Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

Riepilogo

Nanoparticelle vegetali virali (VNPs) sono promettenti piattaforme per le applicazioni in campo biomedico. Qui, descriviamo le modalità di propagazione delle piante VNP, purificazione, caratterizzazione e bioconjugation. Infine, mostriamo l'applicazione di VNPs per homing tumore e immagini utilizzando un modello di xenotrapianto mouse e imaging di fluorescenza.

Abstract

L'uso di nanomateriali ha il potenziale per rivoluzionare scienza dei materiali e della medicina. Attualmente, un certo numero di differenti nanoparticelle sono stati studiati per applicazioni di imaging e terapia. Nanoparticelle virali (VNPs) derivati ​​da piante può essere considerata autoassemblati bionanomaterials con dimensioni e forme definite. Virus di piante in esame in laboratorio Steinmetz sono particelle formate icosaedrici dal virus del mosaico Cowpea (CPMV) e virus del mosaico Brome (BMV), entrambi i quali sono 30 nm di diametro. Stiamo anche sviluppando strutture a forma di bastoncello e filamentose derivati ​​dai virus delle piante seguenti: virus del mosaico del tabacco (TMV), che costituisce aste rigide con dimensioni di 300 nm da 18 nm, e Virus X della patata (PVX), che formano le particelle filamentose 515 nm di lunghezza e 13 nm in larghezza (si rimanda il lettore al refs. ¹ e ² per ulteriori informazioni sulla VNPs).

in planta, sono eccezionalmente stabili e biocompatibili. Inoltre, VNPs sono "programmabili" unità, che possono essere specificamente progettati utilizzando modificazione genetica o metodi chimici bioconjugation ^3. La struttura di VNPs è noto risoluzione atomica, e modifiche possono essere effettuate con precisione spaziale a livello atomico ^4, un livello di controllo che non può essere raggiunto utilizzando nanomateriali di sintesi con le attuali state-of-the-art.

In questo articolo, si descrive la propagazione di CPMV, PVX, TMV, e BMV a Vigna ungiuculata e piante di Nicotiana benthamiana. Protocolli di estrazione e purificazione di ogni VNP sono dati. Metodi per la caratterizzazione dei purificato e VNPs chimicamente etichettati sono descritti. In questo studio, ci concentriamo su chetichettatura emical di VNPs con fluorofori (es. Alexa Fluor 647) e polietilenglicole (PEG). I coloranti facilitare il monitoraggio e la rilevazione dei VNPs ^5-10, e PEG riduce immunogenicità delle nanoparticelle proteici migliorando loro farmacocinetica ^8,11. Dimostriamo tumore homing di VNPs pegilati utilizzando un modello di topo xenotrapianto del tumore. Una combinazione di imaging di fluorescenza di tessuti ex vivo utilizzando Maestro Imaging System, quantificazione fluorescenza nei tessuti omogeneizzati, e microscopia confocale viene utilizzato per studiare biodistribuzione. VNPs vengono cancellati tramite il sistema reticolo-endoteliale (RES); tumore homing avviene passivamente attraverso la permeabilità maggiore e ritenzione (EPR) effetto ^12. La nanotecnologia VNP è un potente plug-and-play della tecnologia per l'immagine e il trattamento di siti di malattia in vivo. Stiamo sviluppando ulteriormente VNPs portare carichi di droga e frazioni di imaging clinicamente rilevanti, così come tessuto-specifici ligandi dibersaglio i recettori molecolari sovraespresse nel cancro e malattie cardiovascolari.

Protocollo

1. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Propagazione

1. Impostare la camera di impianto al coperto di controllo per 15 ore del giorno (100% di luce, 25 ° C, 65% di umidità) e 9 ore di notte (0% luce, 22 ° C, 60% di umidità).
2. Inoculare le piante in base alla timeline nella Tabella 1.

