Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Özet

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Özet

Nanomalzemelerin kullanımı malzeme bilimi ve tıp devrim potansiyeline sahiptir. Şu anda değişik nanopartiküller bir dizi görüntüleme ve tedavi uygulamaları için araştırılmaktadır. Bitkilerden elde edilen viral nanopartikül (VNPs) belirlenmiş boyutlarda ve şekillerde ile kendini monte bionanomaterials olarak kabul edilebilir. Steinmetz laboratuarda inceleme altına Bitki virüsleri çapı 30 nm her ikisi de Börülce mozaik virüsü (CPMV) ve Brom mozaik virüsü (BMV) oluşan icosahedral parçacıkları içerir. Biz de şu bitki virüsleri türetilen çubuk şeklinde ve ipliksi yapılar geliştiriyoruz: 18 nm 300 nm boyutlarında ve ipliksi parçacıklar 515 oluştururlar Patates X virüsü (PVX), rijit çubuklar oluşturur Tütün mozaik virüsü (TMV), uzunluk ve genişlik olarak 13 nm olarak nm (okuyucu Refs ifade edilir. VNPs hakkında daha fazla bilgi için ¹ ve ^2).

planta büyük ölçekte kolaylıkla üretilebilir, son derece istikrarlı ve biyouyumlu vardır. Ayrıca, VNPs özellikle genetik modifikasyon veya kimyasal bioconjugation yöntemleri ³ kullanılarak tasarlanmış olabilir "programlanabilir" birimlerdir. VNPs yapısı atomik çözüm bulunmakta olduğu bilinmektedir, ve modifikasyonlar atomik seviyede ^4, mevcut teknoloji teknolojileri ile sentetik nano kullanılarak elde edilemeyen bir kontrol seviyesinde uzaysal hassasiyet ile gerçekleştirilebilir.

Bu yazıda CPMV, PVX, TMV ve Vigna ungiuculata ve Nicotiana benthamiana bitkilerde BMV yayılımı tanımlar. Her VNP için Ekstraksiyon ve saflaştırma protokolleri verilmektedir. Saflaştırılmış ve kimyasal-etiketli VNPs karakterizasyonu için yöntemler tarif edilmiştir. Bu çalışmada, ch odaklanmakemical florofor ile VNPs etiketlenmesi (örneğin Alexa Fluor 647) ve polietilen glikol (PEG). Boyalar izleme ve ^5-10 VNPs tespiti kolaylaştırmak ve onların farmakokinetiği ^8,11 artırırken PEG protein nanopartiküller immünojenite azaltır. Biz bir fare ksenogreft tümör modeli kullanılarak Pegile VNPs yuvalandırma tümör ortaya. Maestro Görüntüleme Sistemi kullanılarak dokuların ex vivo floresan görüntüleme, homojenize dokularda floresans ölçme ve konfokal mikroskopi kombinasyonu biyodağılımını incelemek için kullanılır. VNPs retiküloendotelyal sistem (RES) ile temizlenir; homing tümör geliştirilmiş geçirgenlik ve saklama (EPR) etkisi ¹² ile pasif olarak elde edilir. VNP nanoteknoloji güçlü bir plug-and-play görüntü teknolojisi ve in vivo hastalık siteleri tedavi. Bu daha fazla ilaç için yük ve klinik olarak-ilgili görüntüleme kısımları gibi doku-spesifik ligandlar taşımak için VNPs geliştirmektedirkanser ve kardiyovasküler hastalık aşırı eksprese moleküler reseptörleri hedef.

Protokol

1. VNP (CPMV, BMV, PVX ve TMV) Yayılım

1. Kapalı bitki odasının günün 15 saat (% 100 ışık, 25 ° C,% 65 nem) ve gece 9 saat (% 0 ışık, 22 ° C,% 60 nem) kontrollerini ayarlayın.
2. Tablo 1'de çizelgesine göre bitki inoküle edin.

CPMV	PVX, TMV ve BMV
Gün 0: Bitki 3 börülce tohum / saksı.	Gün 0: Bitki ~ 30 N. benthamiana tohum / saksı. 1 çorba kaşığı gübre / 5 L su ile haftada bir kez gübreleyin.
	Gün 14: 1 Bitki / pot Re-pot N. benthamiana.
Gün 10: Infect korindon tozunu bir ışık kullanarak mekanik inokulasyon tarafından CPMV (5 μg/50 ul / yaprak) ile primer yapraklar bırakır.	Gün 28: Infect üç five korindon tozunu bir ışık kullanarak mekanik inokulasyon yoluyla PVX, TMV veya BMV (5 μg/50 ul / yaprak) ile bırakır.
Gün 20: Hasat yaprak ve -80 mağaza ° C.	Gün 42: Hasat yaprak ve -80 mağaza ° C.

