Вирусный наночастиц для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображения опухоли

Резюме

Завод вирусных наночастиц (VNPs) являются перспективными платформами для применений в биомедицине. Здесь мы описываем процедуры завод VNP распространение, очистка, характеристика и bioconjugation. Наконец, мы покажем применение VNPs опухоли самонаведения и визуализации с использованием модели мыши ксенотрансплантата и флуоресценции.

Аннотация

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. ¹ and ² for further information on VNPs).

From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods ³. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level⁴, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.

In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs ^5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics ^8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect¹². The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

протокол

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) Распространение

1. Установите камеру закрытый завод контролирует до 15 часов в день (100% света, 25 ° C, влажность 65%) и 9 ч ночи (0% света, 22 ° С, 60% влажности).
2. Инокулировать растений в соответствии с графиком в таблице 1.

CPMV	PVX, ВТМ, и BMV
День 0: Plant 3 вигны семян / горшок.	День 0: Завод ~ 30 Н. benthamiana семян / горшок. Удобрять раз в неделю с 1 столовую ложку удобрения / 5 л воды.
	День 14: Re-пот Н. benthamiana на 1 растение / банк.
День 10: Infect оставляет первичные листья с CPMV (5 мкг/50 мкл / лист) механической инокуляции с помощью светового пыль карборунда.	День 28: Infect трех до FIve листья с PVX, ВТМ, или BMV (5 мкг/50 мкл / лист) механической инокуляции с помощью светового пыль карборунда.
День 20: Harvest листья и хранят в -80 ° C.	День 42: Harvest листья и хранят в -80 ° C.

Таблица 1. Сроки растет, заражение, и сбор урожая листьев.

Примечание: только распространение CPMV показана в качестве примера.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) очистки

Примечание: Все действия выполняются на льду или при температуре 4 ° C.

1. Однородный 100 г замороженных листьев в стандартный блендер использованием 2-х томах холодного раствора (см. таблицу 2). Фильтр через 2-3 слоя марли.
2. Для PVX, отрегулировать рН до 6,5 с помощью 1 M HCl. Добавить 0,2% (вес / объем) аскорбиновой кислоты и 0,2% (вес / объем) натрия sulfiТе.
3. Центрифуга гомогената растительным сырьем при 5500 х г в течение 20 мин. Сбор супернатант.
4. Для BMV, слой 25 мл супернатанта более 5 мл 10% (вес / объем) раствор сахарозы. Центрифуга при 9000 мкг в течение 3 ч и ресуспендируют гранул в 38,5% CsCl решение (вес / объем). Mix путем встряхивания в течение 5 часов, а затем продолжить с шага 2.12.
5. Извлечение растительного материала путем добавления 0,7 объемов 1:1 (объем / объем) хлороформа :1-бутанола. Размешайте смесь в течение 30-60 мин.
6. Центрифуга решение при 5500 х г в течение 20 мин. Соберите верхнюю водную фазу.
7. Добавить NaCl до 0,2 М и 8% (вес / объем) ПЭГ (MW 8000). Для ВТМ, добавить 1% (V / V) Triton X-100. Движение по крайней мере, 1 час, то пусть сидят, по крайней мере, 1 час.
8. Центрифуга решение при 15000 х г в течение 15 мин. Ресуспендируют гранул в 10 мл буфера. Для PVX, добавить 0,1% β-меркаптоэтанол и мочевины до 0,5 М.
9. Центрифуга при 8000 мкг в течение 30 минут и собирают супернатант.
10. Ультрацентрифуге супернатанта при 160000 х г в течение 3 часов. Ресуспендируют гранул в 5 мл буфера выводаvernight.
11. Подготовить 10-40% сахарозы градиентом, используя равные объемы 10%, 20%, 30% и 40% сахарозы в буфере (тяжелый первый). Разрешить градиента, чтобы уравновесить ночь при комнатной температуре.
12. Ультрацентрифуга суспендируют осадок на градиенте сахарозы при 100000 х г в течение 2 часов (24 ч для BMV).
13. Сбор светлая полоса рассеяния и диализ против буфера.
14. Охарактеризовать VNPs (см. ниже) и хранить при 4 ° C. Для длительного хранения, хранят при температуре -80 ° C.