CPMV	PVX, TMV, e BMV
Giorno 0: Stabilimento 3 fagiolo dall'occhio semi / pot.	Giorno 0: Pianta ~ 30 N. benthamiana semi / pot. Concimare una volta alla settimana con 1 cucchiaio di concime / 5 L di acqua.
	Giorno 14: Re-pot N. benthamiana a 1 pianta / vaso.
Giorno 10: Infect Foglie primarie con CPMV (5 μg/50 pl / foglia) da inoculazione meccanica con una leggera spolverata di carborundum.	Giorno 28: Infect tre a five lascia con PVX, TMV, o BMV (5 μg/50 pl / foglia) da inoculazione meccanica con una leggera spolverata di carborundum.
Foglie Harvest e conservarlo in -80 ° C.: Giorno 20	Foglie Harvest e conservarlo in -80 ° C.: giorno 42

Tabella 1. Timeline per la coltivazione, infettando, e la raccolta foglie.

Nota: solo propagazione CPMV è dimostrato come esempio.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Purificazione

Nota: Tutte le operazioni sono eseguite su ghiaccio oppure a 4 ° C.

1. Omogeneizzare 100 g di foglie congelati in un frullatore standard utilizzando due volumi di tampone freddo (vedi Tabella 2). Filtrare 2-3 strati di garza.
2. Per PVX, regolare il pH a 6,5 ​​con 1 M HCl. Aggiungere 0,2% (w / v) di acido ascorbico e 0,2% (w / v) di sodio sulfite.
3. Centrifugare pianta omogenato grezzo a 5.500 xg per 20 min. Raccogliere il surnatante.
4. Per BMV, strato 25 ml di surnatante oltre 5 ml di 10% (w / v) di saccarosio. Centrifugare a 9000 xg per 3 ore e risospendere pellet in soluzione CsCl 38,5% (w / v). Mescolare agitando per 5 ore, poi continuare con il passo 2.12.
5. Estrarre materiale vegetale con l'aggiunta di 0,7 volumi di 1:1 (v / v) cloroformio :1-butanolo. Mescolare impasto per 30-60 min.
6. Centrifugare soluzione a 5.500 xg per 20 min. Raccogliere la fase acquosa superiore.
7. Aggiungere a 0,2 M NaCl e l'8% (w / v) PEG (MW 8000). Per TMV, anche aggiungere 1% (v / v) Triton X-100. Mescolare per almeno 1 ora, quindi lasciate riposare per almeno 1 ora.
8. Centrifugare soluzione a 15.000 xg per 15 min. Risospendere il pellet in 10 ml di tampone. Per PVX, aggiungere 0,1% β-mercaptoetanolo e urea a 0,5 M.
9. Centrifugare a 8000 xg per 30 minuti e raccogliere il supernatante.
10. Ultracentrifuga surnatante a 160.000 xg per 3 ore. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone overnight.
11. Preparazione di un gradiente di saccarosio 10-40% con volumi pari al 10%, 20%, 30%, e 40% di saccarosio in tampone (più pesante prima). Lasciare che il gradiente di equilibrare notte a temperatura ambiente.
12. Ultracentrifuga sedimento risospeso su gradiente di saccarosio a 100.000 xg per 2 ore (24 ore per BMV).
13. Raccogliere banda light scattering e dializza contro tampone.
14. Caratterizzare le VNPs (sotto) e conservare a 4 ° C. Per la conservazione a lungo termine, conservare a -80 ° C.

CPMV e TMV	0,1 M tampone fosfato di potassio (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4
PVX	0,5 M tampone borato (pH 7,8) 0,5 M di acido borico Aggiustare il pH con NaOH
BMV	SAMA tampone (pH 4,5) 250 mM acetato di sodio 10 mM MgCl 2 2 mM β-mercaptoetanolo (aggiungere fresco)

Tabella 2. Buffer e le loro ricette per ogni VNP.

Nota: solo propagazione CPMV è dimostrato come esempio.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Caratterizzazione