, Büyüyen bulaşmasını ve yaprakları hasat için Tablo 1. Timeline.

Not: Sadece CPMV yayma, örnek olarak gösterilmiştir.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, ve TMV) saflaştırılması

Not: Tüm adımlar buz üzerinde veya 4 yürütülmektedir ° C

1. Soğuk tampon 2 cilt (bkz. Tablo 2) kullanılarak standart bir blender dondurulmuş yaprakları 100 g homojenize. Tülbent 2-3 katmanları süzülür.
2. PVX için, 1 M HCl ile pH 6.5 'e ayarlayın. % 0.2 (w / v) askorbik asit ve% 0.2 (w / v) sodyum sulfi eklemete.
3. 20 dakika boyunca 5.500 xg'de ham bitki Homojenat santrifüjleyin. Süpernatant toplayın.
4. BMV için, tabaka% 10 (w / v) sakaroz çözeltisi, 5 ml süpernatant üzerine, 25 ml. % 38.5 CsCl çözeltisi (w / v) içinde 3 saat ve pelet tekrar süspansiyon 9,000 x g'de santrifüjleyin. 5 saat sallayarak karıştırın, ardından adım 2.12 ile devam edin.
5. 1:1 (v / v) kloroform :1-bütanol 0.7 hacim ekleme yoluyla bitki materyali ayıklamak. 30-60 dakika boyunca karışımı karıştırın.
6. 20 dakika boyunca 5,500 x g çözelti santrifüjleyin. Üst sulu faz toplanır.
7. M 0.2 ve% 8 (ağırlık / hacim) PEG (MW 8000) ile NaCl ekleyin. TMV için, aynı zamanda (v / v) Triton X-100,% 1 ekleyin. En az 1 saat süre ile karıştırınız, sonra en az 1 saat boyunca bekletilir.
8. 15 dakika boyunca 15.000 xg'de çözümü santrifüjleyin. 10 ml tampon içinde yeniden süspanse pelet. PVX için, 0.5 M için% 0.1 β-merkaptoetanol ve üre ekleyin
9. 30 dakika boyunca 8.000 xg'de santrifüjleyin ve süpernatant toplamak.
10. 3 saat boyunca 160,000 x g süpernatant Ultrasantrifüj. 5 ml tampon o da süspanse peletvernight.
11. Eşit hacimde% 10,% 20,% 30, ve tampon içinde% 40 sakaroz (ağır ilk) ile bir% 10-40 oranında sakaroz eğim hazırlayın. Gradyan oda sıcaklığında gece boyunca dengelenmeye bırakın.
12. Ultrasantrifüj 2 saat (BMV için 24 saat) için 100.000 xg'de sukroz gradient üzerinde pelet yeniden süspanse.
13. Işık saçılması bandı toplayın ve tampon karşı dialyze.
14. 4'te VNPs (aşağıda) ve mağaza Karakterize ° C. Uzun süreli depolama için, -80 ° C'de saklayın

CPMV ve TMV	0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0) 38.5 mM KH 2 PO 4 61.5 mM K 2 HPO 4
PVX	0.5 M borat tamponu (pH 7.8) 0.5 M borik asit NaOH ile pH ayarlama
BMV	SAMA tamponu (pH 4.5) 250 mM sodyum asetat 10 mM MgCl2 2 mM β-merkaptoetanol (taze ekleyin)

Tablo 2. Her VNP için Tamponlar ve kendi tarifleri.

Not: Sadece CPMV yayma, örnek olarak gösterilmiştir.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX ve TMV) Karakterizasyonu

