에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

요약

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

초록

나노 소재의 사용은 재료 과학 및 의학에 혁명을 할 수있는 가능성이 있습니다. 현재, 서로 다른 나노 입자의 수​​는 이미징 및 치료에 응용 프로그램에 조사하고 있습니다. 식물에서 파생 바이러스 성 나노 입자 (VNPs)가 정의 크기와 모양으로 자기 조립 bionanomaterials으로 간주 할 수 있습니다. Steinmetz 연구실에서 조사중인 공장 바이러스는 직경 30 nm의 아르 둘 다 Cowpea 모자이크 바이러스 (CPMV)와 Brome 모자이크 바이러스 (BMV)에 의해 형성 icosahedral 입자가 포함되어 있습니다. 우리는 또한 다음과 같은 식물 바이러스로부터 파생 된 막대 모양과 filamentous 구조를 개발하고 있습니다 : 18 나노 미터로 300 nm의 크기, 그리고 filamentous 입자 515를 형성 감자 바이러스 X (PVX)로 강성 봉을 형성 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 길이, 폭 13 나노 미터의 나노 미터는 (독자는 심판이 판결이라고합니다. VNPs에 대한 자세한 내용은 ^{1, 2).}

planta에 대규모로 쉽게 제작 할 수 매우 안정적이고 biocompatible 있습니다. 또한, VNPs는 특히 유전자 변형 또는 화학 bioconjugation 방법 ^3을 사용 설계 할 수 있습니다 "프로그램"단위입니다. VNPs의 구조는 원자 해상도로 알려져 있으며, 수정은 원자 레벨 ^4, 현재의 최첨단 기술과 합성 나노 소재를 사용하여 달성 할 수없는 제어 수준의 공간적 정밀도로 수행 할 수 있습니다.

이 논문에서, 우리는 CPMV, PVX, TMV, 그리고 Vigna ungiuculata와 Nicotiana benthamiana 공장에서 BMV의 전파에 대해 설명합니다. 각 VNP에 대한 추출 및 정제 프로토콜은 주어집니다. 정화되고 화학적으로 라벨이 표시된 VNPs의 특성에 대한 방법은 설명되어 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 채널에 초점을emical fluorophores과 VNPs의 라벨 (예를 들면, 알렉사 형석 647) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 염료는 추적 및 ^5-10 VNPs의 확인을 용이하게하고, 자신의 pharmacokinetics ^8,11을 향상하는 동안 PEG는 proteinaceous 나노 입자의 immunogenicity을 감소시킨다. 우리는 마우스 이종 이식 종양 모델을 사용 PEGylated VNPs의 유도 종양을 보여줍니다. 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 조직 예 생체의 형광 이미징, 균질 조직의 형광 정량화하고, 공 촛점 현미경의 조합이 biodistribution을 연구하는 데 사용됩니다. VNPs는 reticuloendothelial 시스템 (RES)를 통해 해제되며, 추적 종양이 향상된 투자율 및 유지 (EPR) 효과를 통해 수동적으로 ¹² 달성된다. VNP의 나노 기술은 강력한 플러그 앤 플레이 이미지에 기술하고 생체 내 질병의 사이트를 취급합니다. 우리는 더에 약물 cargos 및 임상 - 관련 영상 moieties뿐만 아니라 조직 별 리간드를 수행 할 VNPs를 개발하고 있습니다암과 심장 혈관 질환에 overexpressed 분자 수용체를 타겟팅합니다.

프로토콜

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 전파

1. 실내 식물 챔버 하루 15 시간 (100 % 등, 25 ° C, 65 % 습도)와 밤 9 시간 (0 % 등, 22 ° C, 60 % 습도)에 제어합니다.
2. 표 1의 타임 라인에 따라 식물의 예방.

CPMV	PVX, TMV, 그리고 BMV
일 0 : 공장 3 cowpea 씨앗 / 화분.	일 0 : 공장 ~ 30 N. benthamiana 씨 / 냄비. 1 큰술 비료 / 5 L의 물을 일주일에 한 번 비옥.
	일 14 : 1 공장 / 냄비에서 다시 냄비 N. benthamiana.
10 일 : 감염은 카보 런덤의 살충제 빛을 사용하여 기계 접종하여 CPMV (5 μg/50 μl / 잎)를 기본 잎을 남긴다.	일 28 : 감염 3 F필자는 카보 런덤의 살충제 빛을 사용하여 기계 접종하여 PVX, TMV, 또는 BMV (5 μg/50 μl / 잎)로 출발합니다.
일 20 : 수확 잎과 -80에 저장 ° C.	일 42 : 수확 잎과 -80에 저장 ° C.