CPMV и ВТМ	0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0) 38,5 мм KH 2 PO 4 61,5 мм K 2 HPO 4
PVX	0,5 М бората буфером (рН 7,8) 0,5 М борной кислоты Отрегулируйте рН с NaOH
BMV	SAMA буфером (рН 4,5) 250 мМ ацетата натрия 10 мМ MgCl 2 2 мМ β-меркаптоэтанол (добавить свежие)

Таблица 2. Буферы и их рецепты для каждого VNP.

Примечание: только распространение CPMV показана в качестве примера.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) Характеристика

1. Выполните УФ / видимой спектроскопии для определения концентрации VNPs.
   1. Измерить абсорбцию во 2 мкл образца с помощью NanoDrop спектрофотометр.
   2. Определить концентрацию частиц и красителей помощью Beer-Lambert закон (= εcl, где это поглощение, ε-коэффициент экстинкции, с-концентрация, и я это путь длиной). Длина пути составляет 0,1 см для NanoDrop.
      VNP конкретные коэффициенты экстинкции являются:
      CPMV: 8,1 см ^-1 мг ^-1 мл (при 260 нм)
      PVX: 2,97 см ^-1 мг ^-1 мл (при 260 нм)
      TMV: 3,0 см ^-1 мг ^-1 мл (при 260 нм)
      BMV: 5,15 см ^-1 мг ^-1 мл (при 260 нм)
2. Анализ частиц по размерам и исключения быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC).
   1. Использование Superose 6 гель-колонки и Akta Explorer, нагрузка 50-100 мкг VNPs в 200 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0).
   2. Установка детекторов до 260 нм (нуклеиновые кислоты), 280 нм (белок), а длина волны возбуждения любого красителей прилагается.
   3. Запуск при скорости потока 0,5 мл / мин в течение 72 мин.
   4. Профиль элюции и A260: A280 нм указывает, является ли подготовка VNP чисто и ли частицы целы и собраны.
      Следующие A260: 280 отношения указывают чистого препарата VNP:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
3. Выполните денатурации (сборные NuPAGE) Bis-Tris полиакриламидном 4-12% градиентного гель-электрофореза для анализа чистоты подготовке и сопряжения отдельных белков пальто.
   1. Добавьте 3 мл буфера для образцов 4x LDS до 10 мкг частиц в 9 мкл буферного раствора фосфата калия. Добавить еще 1 мкл образца 4x LDS буфера и 3 мкл β-меркаптоэтанола к BMV сократить большое количество дисульфидных связей.
   2. Инкубируйте в нагревательный блок в течение 5 мин при температуре 100 ° C.
   3. Загрузка образцов на гель SDS.
   4. Выполнить образцы при 200 В в течение 1 часа в 1x MOPS работает буфер.
   5. Документ гель под воздействием ультрафиолетового излучения для визуализации флуоресцентных белков пальто.
   6. Для не-флуоресцентный белок, пятно Кумасси синего (0,25% (вес / объем) Кумасси Brilliant Blue R-250, 30% (об / об) метанола, 10% (V / V) уксусной кислоты) в течение 1 часа.
   7. Destain с 30% метанола, 10% уксусной кислоты в течение ночи. ChanGE решение, если требуется.
   8. Документ гель при дневном свете.
4. Анализ целостности частиц методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).
   1. Развести образцы 0.1-1 мг / мл в 20 мкл дистиллированной воды.
   2. Поместите 20 мкл капли образца на Parafilm.
   3. Крышка капель с сеткой ТЕА и пусть сидят в течение 2 мин. Вика излишки раствора на сетку с фильтровальной бумагой.
   4. Промойте сетку размещения на каплю воды DI, то влагу сухой.
   5. Пятно сетку, поставив на 20 мкл капли 2% (вес / объем) уранилацетата в течение 2 мин. Вика лишнее пятно с фильтровальной бумагой.
   6. Промойте сетку еще раз в воду.
   7. Соблюдайте сетку под просвечивающего электронного микроскопа.