1. Effettuare spettroscopia UV / visibile per determinare la concentrazione di VNPs.
   1. Misurare l'assorbanza di 2 ml di campione utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.
   2. Determinare la concentrazione di particelle e coloranti utilizzando la legge di Lambert-Beer (A = εcl, dove A è l'assorbanza, ε è il coefficiente di estinzione, c è la concentrazione, ed L è la lunghezza del percorso). La lunghezza del percorso è di 0,1 cm per la NanoDrop.
      Le VNP-specifici coefficienti di estinzione sono:
      CPMV: 8.1 ^cm-1 mg ¹ ml (a 260 nm)
      PVX: 2.97 ^cm-1 mg ¹ ml (a 260 nm)
      TMV: 3.0 ^cm-1 mg ¹ ml (a 260 nm)
      BMV: 5.15 ^cm-1 mg ¹ ml (a 260 nm)
2. Analizzare le particelle di dimensioni esclusione cromatografia liquida veloce proteine ​​(FPLC).
   1. Utilizzando un Superose 6 esclusione dimensionale e la colonna Explorer ÄKTA, carico 50-100 pg di VNPs in 200 pl di tampone fosfato di potassio 0,1 M (pH 7,0).
   2. Impostare rivelatori a 260 nm (acido nucleico), 280 nm (proteine), e la lunghezza d'onda di eccitazione di eventuali coloranti allegate.
   3. A una velocità di flusso di 0,5 ml / min per 72 min.
   4. Il profilo di eluizione e A260: A280 nm indica se la preparazione VNP è puro e se le particelle sono intatti e assemblati.
      Il seguente A260: 280 rapporti indicano una preparazione pura VNP:
      CPMV: 1.8 ± 0.1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1.7 ± 0.1
3. Eseguire la denaturazione (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris poliacrilammide 4-12% elettroforesi su gel di pendenza di analizzare la purezza della preparazione e la coniugazione di proteine ​​di rivestimento individuali.
   1. Aggiungere 3 ml di tampone campione 4x LDS a 10 mg di particelle in 9 ml di tampone fosfato di potassio. Aggiungere un ulteriore 1 ml di tampone campione LDS 4x e 3 ml di β-mercaptoetanolo per BMV di ridurre l'elevato numero di legami disolfuro.
   2. Incubare in blocco termico per 5 minuti a 100 ° C.
   3. Caricare i campioni su un gel SDS.
   4. Eseguire i campioni a 200 V per 1 ora in esecuzione 1x MOPS buffer.
   5. Documentare il gel sotto la luce UV per visualizzare proteine ​​di rivestimento fluorescenti.
   6. Per non-proteina fluorescente, macchia con blu Coomassie (0,25% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R-250, acido 30% (v / v) di metanolo, 10% (v / v) acetico) per 1 ora.
   7. Decolorare con 30% metanolo, 10% acido acetico durante la notte. Change la soluzione, se necessario.
   8. Documentare il gel sotto luce bianca.
4. Analizzare l'integrità delle particelle mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
   1. Diluire i campioni di 0,1-1 mg / ml in 20 ml di acqua deionizzata.
   2. Mettere 20 gocce ul dei campioni su parafilm.
   3. Coprire gocce con una griglia TEM e lasciate riposare per 2 min. Stoppino dalla soluzione in eccesso sulla griglia con carta da filtro.
   4. Lavare griglia immissione in una goccia di acqua deionizzata quindi assorbente asciutto.
   5. Stain griglia mettendo su una goccia 20 ml di 2% (w / v) di acetato di uranile per 2 min. Wick l'eccesso macchia con carta da filtro.
   6. Lavare rete ancora una volta in acqua.
   7. Osservare griglia sotto un microscopio elettronico a trasmissione.