성장 감염, 그리고 잎을 수확을위한 표 1. 타임 라인.

참고 : CPMV 전파가 예제로 증명된다.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 정화

참고 : 모든 단계는 얼음 또는 4에서 수행되는 ° C.

1. 추위 버퍼 2 볼륨을 (표 2 참조)를 사용하여 표준 믹서기에서 냉동 잎 100g을 균질화. 일종의 투박한 무명로부터 2-3 층을 통해 필터링 할 수 있습니다.
2. PVX를 들어, 1 M HCL을 사용하여 6.5에 pH를 조정합니다. 0.2 % (w / V) 아스코르브 산 및 0.2 % (w / V) 나트륨 sulfi을 추가테.
3. 20 분에 5,500 XG에서 원유 공장 homogenate를 원심 분리기. 표면에 뜨는 수집합니다.
4. BMV를 들어, 레이어 10 % (w / V) 자당 솔루션의 5 ML 이상 표면에 뜨는 25 ML. 38.5 % CsCl 용액 (w / V)의 3 시간과 resuspend 펠릿을위한 9,000 XG에서 원심 분리기. 5 시간에 진동에 의한 혼합 한 다음 단계 2.12를 계속합니다.
5. 1시 1분 (V / V) 클로로포름 :1-부탄올의 0.7 볼륨을 추가하여 식물 자료를 추출합니다. 30-60 분 동안 혼합물을 저어.
6. 20 분에 5,500 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 위 수성 단계를 수집합니다.
7. 0.2 M와 8 % (w / V) PEG (MW 8000)에 NaCl을 추가합니다. TMV의 경우도 (V / V) 트라이 튼 X-100 1 %를 추가 할 수 있습니다. 적어도 1 시간에 저어, 최소한 1 시간에 앉아 보자.
8. 15 분에 15,000 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 버퍼의 10 ML에 Resuspend 펠릿. PVX를 들어, 0.5 M.에 0.1 % β-메르 캅토 에탄올 및 요소를 추가
9. 30 분에 8,000 XG에 원심 분리기와 표면에 뜨는 수집합니다.
10. 3 시간에 160,000 XG에 표면에 뜨는을 Ultracentrifuge. 5 ML 버퍼 O에 Resuspend 펠릿vernight.
11. 동일한 10 % 권, 20 %, 30 %, 및 버퍼에 40 % 자당을 (무거운 첫 번째)를 사용하여 10-40%의 자당 기울기를 준비합니다. 기울기가 실온에서 하룻밤 평형 할 수 있습니다.
12. Ultracentrifuge은 2 시간 (BMV 24 시간)에 100,000 XG에서 자당 기울기를 통해 펠릿을 resuspended.
13. 광 분산 밴드를 수집하고 버퍼에 대한 dialyze.
14. 4에 VNPs (아래)와 상점을 특징 ° C. 장기 저장을 위해, -80에 저장 ° C.를

CPMV 및 TMV	0.1 M의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7.0) 38.5 MM KH 2 PO 4 61.5 MM K 2 HPO 4
PVX	0.5 M borate 버퍼 (산도 7.8) 0.5 M 붕소의 산성 NaOH로 pH를 조정
BMV	사마 버퍼 (산도 4.5) 250 MM 나트륨 아세테이트 10 MM MgCl 2 이 MM β-메르 캅토 에탄올 (신선한 추가)

표 2. 각 VNP에 대한 버퍼 및 요리법.