1. VNPs konsantrasyonunu belirlemek için UV / Görünür Bölge spektroskopisi gerçekleştirin.
   1. Bir Nanodrop spektrofotometre kullanılarak numunenin 2 ul absorbansı ölçülür.
   2. Beer-Lambert yasası kullanılarak partikül ve boyaların konsantrasyonu belirleyin (A absorbans A = εcl, ε sönüm katsayısı, c konsantrasyon ve l yol uzunluğu). Yol uzunluğu Nanodrop için 0,1 cm dir.
      VNP özgü nesli katsayıları şunlardır:
      CPMV: 8.1 cm ^-1 mg ^-1 ml (260 nm)
      PVX: 2.97 cm ^-1 mg ^-1 ml (260 nm)
      TMV: 3,0 cm ^-1 mg ^-1 ml (260 nm)
      BMV: 5.15 cm ^-1 mg ^-1 ml (260 nm)
2. Boyut dışlama hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) parçacıkları analiz edin.
   1. Bir Superpoze 6 boyut dışlama kolon ve AKTA Explorer, 0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0) ve 200 ul içinde VNPs yük 50-100 ug kullanılması.
   2. 260 nm (nükleik asit), 280 nm (protein) ve bağlı herhangi boyaların uyarma dalga boyu dedektörü olarak ayarlayın.
   3. 72 dakika boyunca 0.5 ml / dak 'lık bir akış hızında çalışırlar.
   4. Elüsyon profili ve A260: A280 nm VNP hazırlık saf olup olmadığını ve parçacıklar sağlam ve monte olup olmadığını gösterir.
      Aşağıdaki A260: 280 oranlarında saf VNP hazırlık göstermektedir:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1.2 ± 0.1
      TMV:1.1 ± 0.1
      BMV: 1.7 ± 0.1
3. Bireysel kat proteinlere hazırlanması ve konjugasyon saflığını analiz (prekast NuPAGE) Bis-Tris poliakrilamid 4-12% gradyan jel elektroforezi denatüre gerçekleştirin.
   1. Potasyum fosfat tampon 9 ul içinde 10 ug parçacıkların için 4x LDS numune tamponu 3 ml ilave edilir. Disülfid bağlarının yüksek sayısını azaltmak için BMV 4x LDS örnek tampon ve β-merkaptoetanol 3 ul ilave 1 ul ekleyin.
   2. 100, 5 dakika süreyle ısıtma bloğu içinde inkübe ° C.
   3. SDS jel üzerine örnekler yükleyin.
   4. Tampon çalıştıran 1x MOPS 1 saat için 200 V örnekleri çalıştırın.
   5. Floresan ceket proteinleri görselleştirmek için UV ışık altında jel belgeleyin.
   6. Floresan olmayan protein için, 1 saat için Coomassie mavisi (% 0.25 (w / v) Coomassie Brillant Blue R-250,% 30 (v / v) metanol,% 10 (v / v) asetik asit) ile leke.
   7. Gece boyunca% 30 metanol,% 10 asetik asit ile Destain. Change çözüm isteniyorsa.
   8. Beyaz ışık altında jel belgeleyin.
4. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından parçacıkların bütünlüğünü analiz.
   1. 0.1-1 mg / DI su 20 ul ml numune sulandırınız.
   2. Parafilm ile ilgili örnekler 20 ul damla yerleştirin.
   3. TEM ızgara ile damla örtün ve 2 dakika bekletin. Filtre kağıdı ile ızgara üzerinde aşırı Solüsyon Wick.
   4. Kuru esneklik ardından DI bir damla su üzerine koyarak ızgara yıkayın.
   5. % 2'lik bir 20 ul damla (w / v) 2 dk için uranil asetat ile ilgili yerleştirilmesi ile ızgara Leke. Filtre kağıdı ile leke aşırı kapalı Wick.
   6. Suda bir kez daha ızgara yıkayın.
   7. Bir transmisyon elektron mikroskobu altında ızgara gözlemleyin.