4. Coniugazione chimica del VNPs con PEG e fluorofori, purificazione e caratterizzazione

1. Per i calcoli per le reazioni di sotto, la massa molare dei VNPs sono:
   CPMV: 5.6x 10 ⁶ g / mol
   PVX: 35 x 10 ⁶ g / mol
   TMV: 41 x 10 ⁶ g / mol
   BMV: 4,6 x 10 ⁶ g / mol
2. Coniugare coloranti e PEG per lisine superficiali di CPMV e PVX usando un one-step N-idrossi succinimmide reazione di accoppiamento: Aggiungi 2500 equivalenti molari (tutti gli eccessi molari consultare eccesso molare per VNP) di Alexa Fluor 647 estere succinimidil e 4.500 equivalenti di NHS- PEG (MW 5000) disciolto in DMSO ad CPMV in 0,1 M tampone fosfato di potassio. Quando si lavora con PVX, aggiungere un eccesso molare di 10000 NHS-colorante e NHS-PEG. Regolare i volumi di tampone e DMSO tale che la concentrazione finale di CPMV e PVX è di 2 mg / ml di DMSO e il contenuto è 10% del volume totale di reazione. Incubare la miscela di reazione per una notte a temperatura ambiente al riparo dalla luce. CPMV e PVX avere 300 e 1270 lisine indirizzabili, rispettivamente. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori letturemodificazione chimica di CPMV e PVX: ^13-15).
3. Coloranti Coniugato e PEG per tirosine di TMV con il raccordo di diazonio seguito da rame (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione.
   1. Preparare sale di diazonio (alchini) mescolando 400 pl di 0,3 M p-toluensolfonico monoidrato, 25 pl di nitrito di sodio 3,0 M e 75 ml di 0,68 M distillata 3-ethynylaniline disciolto in acetonitrile a 4 ° C per 1 ora.
   2. Aggiungere 3,3 ml di tampone borato, pH 8,8, contenente 100 mM NaCl a 1,25 ml di TMV (20 mg / ml di soluzione concentrata).
   3. Reagiscono con il TMV 450 microlitri della sale di diazonio (alchini) soluzione in un bagno di ghiaccio per 3 ore per aggiungere una legatura alchino maniglia a TMV mediante accoppiamento di diazonio. La soluzione si trasformerà in un colore marrone chiaro. TMV ha 2140 tirosine disponibili per coniugazione.
   4. Purificare il prodotto finale utilizzando un cuscino di saccarosio come descritto nel passaggio 4,4.
   5. Collegare azide-funzionale Alexa Fluor 647 e PEG-azide (MW 5.000) using di rame (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC). Aggiungere 2 equivalenti di coloranti e PEG-azide per proteina di rivestimento e incubare con 1 mM CuSO _4, 2 mM AMG, e 2 mM ascorbato di sodio a temperatura ambiente per 15 min. Regolare il volume di accumulo tale che la concentrazione di reazione finale di TMV è di 2 mg / ml. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori approfondimenti sulla modificazione chimica di TMV: ^16,17).
4. Coniugare tinture per lisine e PEG per cisteine ​​di cisteina mutante BMV (cBMV):
   1. Aggiungere 2.000 equivalenti molari di Oregon verde 488 succinimmidil estere disciolti in DMSO al cBMV in 0,1 M TNKM tampone (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl _2, pH 7,4). Regolare i volumi di tampone e DMSO tale che la concentrazione finale di BMV è 1 mg / ml di DMSO e il contenuto è 10% del volume totale di reazione. Incubare la miscela di reazione per una notte a 4 ° C al riparo dalla luce.
   2. Particelle Purificare con centrifugafiltri fugati, come descritto al punto 4.4.
   3. Aggiungere 2.000 eccesso molare di PEG-maleimmide (MW 2000) utilizzando le stesse condizioni di reazione come prima e incubare la miscela di reazione per 2 ore a 4 ° C. cBMV dispone di 180 lisine reattivi e cisteine. (Si rimanda ai seguenti riferimenti per ulteriori letture sulla modificazione chimica di BMV: ^18).
5. Purificazione: Passare la soluzione attraverso un cuscino di saccarosio al 40% (w / v) a 160.000 xg per 2,5 ore. Nuovamente sciogliere il precipitato in un tampone. In alternativa, dializza contro tampone appropriato con 10 kDa di cut-off filtri rotativi.
6. Caratterizzazione: VNPs pegilato e marcato in fluorescenza vengono analizzate utilizzando i metodi sopra descritti: UV / visibile spettroscopia, elettroforesi su gel SDS, FPLC e TEM (non mostrato, tuttavia, fare riferimento alle figure 6 e 7).