참고 : CPMV 전파가 예제로 증명된다.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 특성

1. VNPs의 농도를 결정하기 위해 UV / 눈에 보이는 분광을 수행합니다.
   1. NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 샘​​플 2 μl의 흡광도를 측정합니다.
   2. 맥주 램버트 법을 사용하여 입자와 염료의 농도를 결정 (A는 흡광도입니다 A = εcl, ε 흡광 계수이며, C는 농도이며, 전 경로 길이입니다.) 경로 길이는 NanoDrop에 0.1 cm입니다.
      VNP 별 흡광 계수는 다음과 같습니다
      CPMV : 8.1 cm ^-1 MG ^-1 ML (260 nm의에서)
      PVX : 2.97 cm ^-1 MG ^-1 ML (260 nm의에서)
      TMV : 3.0 cm ^-1 MG ^-1 ML (260 nm의에서)
      BMV : 5.15 cm ^-1 MG ^-1 ML (260 nm의에서)
2. 크기 제외 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)에 의해 입자를 분석합니다.
   1. Superose 6 크기 배제 컬럼과 악타 익스플로러, 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7.0) 200 μl에 VNPs의 부하 50-100 μg을 사용합니다.
   2. 260 나노 미터 (핵산), 280 nm의 (단백질), 그리고 연결된 염료의 여기 파장에 감지기를 설정합니다.
   3. 72 분 동안 0.5 ML / 분의 유량으로 실행합니다.
   4. 용출 프로필과 A260 : A280 나노 미터는 VNP 준비가 순수 여부와 입자가 온전하고 조립 있는지 여부를 나타냅니다.
      다음 A260 : 280 비율이 순수한 VNP 준비를 나타냅니다 :
      CPMV : 1.8 ± 0.1
      PVX : 1.2 ± 0.1
      TMV :1.1 ± 0.1
      BMV : 1.7 ± 0.1
3. 개별 코트 단백질에 준비 및 활용의 순도를 분석 할 (예정 주물 NuPAGE) 비스 - 트리스의 polyacrylamide 4-12% 기울기 겔 전기 영동을 denaturing 수행합니다.
   1. 인산 칼륨 버퍼의 9 μl에있는 입자의 10 μg에 4X LDS 샘플 버퍼 3 ML을 추가합니다. 이황화 채권의 높은 수를 줄이기 위해 BMV에 4X LDS 샘플 버퍼와 β-메르 캅토 에탄올 3 μl의 추가 1 μl를 추가합니다.
   2. 100 5 분에 열 블록에 품다 ° C.
   3. SDS 젤에 샘플을로드합니다.
   4. 버퍼를 실행 1X 걸레에 1 시간에 대해 200 V에서 샘플을 실행합니다.
   5. 형광 코트 단백질을 시각화하기 위해 UV 빛 아래에있는 젤을 문서화.
   6. 비 형광 단백질의 경우 1 시간에 Coomassie 블루 (0.25 % (w / V) Coomassie 브릴리언트 블루 R-250, 30 % (V / V) 메탄올, 10 % (V / V) 아세트산 산)와 얼룩.
   7. 밤새 30 % 메탄올, 10 % 아세트산과 Destain. 찬GE는이 솔루션이 필요합니다.
   8. 하얀 빛 아래 젤을 문서화.
4. 전송 전자 현미경 (TEM)에 의한 입자의 무결성을 분석합니다.
   1. 0.1-1 MG / DI 물을 20 μl의 ML에 샘플을 희석.
   2. Parafilm에있는 샘플의 20 μl 방울을 넣으십시오.
   3. TEM 그리드와 방울을 커버 2 분 동안 앉아 보자. 필터 종이 그리드에 초과 솔루션을 위크.
   4. 드라이 wicking 후 DI 워터 드롭 배치하여 격자를 씻으십시오.
   5. 2 % 20 μl 드롭 (w / V) 2 분에 대한 uranyl 아세트산에 배치하여 격자를 청바지. 필터 종이 얼룩 초과를 위크.
   6. 물에 한 번 더 그리드를 씻으십시오.
   7. 전송 전자 현미경으로 격자를 관찰.