4. PEG ve fluorophores, Saflaştırılması, ve karakterizasyonu ile VNPs Kimyasal Konjugasyon

1. Aşağıdaki reaksiyonlar için hesaplamalar için, VNPs molar kütlesi vardır:
   CPMV: 5.6x 10 ⁶ g / mol
   PVX: 35 x 10 ⁶ g / mol
   TMV: 41 x 10 ⁶ g / mol
   BMV: 4.6 x 10 ⁶ g / mol
2. Tek adımlı bir N-hidroksi süksinimit bağlama reaksiyonu kullanılarak CPMV ve PVX yüzey lysines ile boyalar ve PEG konjugatı: Alexa Fluor 647 süksinimidil ester ve 4.500, 2.500 eşdeğer molar eşdeğerleri (tüm molar aşırı VNP göre molar fazlalıkta bakınız) ekleyin NHS PEG (MW 5,000) 0.1 M potasyum fosfat tamponu içinde CPMV için DMSO içinde çözülür. PVX çalışırken, NHS-boya ve NHS-PEG 10.000 molar aşırı ekleyin. CPMV ve PVX nihai konsantrasyon 2 mg / ml DMSO ve içeriği toplam reaksiyon hacmi% 10 olacağı şekilde DMSO ve tampon hacim ayarlayın. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı gece boyunca inkübe edin. CPMV ve PVX, sırasıyla, 300 ve 1,270 adreslenebilir lysines sahiptir. (Okuyucu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denirCPMV ve PVX kimyasal modifikasyonu: ^13-15).
3. Diazonyum kaplin ile TMV tirozinlerin konjugat boyalar ve PEG bakır (I) katalizli azit-alkin siklo izledi.
   1. 0.3 M p-tolüensülfonik asit monohidrat, 3.0 M sodyum nitritin 25 ul, ve 0.68 M damıtık, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, asetonitril içerisinde çözündürüldü 3-ethynylaniline için 75 ul 400 ul karıştırılarak diazonyum tuzu (alkin) hazırlayın.
   2. TMV 1.25 ml (20 mg / ml stok çözeltisi) için NaCl 100 mM borat tamponu, pH 8.8, 3.3 ml ilave edilir.
   3. Bir alkin ligasyon diazonyum bağlanması ile TMV işlemek için eklemek için 3 saat boyunca bir buz banyosu içinde diazonyum tuzu (alkin) çözeltisi 450 ul TMV React. Çözüm açık kahverengi bir renk dönüşecektir. TMV konjugasyon için 2.140 kullanılabilir tirozinlerin vardır.
   4. Adım 4.4 'de tarif edildiği gibi bir sükroz tampon kullanarak nihai ürün üzerine koyulmuştur.
   5. Azid fonksiyonlu Alexa Fluor 647 ve PEG-azid (MW 5000) istimal takıng bakır (I) katalizli azit-alkin siklo (CuAAC). 1 mM CuSO _4, 2 mM AMG, ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında 2 mM sodyum askorbat ile kılıf proteini ve inkübe başına boya ve PEG-azit 2 eşdeğer ekleyin. TMV nihai konsantrasyon tepki 2 mg / ml 'dir ki bu tür tampon hacim ayarlama. (: ^16,17 okuyucu TMV kimyasal modifikasyonu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denir).
4. Lysines ve BMV sistein mutant (cBMV) ve sistein ile PEG boyalar Dualı:
   1. 0.1 M TNKM tampon maddesi (50 mM Tris baz, 50 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 _mM MgCl2, pH 7.4) içinde cBMV için DMSO içinde çözülür Oregon Green 488 süksinimidil ester, 2.000 molar eşdeğer ekleyin. BMV nihai konsantrasyon 1 mg / ml DMSO ve içeriği toplam reaksiyon hacmi% 10 olacağı şekilde DMSO ve tampon hacim ayarlayın. 4. gece boyunca reaksiyon karışımı inkübe ° C'de ışıktan korunur.
   2. Santrifüje kullanarak Purify parçacıklarolarak fugal filtreleri adım 4.4 'de tanımlanmıştır.
   3. Daha önce olduğu gibi aynı reaksiyon koşulları kullanılarak, PEG-maleimit (MW 2,000), 2.000 molar fazlası ilave edin ve 4 de 2 saat boyunca, reaksiyon karışımı inkübe ° C cBMV 180 reaktif lysines ve sistein sahiptir. (: ¹⁸ okuyucu BMV kimyasal modifikasyonu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denir).
5. Saflaştırma: 2.5 saat boyunca 160,000 x g bir% 40 (w / v) sakaroz yastığı çözelti geçirir. Tampon pelet yeniden çözülür. Alternatif olarak, 10 kDa kesme spin-off filtreleri kullanarak uygun tampon karşı dialyze.
6. Karakterizasyon: Pegile ve floresan-etiketli VNPs yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak analiz edilmiştir: görünür / UV spektroskopi, SDS jel elektroforezi, FPLC ve TEM (gösterilmemiştir, ancak, Şekil 6 ve 7'ye bakın).