5. Targeting tumorale e imaging utilizzando un modello Xenograft mouse

1. Cultura HT-29 cellule umane di cancro al colon in mezzo RPMI supplementato con 5% FBS, 1% di penicillina-streptomicina, e 1% di L-glutammina a 37 ° C in 5% CO ₂ con 175 centimetri ^due fiasche di coltura cellulare.
2. Lavare le cellule due volte con PBS sterile e raccolto mediante incubazione con 5 ml di tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 min. Inattivare la tripsina con 5 ml di terreno RPMI. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 500 xg per 5 min. a 4 ° C e risospendere in fresco RPMI a 5x10 ⁶ cells/50 medie microlitri (determinare il numero totale delle cellule con Trypan Blue e un emocitometro). Mescolare con un volume uguale di matrigel prima dell'iniezione (mantenere tutte le soluzioni e reagenti sterile).
3. Procurarsi sei settimana fa NCR nu / nu topi e mantenerli su una dieta di erba medica gratuita per 2 settimane. [Nota:. Tutte le procedure di polizia deve essere approvato IACUC] indurre xenotrapianti tumorali mediante iniezione sottocutanea di 5x10 ⁶ cells/100 pl / tumore nei fianchi (2 tumori / mouse) utilizzando un 18 1/2 calibro sterileago. Monitorare gli animali regolarmente. Misurare la dimensione del tumore, utilizzando pinze e lasciare i tumori di crescere fino a un volume medio di 20 mm ³ (entro i prossimi 12 giorni). Assegnare i topi a due gruppi diversi in modo casuale: PBS e VNP (n = 3 animali / gruppo / ora punto). Utilizzando una siringa da 28 ml uno scartamento insulina, somministrare per iniezione endovenosa vena della coda 100 pl di PBS sterile o 10 mg / kg formulazione VNP.

Nota: esperimenti di coltura dei tessuti e gli studi con animali vivi non sarà dimostrato. Hands-on dimostrazione sarà limitata alla lavorazione dei tessuti e acquisizione dati. Per un riferimento sul modello HT-29 xenograft tumorale, si rimanda il lettore al rif. ¹⁹

Tre tecniche sono utilizzate per valutare tumore homing di VNPs:

4. Imaging di fluorescenza utilizzando Maestro Imaging System: topi Sacrifice a tempi diversi (2, 24, e 72 ore) con emissioni di CO ₂gas. Staccare gli animali e tutti gli organi principali accise (cervello, cuore, polmoni, milza, reni e fegato), insieme con i tumori sui fianchi, posizionare i tessuti su parafilm, e analizzare con strumenti di imaging di fluorescenza con eccitazione giallo e filtri di emissione (800 ms esposizione) per rilevare la presenza di segnali fluorescenti nei tessuti (derivato da A647 etichetta coniugato ai VNPs). Salvare le immagini e analizzare le intensità di fluorescenza utilizzando ImageJ 1.44o software ( http://imagej.nih.gov/ij ). Confrontare il modello della captazione delle VNPs nei tumori con altri tessuti importanti con il tempo.
5. Dopo l'imaging, tagliare ogni tessuto a metà e incorporare una metà in OCT per l'analisi crio-sezionamento e confocale. Raccogliere l'altra metà in pre-pesati crio-fiale e immediatamente congelare utilizzando liquido N _2. Conservare a -80 ° C fino al momento per l'ulteriore elaborazione.
6. Fluorescenza quantificazione: Recordone tessuti pesi. Scongelare tessuti congelati a temperatura ambiente e metterli in separati provette Falcon da 50 ml contenenti 1 ml di PBS. Utilizzo di un omogeneizzatore palmare tessuto, omogeneizzare i tessuti per 2-3 min in PBS poi trasferire l'omogeneizzato ai tubi microcentrifuga. Centrifugare omogenati per 10 minuti a 13.000 xg per rimuovere tessuto non omogeneizzato.
7. Pipettare 100 pl del supernatante dai tessuti di ogni gruppo (formulazioni PBS e VNP / punti temporali) in una piastra a 384 UV ben nero. Valutare l'intensità di fluorescenza (Ex / Em lunghezze d'onda 600/665) utilizzando un lettore di piastre. Normalizzare i valori ottenuti fluorescenti dai pesi dei tessuti.
8. Immunoistochimica: Preparare crio-microtomo sezioni (10 micron) e conservare a -20 ° C. Stain sezioni di tessuto per nuclei cellulari (DAPI) e marcatore delle cellule endoteliali (coniugati con fluoresceina anti-topo CD31 anticorpo). Effettuare analisi di microscopia confocale per mappare la localizzazione vascolare e intra-tumorale di fluorescenza marcata VNPs.

Nota: Questa procedura non sarà dimostrato, dati rappresentativi sono mostrati in Figura 8. Per un riferimento immunoistochimica ed i metodi di colorazione descritti, si rimanda il lettore al rif. ¹⁹

Risultati

Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation.