4. PEG와 Fluorophores, 정제 및 특성과 VNPs의 화학 결합

1. 아래의 반응에 대한 계산은 VNPs의 몰 질량은 다음과 같습니다
   CPMV : 5.6X 10 ⁶ G / 몰
   PVX : 35 X 10 ⁶ G / 몰
   TMV : 41 X 10 ⁶ G / 몰
   BMV : 4.6 X 10 ⁶ G / 몰
2. 한 단계 N-하이드 록시 succinimide 커플 링 반응을 이용하여 CPMV과 PVX의 표면 lysines에 염료와 PEG를 공액 : 알렉사 형석 647 succinimidyl 에스테르 및 4500 등가물의 2500 몰 등가물 (모든 어금니 과도한는 VNP 당 어금니를 초과 참조) 추가 NHS를 PEG (MW 5,000) 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼에 CPMV에 DMSO에 용해. PVX와 함께 작업 할 경우 NHS-염색 및 NHS-PEG의 만 몰 초과를 추가합니다. CPMV와 PVX의 최종 농도가 2 밀리그램 / ML 및 DMSO 콘텐츠가 전체 반응 부피의 10 %입니다 그러한 버퍼와 DMSO 볼륨을 조정합니다. 빛으로부터 보호 상온에서 반응 혼합물은 하루 아침에 품다. CPMV 및 PVX는 각각 300 및 1270 번지 lysines 있습니다. (독자가에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다CPMV 및 PVX의 화학 수정 : ^13-15).
3. diazonium 커플 링에 의한 TMV의 tyrosines에 공액 염료와 PEG는 구리 (I) 촉매 azide - alkyne cycloaddition이 나타납니다.
   1. 0.3 M P-toluenesulfonic의 산성 일 수화물, 3.0 M의 아질산 나트륨의 25 μl, 그리고 0.68 M 소주 1 시간에 대해 4 ° C에서 아세토 니트릴에 용해 3 ethynylaniline의 75 μl 400 μl를 혼합하여 diazonium 염 (alkyne)를 준비합니다.
   2. TMV의 1.25 ML (20 MG / ML 주식 솔루션)에 NaCl 100 MM를 포함하는 borate 버퍼, 산도 8.8의 3.3 ML를 추가합니다.
   3. alkyne 결합이 diazonium 커플 링으로 TMV에 처리 추가하는 3 시간에 얼음 욕조에서 diazonium 염 (alkyne) 솔루션 450 μl로 TMV를 반응한다. 이 솔루션은 밝은 갈색 컬러로 돌아갈 것입니다. TMV는 활용을위한 2140 사용할 수 tyrosines 있습니다.
   4. 단계 4.4에 설명 된대로 자당의 쿠션을 사용하여 최종 제품을 정화.
   5. azide - 기능 알렉사 형석 647 및 PEG-azide (MW 5,000) 쓰겠다고를 첨부g의 구리 (I) 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (CuAAC). 1 ㎜ CuSO _4, 2 MM의 AMG, 그리고 15 분 동안 실온에서 2 MM 나트륨 아스 코브 산으로 코트의 단백질과 품다 당 염료 및 PEG-azide 2 동등을 추가합니다. TMV의 최종 반응 농도가 2 밀리그램 / ML이라는 버퍼 볼륨 등 조정합니다. (: ^16,17 리더는 TMV의 화학 수정에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다.)
4. lysines 및 BMV 시스테인 돌연변이 (cBMV)의 cysteine​​s에 PEG에 염료를 변화시키다 :
   1. 0.1 M TNKM 버퍼 (50 MM 트리스베이스, 50 MM NaCl, 10 MM KCl, 5 MM MgCl _2, 산도 7.4)에 cBMV에 DMSO에 용해 오레곤 그린 488 succinimidyl 에스테르 2,000 몰 동등을 추가합니다. BMV의 최종 농도가 1 MG / ML 및 DMSO 콘텐츠가 전체 반응 부피의 10 %입니다 그러한 버퍼와 DMSO 볼륨을 조정합니다. 4에서 하룻밤 반응 혼합물을 품어 ° C 빛으로부터 보호되고 있습니다.
   2. centri를 사용하여 정화 입자같은 fugal 필터는 단계 4.4에 설명되어 있습니다.
   3. 이전과 동일한 반응 조건을 사용하여 PEG-maleimide (MW 2000)의 2000 몰 초과를 추가하고 4시에 2 시간의 반응 혼합물을 품어 ° C. cBMV 180 반응 lysines과 cysteine​​s 있습니다. (: ¹⁸ 리더는 BMV의 화학 수정에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다.)
5. 정제 : 2.5 시간에 160,000 XG의 40 % (w / V) 자당의 쿠션을 통해 솔루션을 전달합니다. 버퍼에 펠렛를 다시 분해. 또한, 10 kDa 컷 - 오프 스핀 필터를 사용 적절한 버퍼에 대한 dialyze.
6. 특성화 : PEGylated과 휘황-라벨 VNPs은 위에서 설명한 방법 사용 분석 : 표시 / UV 분광, SDS 겔 전기 영동, FPLC, 그리고 TEM (미도 그러나,도 6 및 7 참조).