4. Химическая Сопряжение VNPs с ПЭГ и флуорофоры, очистка и характеристика

1. Для расчетов для реакций ниже, молярная масса VNPs являются:
   CPMV: 5,6х 10 ⁶ г / моль
   PVX: 35 х 10 ⁶ г / моль
   TMV: 41 х 10 ⁶ г / моль
   BMV: 4,6 х 10 ⁶ г / моль
2. Сопряженные красителей и ПЭГ на поверхности лизинов из CPMV и ХВК, используя один шаг N-гидроксисукцинимид реакции сочетания: Добавить 2500 молярных эквивалентов (все молярной эксцессов относятся к молярным избытком в ВНП) от Alexa Fluor 647 сукцинимидил эфира и 4500 эквивалентами NHS- PEG (MW 5.000) растворяли в ДМСО в CPMV в 0,1 М фосфатного буфера калия. При работе с PVX, добавьте 10000 молярный избыток NHS-красителя и NHS-PEG. Отрегулируйте буфер и ДМСО объемы такие, что конечная концентрация CPMV и PVX составляет 2 мг / мл и ДМСО содержание составляет 10% от общего объема реакции. Выдержите в течение ночи реакционную смесь при комнатной температуре в защищенном от света месте. CPMV и PVX есть 300 и 1270 адресуемых лизина, соответственно. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения похимическая модификация CPMV и PVX: ^13-15).
3. Сопряженные красителей и PEG в тирозины ВТМ по диазония связи следует меди (I)-катализируемой азид-циклоприсоединения алкинов.
   1. Подготовка соли диазония (алкинов) путем смешивания 400 мкл 0,3 М р-толуолсульфокислоты, 25 мкл 3,0 М нитрита натрия и 75 мкл 0,68 млн. дистиллированной 3-ethynylaniline растворяют в ацетонитриле при 4 ° С в течение 1 часа.
   2. Добавить 3,3 мл боратного буфера, рН 8,8, содержащий 100 мМ NaCl в 1,25 мл ВТМ (20 мг / мл раствора).
   3. Реакция ВТМ с 450 мкл соли диазония (алкинов) раствор в ледяной бане в течение 3 часов, чтобы добавить алкином перевязки обращаться к ВТМ по диазония связи. Решение превратится в светло-коричневый цвет. TMV есть 2140 доступных тирозины для сопряжения.
   4. Очищают окончательного продукта с использованием сахарозы подушке, как описано в пункте 4.4.
   5. Прикрепить азид-функциональной Alexa Fluor 647 и ПЭГ-азид (MW 5.000) Усинг меди (I)-катализируемой азид-циклоприсоединения алкинов (CuAAC). Добавить 2 эквивалентов красителей и PEG-азид в белковую оболочку и инкубируют с 1 мМ CuSO _4, 2 мМ AMG, и 2 мМ аскорбата натрия при комнатной температуре в течение 15 мин. Отрегулируйте объем буфера так, чтобы конечная концентрация реакции ВТМ составляет 2 мг / мл. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения по химической модификации TMV: ^16,17).
4. Сопряженные красителей для лизина и цистеина PEG, чтобы из BMV цистеина мутант (cBMV):
   1. Добавить 2000 молярных эквивалентов Орегон Зеленый 488 сукцинимидил эфира растворяют в ДМСО в cBMV в 0,1 М TNKM буфера (50 мМ Трис-основания, 50 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl _2, рН 7,4). Отрегулируйте буфер и ДМСО объемы такие, что конечной концентрации BMV составляет 1 мг / мл и ДМСО содержание составляет 10% от общего объема реакции. Инкубируйте реакционной смеси в течение ночи при 4 ° C в защищенном от света.
   2. Purify частицы с помощью центробежнойfugal фильтры, как описано в пункте 4.4.
   3. Добавить 2000 молярного избытка PEG-малеимида (MW 2.000) с использованием тех же условиях реакции, как до, так и инкубировать реакционной смеси в течение 2 ч при 4 ° C. cBMV имеет 180 реактивных лизина и цистеина. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения по химической модификации BMV: ^18).
5. Очистка: Передать раствор через 40% (вес / объем) сахарозы подушке на 160000 мкг в течение 2,5 часов. Повторно растворить осадок в буфер. Кроме того, диализ против соответствующего буфера, используя 10 кДа отсечки фильтров спина.
6. Характеристика: ПЭГилированный и флуоресцентно-меченных VNPs анализируются с помощью описанных выше методов: УФ / видимой спектроскопии, SDS гель-электрофореза, FPLC, и TEM (не показан, однако, относятся к рис. 6 и 7).

5. Нацеливание на опухоль и визуализации с использованием модели мыши ксенотрансплантата

1. Культура НТ-29 толстой кишки человека раковых клеток в среде RPMI с добавлением 5% FBS, 1% пенициллина, стрептомицина и 1% L-глутамина при 37 ° С в 5% СО _{2 с} использованием 175 см ² колбы культуре клеток.
2. Вымойте клетки дважды стерильной PBS и сбора урожая путем инкубации с 5 мл трипсина-EDTA при 37 ° C в течение 5 мин. Инактивации трипсина с 5 мл среды RPMI. Сбор клеток путем центрифугирования при 500 мкг в течение 5 мин. при 4 ° С и ресуспендируют в свежей RPMI на 5x10 ⁶ cells/50 мкл среды (определить общее количество клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометр). Смешать с равным объемом матригель перед инъекцией (держать все решения и реагенты стерильные).
3. Закупка шестинедельных NCR Nu / Nu мыши и сохранить их на люцерну диета на 2 недели. [Примечание:. Всех животных процедуры должны быть IACUC утвержденных] Вызвать ксенотрансплантатов опухоли путем подкожной инъекции 5x10 ⁶ клеток/100 мкл / опухоли в бока (2 опухолей / мышь), используя 18 1/2 калибровочных стерильныхиглу. Следить за животным регулярно. Измерьте размер опухоли использованием суппортами и позволяют опухоли расти в среднем объеме 20 мм ³ (в течение 12 дней). Назначение мышей к двум различным группам случайным: PBS и ВНП (п = 3 животных / группы / момент времени). Использование 1 мл 28 Шприц инсулин датчика, управление внутривенно хвостовой вены для инъекций 100 мкл стерильной PBS или 10 мг / кг VNP формулировки.

Примечание: Культура ткани экспериментов и исследований с живыми животными не будет показано. Практическая демонстрация будет ограничено обработки тканей и сбора данных. Для ссылки на HT-29 модель ксенотрансплантатов опухоли, мы отсылаем читателя к работе ^19.

Три методы используются для оценки опухоли самонаведения VNPs:

4. Флуоресценция визуализации с использованием Maestro Imaging System: Жертва мышей в различные моменты времени (2, 24 и 72 часов) с использованием CO ₂газа. Препарировать животных и акцизных все основные органы (мозг, сердце, легкие, селезенка, почки и печень), а также опухоли на флангах, разместить тканей на парафильмом и анализа с флуоресцентной инструмент визуализации с использованием желтого возбуждения и испускания фильтры (800 мс воздействия), чтобы обнаружить присутствие флуоресцентные сигналы в тканях (производное от A647 этикетке сопряженных с VNPs). Сохранить изображения и анализа интенсивности использования флуоресцентных ImageJ 1.44o программного обеспечения ( http://imagej.nih.gov/ij ). Сравните структуру поглощения VNPs в опухолях с другими крупными ткани со временем.
5. После обработки изображений, разрезать каждую ткань пополам и одну половину вставлять в октябре соединение для крио-срезов и конфокальной анализа. Сбор другая половина в предварительно взвешенные крио-флаконов и сразу же заморозить их использованием жидкого N _2. Хранить при температуре от -80 ° C до готовности для дальнейшей обработки.
6. Флуоресценция определения: ReШнур тканей веса. Оттепель замороженных тканей при комнатной температуре и поместите их в отдельную 50 мл пробирки Сокол, содержащий 1 мл PBS. Использование ручной гомогенизатор тканей, гомогенизации ткани в течение 2-3 мин в PBS затем передать гомогената в микроцентрифуге труб. Центрифуга гомогенатах в течение 10 мин при 13000 мкг для удаления не гомогенизированные ткани.
7. Внесите 100 мкл супернатанта из тканей из каждой группы (PBS и VNP составы / моменты времени) в 384-луночные черные УФ пластины. Оценка интенсивности флуоресценции (Ex / Em длинами волн 600/665) с помощью планшетов. Нормализация полученных флуоресцентных значения по ткани весом.
8. Иммуногистохимия: Подготовка крио-микротома разделах (10 мкм) и хранить при температуре -20 ° C. Пятно срезов тканей для клеточных ядер (DAPI) и эндотелиальные клетки маркером (FITC-меченных анти-CD31 антитела мыши). Провести конфокальной микроскопии анализа для сопоставления сосудистой и внутри опухолевой локализации флуоресцентно-меченных VNPс.