5. Bir Fare Xenograftlarında Modeli kullanılarak Tümör Hedefleme ve Görüntüleme

1. Kültür HT-29 RPMI medyumu içinde insan kolon kanser hücreleri 175 ^cm2 hücre kültür şişeleri _ile% 5 CO2 içinde% 5 FBS, 37% 1 penisilin-streptomisin,% 1 L-glutamin ° C ile desteklenmiştir.
2. 5 dk için 37 ° C 'de tripsin-EDTA 5 ml steril PBS ile inkübe ederek ve hasat ile iki kere yıkayın hücrelerini. RPMI ortam 5 ml tripsin inaktive eder. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüj hücreleri toplayın. 4 at 5x10 ⁶ cells/50 ul orta (tripan mavi ve bir hemasitometre kullanarak toplam hücre sayısını belirlemek) taze RPMI ° C ve tekrar süspansiyon. Enjeksiyonu (tüm çözeltiler ve reaktifler steril tutmak) öncesinde Matrigel eşit hacmi ile karıştırın.
3. Procure altı hafta eski NCR nu / nu farelerine ve 2 hafta boyunca bir yonca ücretsiz diyet onları korumak. [Not:. Bütün hayvan prosedürleri IACUC onaylanmış olmalıdır] subkutan enjeksiyon yoluyla tümör xenografts øndükle 5x10 ⁶ cells/100 steril bir 18 1/2 ölçü kullanarak yamaçlarında ul / tümör (2 tümörler / fare)iğne. Düzenli hayvanları izleyin. Pergel ile ölçülür ve tümör boyutu tümör 20 mm ³ (bir sonraki 12 gün içinde) bir ortalama hacim büyümesine izin verir. PBS ve VNP (n = 3 hayvan / grup / zaman noktası): rastgele iki farklı grup fareler atayın. Bir 1 ml 28 gauge insülin şırıngası kullanılarak, damar içi steril PBS kuyruk damarından enjeksiyon 100 ul ya da 10 mg / kg VNP formülasyon tarafından idare.

Not: Canlı hayvanlar ile Doku kültürü deneyleri ve çalışmalar göstermiştir olmayacaktır. Hands-on gösteri doku işleme ve veri toplama ile sınırlı olacaktır. HT-29 tümör ksenogreft modelinde bir referans için, okuyucunun ref adlandırılır. ¹⁹

Üç teknikleri VNPs yuvalandırma tümörü değerlendirmek için kullanılır:

4. CO ₂ kullanarak farklı zaman noktalarında (2, 24 ve 72 saat) de Kurban fareler: Maestro Görüntüleme Sistemi kullanarak Floresans görüntülemegaz. Kanatlarda tümörleri ile birlikte hayvan ve tüketim tüm önemli organları (beyin, kalp, akciğer, dalak, böbrek ve karaciğer) teşrih, parafilm üzerindeki dokular yerleştirin ve (800 ms sarı eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanarak floresan görüntüleme cihazı ile analiz dokularda floresan sinyalleri (VNPs konjuge A647 etiket türetilen) varlığını tespit maruz kalma). Görüntüleri kaydedin ve ImageJ 1.44o yazılımını kullanarak (floresan yoğunlukları analiz http://imagej.nih.gov/ij ). Süre ile diğer dokularda önemli olan tümörlerde VNPs alımını paterni karşılaştırın.
5. Görüntüleme sonra yarıda her doku kesilmiş ve kriyo-kesit ve konfokal analizi için Ekim bileşik bir buçuk gömün. Önceden tartılmış kriyo-flakonlarda diğer yarısı toplayın ve bunları hemen sıvı N ₂ kullanarak dondurma. Mağaza -80 ° C daha fazla işlem için hazır olana kadar.
6. Floresans ölçümü: Rekord dokuları ağırlıkları. Oda sıcaklığında dondurulmuş doku çözülme ve PBS 1 ml içeren ayrı 50 ml Falcon tüpleri yerleştirin. Bir el dokusu homojenizatör kullanarak, PBS içinde 2-3 dakika süreyle doku homojenize sonra mikrofuge'de tüplere homojenat aktarın. Non-homojenize doku kaldırmak için 13.000 g'de 10 dakika süreyle homojenatlarında santrifüjleyin.
7. 384 de siyah UV plaka içine her grup (PBS ve VNP formülasyonları / zaman puan) dokulardan süpernatant pipetleyin 100 ul. Bir plaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğu (Ex / Em dalga boylarında 600/665) değerlendirin. Doku ağırlıkları ile elde edilen floresan değerlerini normalleştirmek.
8. İmmünohistokimya: -20 ° C'de kriyo-mikrotom bölümleri (10 mikron) ve mağaza hazırlayın Hücre çekirdeğinin (DAPI) ve endotel hücre işaretleyici (CD31 antikoru anti-fare FITC-etiketli) için doku kesitleri Leke. Floresan-etiketli VNP ve vasküler ve intra-tümöral yerelleştirme haritasına konfokal mikroskopi analizi yapıns.