5. 마우스 이종 이식 모델을 사용하여 종양 타겟팅 및 이미징

1. 문화 HT-29 RPMI 매체에서 인간 대장 암 세포는 ^175cm이 세포 배양 플라스크를 사용하여 5 % CO ₂ 5 % FBS, 37시 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신, 그리고 1% L-글루타민 ° C로 보충.
2. 5 분에 37 ° C에서 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 5 ML과 잠복기에 의해 멸균 PBS와 수확을 두 번 세포를 씻으십시오. RPMI 매체의 5 ML과 트립신을 비활성화. 5 분 500 XG에 centrifuging하여 세포를 수집합니다. 4에 5x10 ⁶ cells/50 μl 매체 (trypan 파랑과 hemocytometer를 사용하여 총 세포 수를 결정)에 신선한 RPMI에서 ° C와 resuspend. 주사 (모든 솔루션 및 시약은 멸균 유지) 이전에 matrigel의 동일한 볼륨으로 섞는다.
3. 조달 6 주 이전 NCR 뉴 / 뉴 마우스, 2 주 알팔파 무료로 다이어트를을 유지하고 있습니다. [참고 :. 모든 동물 절차는 IACUC 승인해야합니다]의 피하 주입하여 종양 xenografts을 유발 5x10 ⁶ cells/100 멸균 18 2분의 1 게이지를 사용하여 측면에서 μl / 종양 (2 종양 / 마우스)바늘. 정기적으로 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정하고 종양 20mm ³ (향후 12 일 이내)의 평균 볼륨으로 성장 할 수 있습니다. PBS와 VNP (N = 3 동물 / 그룹 / 시간 점) : 무작위로 두 개의 서로 다른 그룹에 쥐를 지정합니다. 1 ML 28 게이지 인슐린 주사기를 사용 정맥 주사 멸균 PBS의 꼬리 정맥 주입 100 μl 또는 10 밀리그램 / kg V​​NP 제제에 의해 관리 할 수​​ 있습니다.

참고 : 라이브 동물과 조직 문화 실험과 연구가 증명되지 않습니다. 손 -에 시범 조직 처리 및 데이터 수집으로 제한됩니다. HT-29 종양의 이종 이식 모델에서 참조를 들어, 리더는 심판이라고합니다. ¹⁹

세 기술은 VNPs의 유도 종양을 평가하는 데 사용됩니다 :

4. CO _2를 사용하여 다른 시간 지점 (2, 24, 72 시간)에 희생 마우스 : 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징가스. 측면에있는 종양과 함께 동물과 소비세 모든 주요 기관 (뇌, 심장, 폐, 비장, 신장, 간) 해부, parafilm에 조직을 배치하고, (800 밀리 노란색 여기와 방출 필터를 사용 형광 이미징 장비와 분석 조직에서 형광 신호 (VNPs에 복합 A647 레이블에서 파생)의 존재를 감지 노출). 이미지를 저장하고 ImageJ 1.44o 소프트웨어 (사용 형광 농도 분석 http://imagej.nih.gov/ij을 ). 시간이 주요 조직과 종양의 VNPs의 이해의 패턴을 비교합니다.
5. 이미징 후, 반으로 각 조직을 잘라 cryo-sectioning 및 공 촛점 분석 10월 화합물에 반을 삽입 할 수 있습니다. 미리 무게 cryo-병에 나머지 절반을 수집하고 즉시 액체 N _2를 사용 동결. 스토어 -80 ° C에서 추가 처리를위한 준비가 될 때까지.
6. 형광 정량화 : 재코드는 조직 가중치를. 실온에서 냉동 조직을 해동하고 PBS 1 ML을 포함하는 별도의 50 ML 팔콘 튜브에 배치합니다. 휴대용 조직 균질를 사용하여 PBS에서 2-3 분을위한 조직을 균질화 한 후 microfuge 튜브에 homogenate를 전송합니다. 비 무균 조직을 제거하는 13,000 XG에서 10 분의 homogenates을 원심 분리기.
7. 384도 검은 색 UV 판에 각 그룹 (PBS 및 VNP 공법 / 시간 점)에서 조직의 표면에 뜨는의 Pipet 100 μl. 접시 리더를 사용하여 형광 강도를 (예 / EM 파장 665분의 600) 평가합니다. 조직 가중치에 의해 얻은 형광 값을 정상화.
8. Immunohistochemistry : -20 ° C.에 cryo-마이크로톰 섹션 (10 μm)와 상점을 준비 세포 핵 (DAPI)과 내피 세포 마커 (CD31 항체 안티 - 마우스 FITC-라벨)에 대한 조직 섹션을 청바지. 휘황 - 라벨 VNP의 혈관과 간 tumoral 현지화를 매핑 할 공 촛점 현미경 분석을 수행s입니다.

