundAndwin Scientific4583 

References

  1. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  2. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  3. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  4. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
  5. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  6. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  7. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  8. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  9. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  10. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  11. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  12. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  13. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  14. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  15. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  16. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  17. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
  18. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  19. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
  20. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

69 bioconjugate

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved