חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

Summary

חלקיקים נגיפיים צמח (VNPs) מבטיחים פלטפורמות ליישומים ביו. כאן, אנו מתארים את ההליכים להתפשטות צמח VNP, טיהור, אפיון, וbioconjugation. לבסוף, אנו מראים את היישום של VNPs לביות והדמית גידול תוך שימוש במודל עכבר xenograft ודימות פלואורסצנטי.

Abstract

השימוש של ננו יש פוטנציאל לחולל מהפכה במדע וברפואת חומרים. נכון לעכשיו, מספר החלקיקים שונים הנחקרים בחשד ליישומים בתחום הדמיה וטיפול. חלקיקים נגיפיים (VNPs) המופקים מצמחים יכולים להיחשב bionanomaterials עצמי התאסף עם גדלים וצורות מוגדרות. וירוסי צמחים נחקרים במעבדת שטיינמץ כוללים חלקיקי icosahedral נוצרו על ידי וירוס Cowpea פסיפס (CPMV) ונגיף פסיפס Brome (BMV), אשר שניהם הם 30 ננומטר בקוטר. אנחנו גם בפיתוח מבני מוט בצורה ופילמנטיות נגזרים מוירוסי הצמחים הבאים: וירוס טבק פסיפס (TMV), המהווה מוטות נוקשות עם ממדים של 300 ננומטר על 18 ננומטר, ותפו"א וירוס X (PVX), שיצירת חלקיקים פילמנטיות 515 ננומטר באורך 13 ננומטר ברוחב (הקורא התייחס לשופטים. ¹ ו ² למידע נוסף על VNPs).

> מנקודת מבטו של מדען חומרים של נוף, VNPs הם אבני בניין אטרקטיביים מכמה סיבות: החלקיקים הם monodisperse, ניתן לייצר בקלות בקנה מידה גדול בPlanta, הם במיוחד יציבים, ולא ביולוגיים. כמו כן, VNPs הם יחידות "לתכנות", אשר יכולה להיות מהונדסת במיוחד באמצעות הנדסה גנטית או בשיטות כימיות bioconjugation ^3. מבנה VNPs ידוע רזולוציה אטומית, ושינויים יכולים להתבצע עם דיוק המרחבי ברמה האטומית ^4, רמת שליטה שלא ניתן להשיג באמצעות ננו הסינטטי עם נוכחיות טכנולוגיות מדינה-of-the-art.

במאמר זה, אנו מתארים את ההתפשטות של CPMV, PVX, TMV, וBMV בצמחי Nicotiana benthamiana Vigna ungiuculata ו. פרוטוקולי שאיבה וטיהור לכל VNP מקבלים. שיטות לאפיון של מטוהרים וVNPs כותרת-כימית מתוארות. במחקר זה, אנו מתמקדים בפרקתיוג emical של VNPs עם fluorophores (למשל Alexa פלואוריד 647) ופוליאתילן גליקול (PEG). את הצבעים להקל על מעקב וזיהוי של VNPs ^5-10, וPEG מפחית חיסוני של החלקיקים חלבוניים תוך שיפור הפרמקוקינטיקה ^8,11. אנו מראים גידול ביות של VNPs PEGylated באמצעות מודל גידול xenograft עכבר. שילוב של דימות פלואורסצנטי של הרקמות vivo לשעבר באמצעות מערכת הדמית מאסטרו, כימות קרינה ברקמות הומוגניזציה, ומיקרוסקופיה confocal משמש ללמוד biodistribution. VNPs נמחקים באמצעות מערכת reticuloendothelial (מיל '); גידול ביות מושגת באופן פסיבי באמצעות חדירות המשופרות ושמירת האפקט (EPR) ^12. ננוטכנולוגיה VNP היא חזק plug-and-לשחק טכנולוגיה לתמונה ולטפל באתרים של מחלה בגוף חי. בנוסף, אנו מפתחים VNPs לשאת מטעני סמים וmoieties הדמיה הרלוונטי קליני-, כמו גם ligands רקמות ספציפיות ללמקד קולטנים מולקולריים overexpressed בסרטן ומחלות לב וכלי דם.

Protocol

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, וTMV) רבייה

1. הגדר את תא הצמח המקורה שולט עד 15 שעות ביום (אור 100%, 25 ° C, לחות 65%) ו 9 שעות של הלילה (אור 0%, 22 ° C, לחות 60%).
2. לחסן צמחים בהתאם ללוחות הזמנים בטבלה 1.

CPMV	PVX, TMV, וBMV
יום 0: הצמח 3 cowpea זרעים / סיר.	יום 0: צמח ~ 30 זרעי N. benthamiana / סיר. לדשן פעם בשבוע עם דשן 1 כף / מים 5 ליטר.
	יום 14: Re-סיר נ benthamiana במפעל 1 / סיר.
יום 10: להדביק עלי עלים ראשוניים עם CPMV (5 μg/50 μl / עלה) על ידי הדבקה מכאנית באמצעות שכבה דקה של carborundum.	יום 28: להדביק שלוש עד five עוזב עם PVX, TMV, או BMV (5 μg/50 μl / עלה) על ידי הדבקה מכאנית באמצעות שכבה דקה של carborundum.
עלי הקציר ולאחסן ב-80 ° C.: 20 היום	עלי הקציר ולאחסן ב-80 ° C.: יום 42

טבלה 1. ציר זמן לגידול, מדביק, וקצירת עלים.

הערה: ריבוי CPMV רק הוכיח כדוגמה.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, וTMV) טיהור

הערה: כל הפעולות נעשית על קרח או ב 4 ° C.

1. הומוגני 100 גרמו עלים קפוא בבלנדר רגיל באמצעות 2 כרכים של חיץ קר (ראה טבלה 2). לסנן דרך 2-3 שכבות של אריג.
2. לPVX, להתאים pH ל -6.5 בעזרת 1 M HCl. הוסף 0.2% (w / v) חומצה אסקורבית ו0.2% (w / v) נתרן sulfiטה.
3. צנטריפוגה homogenate צמח הגולמי ב 5500 XG במשך 20 דקות. איסוף supernatant.
4. לBMV, שכבת 25 מ"ל של supernatant מעל 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז 10% (w / v). צנטריפוגה XG ב 9000 במשך 3 כדורי hr וresuspend ב 38.5% פתרון CsCl (W / V). מיקס ידי רעד במשך 5 שעות, ולאחר מכן להמשיך עם צעד 2.12.
5. חלץ חומר צמחי על ידי הוספת 0.7 כרכים של 1:1 (v / v) כלורופורם :1-butanol. מערבבי תערובת במשך 30-60 דקות.
6. צנטריפוגה פתרון ב5500 XG במשך 20 דקות. לאסוף את השלב המימי העליון.
7. הוסף לNaCl 0.2 מ 'ו 8% (w / v) PEG (MW 8000). לTMV, גם להוסיף% 1 (נ / v) טריטון X-100. מערבב לשעות לפחות 1, אז תן לו לשבת שעות לפחות 1.
8. צנטריפוגה פתרון ב15000 XG במשך 15 דקות. Resuspend גלול ב 10 מ"ל של חיץ. לPVX, מוסיף 0.1% β-mercaptoethanol ואוריאה ל -0.5 מ '
9. צנטריפוגה XG ב 8000 למשך 30 דקות ולאסוף supernatant.
10. Ultracentrifuge supernatant ב160.000 XG עבור 3 שעות. Resuspend גלול ב 5 מיליליטר החיץ overnight.
11. הכן 10-40% שיפוע סוכרוז באמצעות נפחים שווים של 10%, 20%, 30%, ו 40% סוכרוז במאגר (1 הכבד ביותר). אפשר השיפוע לאזן בין לילה בטמפרטורת חדר.
12. Ultracentrifuge resuspended גלולה מעל שיפוע סוכרוז ב100.000 XG ל2 שעות (24 שעות לBMV).
13. איסוף להקת פיזור אור ודיאליזה נגד מאגר.
14. לאפיין את VNPs (להלן) ולאחסן ב 4 ° C. עבור אחסון לטווח ארוך, לאחסן ב-80 ° C.

CPMV וTMV	חיץ 0.1 מ 'אשלגן פוספט (pH 7.0) 38.5 mM KH 2 PO 4 61.5 mM K 2 HPO 4
PVX	0.5 מ 'borate החיץ (pH 7.8) 0.5 חומצה בורה M התאם pH עם NaOH
BMV	סמה חיץ (pH 4.5) 25יצטטו נתרן 0 mm 10 mM MgCl 2 2 מ"מ β-mercaptoethanol (להוסיף צח)

טבלת 2. Buffers והמתכונים שלהם לכל VNP.

הערה: ריבוי CPMV רק הוכיח כדוגמה.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, וTMV) אפיון

1. בצע ספקטרוסקופית UV / גלויה כדי לקבוע את הריכוז של VNPs.
   1. מדוד את הספיגה של 2 μl של מדגם באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.
   2. לקבוע את הריכוז של חלקיקים וצבעים באמצעות חוק באר למברט (= εcl, שם הוא ספיגת ε הוא מקדם ההכחדה, c הוא הריכוז, ואני הוא אורך הדרך). אורך המסלול הוא 0.1 סנטימטר לNanoDrop.
      מקדמי הכחדת VNP הספציפיים הם:
      CPMV: 8.1 סנטימטר ^-1 מ"ג ^-1 מ"ל (ב260 ננומטר)
      PVX: 2.97 סנטימטר ^-1 מ"ג ^-1 מ"ל (ב260 ננומטר)
      TMV: 3.0 סנטימטר ^-1 מ"ג ^-1 מ"ל (ב260 ננומטר)
      BMV: 5.15 סנטימטר ^-1 מ"ג ^-1 מ"ל (ב260 ננומטר)
2. נתח חלקיקים על ידי כרומטוגרפיה גודל הדרה מהר חלבון נוזלי (FPLC).
   1. באמצעות 6 עמודת גודל הדרת Superose ויקטע Explorer, 50-100 מיקרוגרם העומס של VNPs ב200 μl של חיץ 0.1 מ 'אשלגן פוספט (pH 7.0).
   2. הגדרת גלאים עד 260 ננומטר (חומצות גרעין), 280 ננומטר (חלבון), ואורך גל העירור של כל צבעים מצורפים.
   3. לרוץ בקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה במשך 72 דקות.
   4. פרופיל elution וA260: A280 ננומטר מציינים אם הכנת VNP היא טהורה ואם חלקיקים הם שלמים ומורכב.
      A260 הבא: 280 יחסים מצביעים הכנת VNP טהורה:
      CPMV: 1.8 ± 0.1
      PVX: 1.2 ± 0.1
      TMV:1.1 ± 0.1
      BMV: 1.7 ± 0.1
3. בצע denaturing (הטרומי NuPAGE) 4-12% אלקטרופורזה Bis-טריס polyacrylamide שיפוע ג'ל לנתח טוהר ההכנה והצמיד לחלבוני מעייל בודדים.
   1. הוסף 3 מ"ל של חיץ מדגם LDS 4x עד 10 מיקרוגרם של החלקיקים ב9 μl של חיץ פוספט אשלגן. הוסף μl נוסף 1 של חיץ 4x LDS מדגם ו 3 μl של β-mercaptoethanol לBMV כדי לצמצם את המספר הגבוה של איגרות חוב דיסולפיד.
   2. דגירה בבלוק חום למשך 5 דקות ב 100 ° C.
   3. טען דגימות על ג'ל SDS.
   4. הפעל דגימות ב 200 V עבור 1 שעה ב1x מגבים רצים חיץ.
   5. לתעד את הג'ל תחת אור UV לדמיין חלבוני מעייל ניאון.
   6. לחלבון שאינו ניאון, כתם עם Coomassie כחול (0.25% (w / v) Coomassie בריליאנט בלו R-250, 30% (v / v) מתנול, 10% (v / v) חומצה אצטית) לשעה 1.
   7. Destain עם מתנול 30%, 10% חומצה אצטית בן לילה. צ'אןge הפתרון במידת צורך.
   8. לתעד את הג'ל תחת אור לבן.
4. נתח את היושרה של חלקיקים על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (TEM).
   1. לדלל דגימות ל0.1-1 מ"ג / מ"ל ​​ב20 μl מי DI.
   2. הנח 20 טיפי μl של דגימות על Parafilm.
   3. כיסוי טיפין עם רשת TEM ותן לו לשבת 2 דקות. פתילה את הפתרון העודף על הרשת עם נייר סינון.
   4. שטוף את הרשת על ידי צבת על טיפת מי DI אז פתילה יבשה.
   5. כתם רשת על ידי צבת על ירידה של 20 μl של 2% (w / v) תצטט uranyl עבור 2 דקות. פתילה את עודפי כתם עם נייר סינון.
   6. שטוף את הרשת פעם נוספת במים.
   7. ציית לרשת מתחת למיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

4. נטייה כימית של VNPs עם PEG וfluorophores, טיהור, ואפיון

1. לחישובים לתגובות למטה, במבנה השן של VNPs הם:
   CPMV: 5.6x 10 ⁶ ג'/ mol
   PVX: 35 x 10 ⁶ ג'/ mol
   TMV: 41 x 10 ⁶ ג'/ mol
   BMV: 4.6 x 10 ⁶ ג'/ mol
2. צמד צבעים וPEG לlysines פני השטח של CPMV וPVX באמצעות צעד אחד succinimide תגובת N-הידרוקסי צימוד: הוסף 2500 שווים טוחנת (כל ההגזמות הטוחנות מתייחסות לעודף טוחן לVNP) של אסתר Alexa פלואוריד 647 succinimidyl ו4500 שווים של NHS- PEG (MW 5000) מומס DMSO לCPMV בחיץ פוספט אשלגן M 0.1. כאשר עובדים עם PVX, להוסיף עודף 10,000 טוחנות של NHS-צבע וNHS-PEG. התאם את כרכי חיץ וDMSO כאלה שהריכוז הסופי של CPMV וPVX הוא 2 מ"ג / מ"ל ​​ותוכן DMSO הוא 10% מהיקף התגובה הכולל. דגירת תגובת התערובת למשך הלילה בטמפרטורת חדר המוגן מפני אור. CPMV וPVX לנו 300 ו1270 lysines מיעון, בהתאמה. (הקורא התייחס להערות הבאות לקריאה נוספת עלשינוי כימי של CPMV וPVX: ^13-15).
3. צבעים צמודים ופג tyrosines של TMV על ידי צימוד diazonium אחריו נחושת (אני)-הקטליזאטור cycloaddition יזיד-alkyne.
   1. הכן מלח diazonium (alkyne) על ידי ערבוב של 400 μl monohydrate 0.3 מ 'p-toluenesulfonic חומצה, 25 μl של הניטריט נתרן M 3.0, ו 75 μl של 0.68 M מזוקק 3-ethynylaniline מומס באצטוניטריל ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
   2. הוסף 3.3 מ"ל של חיץ borate, 8.8 pH, המכיל 100 mM NaCl ל -1.25 מ"ל של TMV (20 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות).
   3. מגיב TMV עם 450 μl של מלח פתרון diazonium (alkyne) באמבט קרח ל3 שעות להוסיף קשירת alkyne להתמודד לTMV ידי צימוד diazonium. הפתרון יהפוך לצבע חום בהיר. TMV יש 2140 tyrosines זמין עבור הצמיד.
   4. לטהר את המוצר הסופי בעזרת כרית סוכרוז כמתואר בשלב 4.4.
   5. צרף Alexa פלואוריד 647 יזידו תפקודיים וPEG-יזיד (MW 5000) usinנחושת גרם (אני)-הקטליזאטור cycloaddition יזיד-alkyne (CuAAC). מוסיף 2 שווים של צבע וPEG-תזיד לחלבון מעייל ולדגור עם 1 mM CuSO _4, AMG 2 מ"מ, וascorbate 2 מ"מ נתרן בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. התאם את עוצמת החיץ כזה שהריכוז הסופי של תגובת TMV הוא 2 מ"ג / מ"ל. (הקורא התייחס להערות הבאות לקריאה נוספת על שינוי הכימי של TMV: ^16,17).
4. הצמוד צבעים לlysines ופג cysteines של BMV ציסטאין מוטציה (cBMV):
   1. הוסף 2000 שווים טוחנת של גרין אסתר succinimidyl אורגון 488 מומס בDMSO לcBMV ב0.1 מ 'TNKM חיץ (50 mM טריס בסיס, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 המ"מ MgCl _2, 7.4 pH). התאם את כרכי חיץ וDMSO כאלה שהריכוז הסופי של BMV הוא 1 מ"ג / מ"ל ​​ותוכן DMSO הוא 10% מהיקף התגובה הכולל. דגירת תגובת תערובת הלילה ב 4 ° C מוגן מפני אור.
   2. חלקיקים לטהר באמצעות centriמסנני מנוסה כמתוארת בשלב 4.4.
   3. הוסיפו עודפי טוחנת 2000 של PEG-maleimide (MW 2000) תוך שימוש בתנאי התגובה כמו פעם ודגירת תערובת התגובה ל2 שעות ב 4 ° C. cBMV יש 180 lysines וcysteines תגובתי. (הקורא התייחס להערות הבאות לקריאה נוספת על שינוי הכימי של BMV: ^18).
5. טיהור: להעביר את הפתרון דרך 40% (w / v) כרית סוכרוז ב160.000 XG תמורת 2.5 שעות. מחדש להתמוסס הגלולה במאגר. לחלופין, דיאליזה נגד חיץ המתאים באמצעות 10 מסנני ספין חתוכים KDA.
6. אפיון: VNPs PEGylated וfluorescently כותרתו מנותחת באמצעות שיטות מתוארות לעיל: ספקטרוסקופיה סגולה / גלויה, ג'ל אלקטרופורזה SDS, FPLC, וTEM (לא מוצג, לעומת זאת, מתייחס לאיורי 6 ו 7).

5. מיקוד גידול והדמיה תוך שימוש במודל עכבר xenograft

1. תרבות HT-29 תאי סרטן מעי גס אנושיים במדיום RPMI בתוספת 5% FBS, 1% פניצילין סטרפטומיצין, ו 1% L-גלוטמין על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באמצעות 175 ² צלוחיות תרבות תאי סנטימטר.
2. שטוף תאים פעמים עם סטרילי PBS ובציר ב דוגר עם 5 מ"ל של טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להשבית טריפסין עם 5 מ"ל של מדיום RPMI. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 500 למשך 5 דקות. ב 4 ° C וresuspend בRPMI הטרי במדיום 5x10 ⁶ cells/50 μl (לקבוע ספירת תאים מוחלטת באמצעות trypan כחול וhemocytometer). מערבב עם נפח שווה של matrigel לפני ההזרקה (לשמור את כל הפתרונים וריאגנטים סטרילית).
3. רוכשים הישנים NCR עכברי השישה שבועות נו / נו ולשמור אותם על תזונה ללא אספסת עבור 2 שבועות. [הערה:. כל נהלי בעלי החיים חייבים להיות IACUC אושר] להשרות xenografts הסרטני על ידי הזרקה תת עורית של 5x10 ⁶ cells/100 μl / גידול באגפים (2 גידולים / עכבר) באמצעות מד 18 1/2 סטרילימחט. לפקח על בעלי החיים באופן קבוע. מדוד את גודל הגידול באמצעות מחוגה ולאפשר את הגידולים לגדול להיקף ממוצע של 20 מ"מ ³ (בתוך 12 ימים הקרובים). הקצאת עכברים לשתי קבוצות שונות באופן אקראי: PBS וVNP (= 3 חיות / קבוצה / זמן n נקודה). שימוש במזרק 1 מ"ל 28 מד אינסולין, לנהל על ידי 100 μl וריד וריד זנב הזריקה של PBS סטרילי או ניסוח 10 מ"ג / קילו VNP.

הערה: ניסויי רקמות תרבות ומחקרים עם בעלי חיים לא הפגינו. ידות על הפגנה תהיינה מוגבלות לעיבוד רקמות ורכישת נתונים. להתייחסות במודל xenograft גידול HT-29, הקורא נקרא שופט ^19.

שלוש טכניקות משמשות כדי להעריך את גידול ביות של VNPs:

4. דימות פלואורסצנטי באמצעות מערכת מאסטרו הדמיה: עכברי תקריב בנקודתי זמן שונים (2, 24, ו 72 שעות) באמצעות CO ₂גז. לנתח את בעלי החיים והבלו כל האיברים העיקריים (מוח, לב, ריאות, טחול, כליות וכבדות), יחד עם הגידולים על הצלעות, הנח את הרקמות בparafilm, ולנתח עם מכשיר דימות פלואורסצנטי באמצעות עירור צהוב ומסנני פליטה (800 מילישניות חשיפה) כדי לזהות את הנוכחות של אותות ניאון ברקמות (נגזר מA647 תווית מוצמדת לVNPs). שמור את התמונות ולנתח עוצמות ניאון באמצעות ImageJ 1.44o תוכנה (http://imagej.nih.gov/ij). השווה את הדפוס של ספיגה של VNPs בגידולים עם רקמות עיקריות אחרות עם זמן.
5. לאחר הדמיה, לחתוך כל רקמה במחצית ולהטביע מחצית במתחם אוקטובר לניתוח חתך-cryo וconfocal. לאסוף את החצי השני בCryo-בקבוקונים מראש שקל ולהקפיא באופן מיידי אותם באמצעות נוזל N _2. החנות ב -80 ° C עד מוכן לעיבוד נוסף.
6. כימות פלואורסצנטי: Reרקמות חוט משקולות. הפשר רקמות קפוא בטמפרטורת חדר ולמקם אותם בצינורות 50 מ"ל פלקון נפרדים המכילים 1 מ"ל של PBS. שימוש homogenizer רקמות כף יד, הומוגני הרקמות במשך 2-3 דקות בPBS לאחר מכן להעביר את homogenate לצינורות microfuge. צנטריפוגה את homogenates עבור 10 דקות ב 13000 XG להסרת רקמה שאינה הומוגני.
7. 100 μl Pipet של supernatant מהרקמות מכל קבוצה (ניסוחי PBS וVNP / נקודתי זמן) לצלחת 384 UV גם שחורה. הערך את עוצמת קרינה (אורכי גל אקס / Em 600/665) באמצעות קורא צלחת. לנרמל את ערכי הניאון המתקבלים על ידי משקולות רקמות.
8. אימונוהיסטוכימיה: הכן סעיפי cryo-microtome (10 מיקרומטר) ולאחסן ב -20 ° C. כתם סעיפי רקמות לגרעין תא (DAPI) וסמן תא האנדותל (FITC כותרתו אנטי עכבר CD31 נוגדנים). לבצע ניתוח מיקרוסקופיה confocal כדי למפות את כלי הדם ולוקליזציה תוך tumoral של VNP מתויג-fluorescentlys.

הערה: הליך זה לא הוכיח, נתונים מייצגים מוצגים באיור 8. להתייחסות באימונוהיסטוכימיה ושיטות הצביעה המתוארת, הקורא נקרא שופט ^19.

תוצאות

Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation.