Not: Bu işlem ortaya olmayacak, temsilci veriler Şekil 8 'de gösterilmiştir. Immünohistokimya ve anlatılan boyama yöntemleri ile ilgili bir başvuru için okuyucu ref adlandırılır. ¹⁹

Sonuçlar

Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation.

Tartışmalar

Bu protokol vivo tümör görüntüleme için VNPs ve uygulamaları kimyasal modifikasyonu için bir yaklaşım sağlar. Burada sunulan hayvan floresan görüntüleme, floresans ölçme ve immunohistokimyasal teknikler biyodağılımını okuyan ve tümör homing değerlendirmek için yararlıdır. Bu teknikler EPR etkisi ile tümörün nanopartiküller erişim konusunda değerli bilgiler sağlamaktadır. Çeşitli analitik yöntemlerle elde edilen sonuçları birleştirerek, VNPs lokalizasyonu ve biyo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			VNP production
Indoor plant chamber	Percival Scientific	E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5)	Burpee	51771A
N. benthamiana seeds			N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum	Fisher	C192-500
Pro-mix BX potting soil	Premier Horticulture	713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer	JR Peters	77860
			Equipment
50.2 Ti rotor	Beckman	337901
SW 32 Ti rotor	Beckman	369694
Optima L-90K ultracentrifuge	Beckman	365672
SLA-3000 rotor	Thermo Scientific	07149
SS-34 rotor	Thermo Scientific	28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific	46910
Polypropylene bottle	Beckman	355607	For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	357002	For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube	Beckman	344058	For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	355618	For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system	Invitrogen	EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph	GE Healthcare	28-4062-66
Allegra X-12R	Beckman	392302	Benchtop centrifuge
Cryostat	Leica	CM1850
Maestro 2	Caliper Life Sciences		In vivo imaging system
Tissue-Tearor	Biospec Products	985370-395
Microplate reader	Tecan	Infinite-200
Transmission electron microscope	ZEISS	Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
			Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline	Sigma Aldrich	498289-5G
384 well black plate	BD Biosciences	353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel	Invitrogen	NP0321BOX
4X LDS sample buffer	Invitrogen	NP0008
Acetic Acid	Fisher	A385-500
Acetonitrile	Sigma Aldrich	271004-1L
Alexa Fluor 647 azide	Invitrogen	A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters	Millipore	UFC501096	10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride	Acros Organics	36891-0250
Boric acid	Fisher	A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher	BP101-25
CsCl	Acros Organics	42285-1000
DAPI	MP Biomedicals	157574
Dimethyl sulfoxide	Fisher	BP231-100
Filter paper	Fisher	09-801K	P5 grade
FITC anti-mouse CD31	BioLegend	102406
Goat serum	Invitrogen	16210-064
KCl	Fisher	BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt	Acros Organics	35268-0050
Methanol	Fisher	A412P-4
MgCl2	Fisher	BP214-500
Microscope slides	Fisher	12-544-3
Microscope cover glass	VWR	48366-277
MOPS buffer	Invitrogen	NP0001
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-2k	MW 2000
mPEG-N3	Nanocs	PG1-AZ-5k	MW 5000
mPEG-NHS	Nanocs	PG1-SC-5k	MW 5000
NaCl	Fisher	BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer*	Invitrogen	O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate	Acros Organics	13902-0050
Permount	Fisher	SP15-100
Potassium phosphate dibasic	Fisher	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher	BP362-1
Sodium acetate	Fisher	BP333-500
Sodium nitrite	Acros Organics	42435-0050
Sodium sulfite	Amresco	0628-500G
Sucrose	Fisher	S6-500
TEM grid	Ted Pella	FCF-400Cu
Tris base	Fisher	BP152-500
Triton X-100	EMD Chemicals	TX1568-1
β-mercaptoethanol	Fisher	O3446I-100
			Tissue Culture
Fetal bovine serum	Invitrogen	12483-020
Hemocytometer	Fisher	0267110
HT-29 cells	ATCC	HTB-38
L-glutamine	Invitrogen	25030-080
PBS	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	10378-016
RPMI-1640	Invitrogen	31800-089
Tissue culture flasks	Corning	431080	175 cm2
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300-054
			Animal Studies
18% Protein Rodent Diet	Harlan Teklad	Teklad Global 2018S	Alfalfa free diet
Insulin syringe	BD Biosciences	329410	28 gauge
Isoflurane	Baxter	AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane	BD Biosciences	356234
NCR nu/nu mice			CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe	BD Biosciences	305196	18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Andwin Scientific	4583