참고 :이 절차는 증명되지 않습니다 대리인 데이터는 그림 8에 표시됩니다. immunohistochemistry와 설명 착색 방법에 대한 참조를 들어, 리더는 심판이라고합니다. ¹⁹

결과

Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation.

토론

이 프로토콜은 생체 종양 이미징에 대한 VNPs 및 응용 프로그램의 화학 조작을위한 접근 방식을 제공합니다. 여기에 제시된 동물 형광 이미징, 형광 정량화 및 immunohistochemistry 기술 biodistribution을 공부하고 종양 추적 평가하는 데 유용합니다. 이 기술은 EPR 효과를 통해 종양에 나노 입자의 접근에 관한 귀중한 정보를 제공합니다. 다양한 분석 방법의 결과를 결합하여, 우리는 VNPs의 지?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			VNP production
Indoor plant chamber	Percival Scientific	E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5)	Burpee	51771A
N. benthamiana seeds			N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum	Fisher	C192-500
Pro-mix BX potting soil	Premier Horticulture	713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer	JR Peters	77860
			Equipment
50.2 Ti rotor	Beckman	337901
SW 32 Ti rotor	Beckman	369694
Optima L-90K ultracentrifuge	Beckman	365672
SLA-3000 rotor	Thermo Scientific	07149
SS-34 rotor	Thermo Scientific	28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific	46910
Polypropylene bottle	Beckman	355607	For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	357002	For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube	Beckman	344058	For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle	Beckman	355618	For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system	Invitrogen	EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph	GE Healthcare	28-4062-66
Allegra X-12R	Beckman	392302	Benchtop centrifuge
Cryostat	Leica	CM1850
Maestro 2	Caliper Life Sciences		In vivo imaging system
Tissue-Tearor	Biospec Products	985370-395
Microplate reader	Tecan	Infinite-200
Transmission electron microscope	ZEISS	Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
			Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline	Sigma Aldrich	498289-5G
384 well black plate	BD Biosciences	353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel	Invitrogen	NP0321BOX
4X LDS sample buffer	Invitrogen	NP0008
Acetic Acid	Fisher	A385-500
Acetonitrile	Sigma Aldrich	271004-1L
Alexa Fluor 647 azide	Invitrogen	A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters	Millipore	UFC501096	10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride	Acros Organics	36891-0250
Boric acid	Fisher	A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher	BP101-25
CsCl	Acros Organics	42285-1000
DAPI	MP Biomedicals	157574
Dimethyl sulfoxide	Fisher	BP231-100
Filter paper	Fisher	09-801K	P5 grade
FITC anti-mouse CD31	BioLegend	102406
Goat serum	Invitrogen	16210-064
KCl	Fisher	BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt	Acros Organics	35268-0050
Methanol	Fisher	A412P-4
MgCl2	Fisher	BP214-500
Microscope slides	Fisher	12-544-3
Microscope cover glass	VWR	48366-277
MOPS buffer	Invitrogen	NP0001
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-2k	MW 2000
mPEG-N3	Nanocs	PG1-AZ-5k	MW 5000
mPEG-NHS	Nanocs	PG1-SC-5k	MW 5000
NaCl	Fisher	BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer*	Invitrogen	O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate	Acros Organics	13902-0050
Permount	Fisher	SP15-100
Potassium phosphate dibasic	Fisher	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher	BP362-1
Sodium acetate	Fisher	BP333-500
Sodium nitrite	Acros Organics	42435-0050
Sodium sulfite	Amresco	0628-500G
Sucrose	Fisher	S6-500
TEM grid	Ted Pella	FCF-400Cu
Tris base	Fisher	BP152-500
Triton X-100	EMD Chemicals	TX1568-1
β-mercaptoethanol	Fisher	O3446I-100
			Tissue Culture
Fetal bovine serum	Invitrogen	12483-020
Hemocytometer	Fisher	0267110
HT-29 cells	ATCC	HTB-38
L-glutamine	Invitrogen	25030-080
PBS	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	10378-016
RPMI-1640	Invitrogen	31800-089
Tissue culture flasks	Corning	431080	175 cm2
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300-054
			Animal Studies
18% Protein Rodent Diet	Harlan Teklad	Teklad Global 2018S	Alfalfa free diet
Insulin syringe	BD Biosciences	329410	28 gauge
Isoflurane	Baxter	AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane	BD Biosciences	356234
NCR nu/nu mice			CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe	BD Biosciences	305196	18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Andwin Scientific	4583