Discussion

פרוטוקול זה מספק גישה לשינוי הכימי של VNPs והיישומים שלהם להדמית גידול vivo. הדמית חית פלואורסצנטי, פלואורסצנציה כימות, ואימונוהיסטוכימיה הטכניקות שהוצגו כאן הן שימושיות לחקר biodistribution והערכת גידול ביות. טכניקות אלה מספקים מידע רב ערך לגבי גישה של החלקיקים לגי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VNP production
Indoor plant chamber	Percival Scientific	E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5)	Burpee	51771A
N. benthamiana seeds			N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum	Fisher	C192-500
Pro-mix BX potting soil	Premier Horticulture	713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer	JR Peters	77860
Equipment
50.2 Ti rotor	Beckman	337901
SW 32 Ti rotor	Beckman	369694
Optima L-90K ultracentrifuge	Beckman	365672
SLA-3000 rotor	Thermo Scientific	07149
SS-34 rotor	Thermo Scientific	28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific	46910
Polypropylene bottle	Beckman	355607	For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	357002	For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube	Beckman	344058	For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	355618	For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system	Invitrogen	EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph	GE Healthcare	28-4062-66
Allegra X-12R	Beckman	392302	Benchtop centrifuge
Cryostat	Leica	CM1850
Maestro 2	Caliper Life Sciences		In vivo imaging system
Tissue-Tearor	Biospec Products	985370-395
Microplate reader	Tecan	Infinite-200
Transmission electron microscope	ZEISS	Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline	Sigma Aldrich	498289-5G
384 well black plate	BD Biosciences	353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel	Invitrogen	NP0321BOX
4X LDS sample buffer	Invitrogen	NP0008
Acetic Acid	Fisher	A385-500
Acetonitrile	Sigma Aldrich	271004-1L
Alexa Fluor 647 azide	Invitrogen	A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters	Millipore	UFC501096	10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride	Acros Organics	36891-0250
Boric acid	Fisher	A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher	BP101-25
CsCl	Acros Organics	42285-1000
DAPI	MP Biomedicals	157574
Dimethyl sulfoxide	Fisher	BP231-100
Filter paper	Fisher	09-801K	P5 grade
FITC anti-mouse CD31	BioLegend	102406
Goat serum	Invitrogen	16210-064
KCl	Fisher	BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt	Acros Organics	35268-0050
Methanol	Fisher	A412P-4
MgCl2	Fisher	BP214-500
Microscope slides	Fisher	12-544-3
Microscope cover glass	VWR	48366-277
MOPS buffer	Invitrogen	NP0001
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-2k	MW 2000
mPEG-N3	Nanocs	PG1-AZ-5k	MW 5000
mPEG-NHS	Nanocs	PG1-SC-5k	MW 5000
NaCl	Fisher	BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer*	Invitrogen	O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate	Acros Organics	13902-0050
Permount	Fisher	SP15-100
Potassium phosphate dibasic	Fisher	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher	BP362-1
Sodium acetate	Fisher	BP333-500
Sodium nitrite	Acros Organics	42435-0050
Sodium sulfite	Amresco	0628-500G
Sucrose	Fisher	S6-500
TEM grid	Ted Pella	FCF-400Cu
Tris base	Fisher	BP152-500
Triton X-100	EMD Chemicals	TX1568-1
β-mercapt–thanol	Fisher	O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum	Invitrogen	12483-020
Hemocytometer	Fisher	0267110
HT-29 cells	ATCC	HTB-38
L-glutamine	Invitrogen	25030-080
PBS	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	10378-016
RPMI-1640	Invitrogen	31800-089
Tissue culture flasks	Corning	431080	175 cm2
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet	Harlan Teklad	Teklad Global 2018S	Alfalfa free diet
Insulin syringe	BD Biosciences	329410	28 gauge
Isoflurane	Baxter	AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane	BD Biosciences	356234
NCR nu/nu mice			CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe	BD Biosciences	305196	18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Andwin Scientific	4583