Примечание: Эта процедура не будет продемонстрировано, представитель данные приведены на рисунке 8. Для ссылки на иммуногистохимии и описаны методы окрашивания, мы отсылаем читателя к работе ^19.

Результаты

Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает подход к химической модификации VNPs и их приложения в естественных изображений опухоли. Животное флуоресценции, флуоресценции количественного и иммуногистохимических методов, представленные здесь, полезны для изучения и оценки биораспределения опухо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			VNP production
Indoor plant chamber	Percival Scientific	E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5)	Burpee	51771A
N. benthamiana seeds			N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum	Fisher	C192-500
Pro-mix BX potting soil	Premier Horticulture	713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer	JR Peters	77860
			Equipment
50.2 Ti rotor	Beckman	337901
SW 32 Ti rotor	Beckman	369694
Optima L-90K ultracentrifuge	Beckman	365672
SLA-3000 rotor	Thermo Scientific	07149
SS-34 rotor	Thermo Scientific	28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific	46910
Polypropylene bottle	Beckman	355607	For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	357002	For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube	Beckman	344058	For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	355618	For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system	Invitrogen	EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph	GE Healthcare	28-4062-66
Allegra X-12R	Beckman	392302	Benchtop centrifuge
Cryostat	Leica	CM1850
Maestro 2	Caliper Life Sciences		In vivo imaging system
Tissue-Tearor	Biospec Products	985370-395
Microplate reader	Tecan	Infinite-200
Transmission electron microscope	ZEISS	Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
			Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline	Sigma Aldrich	498289-5G
384 well black plate	BD Biosciences	353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel	Invitrogen	NP0321BOX
4X LDS sample buffer	Invitrogen	NP0008
Acetic Acid	Fisher	A385-500
Acetonitrile	Sigma Aldrich	271004-1L
Alexa Fluor 647 azide	Invitrogen	A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters	Millipore	UFC501096	10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride	Acros Organics	36891-0250
Boric acid	Fisher	A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher	BP101-25
CsCl	Acros Organics	42285-1000
DAPI	MP Biomedicals	157574
Dimethyl sulfoxide	Fisher	BP231-100
Filter paper	Fisher	09-801K	P5 grade
FITC anti-mouse CD31	BioLegend	102406
Goat serum	Invitrogen	16210-064
KCl	Fisher	BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt	Acros Organics	35268-0050
Methanol	Fisher	A412P-4
MgCl2	Fisher	BP214-500
Microscope slides	Fisher	12-544-3
Microscope cover glass	VWR	48366-277
MOPS buffer	Invitrogen	NP0001
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-2k	MW 2000
mPEG-N3	Nanocs	PG1-AZ-5k	MW 5000
mPEG-NHS	Nanocs	PG1-SC-5k	MW 5000
NaCl	Fisher	BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer*	Invitrogen	O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate	Acros Organics	13902-0050
Permount	Fisher	SP15-100
Potassium phosphate dibasic	Fisher	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher	BP362-1
Sodium acetate	Fisher	BP333-500
Sodium nitrite	Acros Organics	42435-0050
Sodium sulfite	Amresco	0628-500G
Sucrose	Fisher	S6-500
TEM grid	Ted Pella	FCF-400Cu
Tris base	Fisher	BP152-500
Triton X-100	EMD Chemicals	TX1568-1
β-mercaptoethanol	Fisher	O3446I-100
			Tissue Culture
Fetal bovine serum	Invitrogen	12483-020
Hemocytometer	Fisher	0267110
HT-29 cells	ATCC	HTB-38
L-glutamine	Invitrogen	25030-080
PBS	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	10378-016
RPMI-1640	Invitrogen	31800-089
Tissue culture flasks	Corning	431080	175 cm2
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300-054
			Animal Studies
18% Protein Rodent Diet	Harlan Teklad	Teklad Global 2018S	Alfalfa free diet
Insulin syringe	BD Biosciences	329410	28 gauge
Isoflurane	Baxter	AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane	BD Biosciences	356234
NCR nu/nu mice			CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe	BD Biosciences	305196	18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Andwin Scientific	4583