Discussione

Questo protocollo fornisce un approccio per la modifica chimica di VNPs e delle loro applicazioni per imaging in vivo del tumore. Le tecniche di imaging di fluorescenza animale, quantificazione fluorescenza, l'immunoistochimica e presentati in questa sede sono utili per lo studio di biodistribuzione e la valutazione del tumore homing. Queste tecniche forniscono informazioni importanti per quanto riguarda l'accesso delle nanoparticelle al tumore attraverso l'effetto EPR. Combinando i risultati dei va...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			VNP production
Indoor plant chamber	Percival Scientific	E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5)	Burpee	51771A
N. benthamiana seeds			N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum	Fisher	C192-500
Pro-mix BX potting soil	Premier Horticulture	713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer	JR Peters	77860
			Equipment
50.2 Ti rotor	Beckman	337901
SW 32 Ti rotor	Beckman	369694
Optima L-90K ultracentrifuge	Beckman	365672
SLA-3000 rotor	Thermo Scientific	07149
SS-34 rotor	Thermo Scientific	28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific	46910
Polypropylene bottle	Beckman	355607	For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	357002	For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube	Beckman	344058	For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	355618	For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system	Invitrogen	EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph	GE Healthcare	28-4062-66
Allegra X-12R	Beckman	392302	Benchtop centrifuge
Cryostat	Leica	CM1850
Maestro 2	Caliper Life Sciences		In vivo imaging system
Tissue-Tearor	Biospec Products	985370-395
Microplate reader	Tecan	Infinite-200
Transmission electron microscope	ZEISS	Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
			Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline	Sigma Aldrich	498289-5G
384 well black plate	BD Biosciences	353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel	Invitrogen	NP0321BOX
4X LDS sample buffer	Invitrogen	NP0008
Acetic Acid	Fisher	A385-500
Acetonitrile	Sigma Aldrich	271004-1L
Alexa Fluor 647 azide	Invitrogen	A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters	Millipore	UFC501096	10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride	Acros Organics	36891-0250
Boric acid	Fisher	A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher	BP101-25
CsCl	Acros Organics	42285-1000
DAPI	MP Biomedicals	157574
Dimethyl sulfoxide	Fisher	BP231-100
Filter paper	Fisher	09-801K	P5 grade
FITC anti-mouse CD31	BioLegend	102406
Goat serum	Invitrogen	16210-064
KCl	Fisher	BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt	Acros Organics	35268-0050
Methanol	Fisher	A412P-4
MgCl2	Fisher	BP214-500
Microscope slides	Fisher	12-544-3
Microscope cover glass	VWR	48366-277
MOPS buffer	Invitrogen	NP0001
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-2k	MW 2000
mPEG-N3	Nanocs	PG1-AZ-5k	MW 5000
mPEG-NHS	Nanocs	PG1-SC-5k	MW 5000
NaCl	Fisher	BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer*	Invitrogen	O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate	Acros Organics	13902-0050
Permount	Fisher	SP15-100
Potassium phosphate dibasic	Fisher	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher	BP362-1
Sodium acetate	Fisher	BP333-500
Sodium nitrite	Acros Organics	42435-0050
Sodium sulfite	Amresco	0628-500G
Sucrose	Fisher	S6-500
TEM grid	Ted Pella	FCF-400Cu
Tris base	Fisher	BP152-500
Triton X-100	EMD Chemicals	TX1568-1
β-mercaptoethanol	Fisher	O3446I-100
			Tissue Culture
Fetal bovine serum	Invitrogen	12483-020
Hemocytometer	Fisher	0267110
HT-29 cells	ATCC	HTB-38
L-glutamine	Invitrogen	25030-080
PBS	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	10378-016
RPMI-1640	Invitrogen	31800-089
Tissue culture flasks	Corning	431080	175 cm2
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300-054
			Animal Studies
18% Protein Rodent Diet	Harlan Teklad	Teklad Global 2018S	Alfalfa free diet
Insulin syringe	BD Biosciences	329410	28 gauge
Isoflurane	Baxter	AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane	BD Biosciences	356234
NCR nu/nu mice			CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe	BD Biosciences	305196	18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Andwin Scientific	4583