فيفو السابقين خلية الدم الحمراء الفحص انحلال الدم لتقييم درجة الحموضة التي تستجيب لتسليم وكلاء Endosomolytic عصاري خلوي من أدوية Biomacromolecular

Summary

ويمكن استخدام فحص انحلال الدم كشاشة السريع الإنتاجية العالية، من cytocompatibility نظم لتقديم الأدوية 'والنشاط endosomolytic لنقل البضائع داخل الخلايا. الفحص يقيس تعطل الأغشية كرات الدم الحمراء بوصفها وظيفة من درجة الحموضة البيئية.

Abstract

يمكن طبقات ثنائية فسفوليبيد التي تشكل إندو-الليزوزومية الحويصلات تشكل عائقا أمام تسليم المخدرات البيولوجية لأهداف داخل الخلايا. للتغلب على هذا الحاجز، لقد تم تصميم عدد من ناقلات المخدرات الاصطناعية لتعطيل بنشاط الغشاء endosomal وتسليم البضائع إلى السيتوبلازم. هنا، نحن تصف مقايسة انحلال الدم، والتي يمكن أن تستخدم الشاشة السريع الإنتاجية العالية، لcytocompatibility والنشاط داخل الخلايا endosomolytic من نظم لتقديم الأدوية.

في مقايسة انحلال الدم، وخلايا الدم الحمراء ومواد الاختبار شارك في المحتضنة في مخازن في تعريف بالوسط التي تحاكي خارج الخلية، endosomal في وقت مبكر، وأواخر إندو-الليزوزومية البيئات. بعد الطرد المركزي خطوة لخلايا سليمة بيليه الدم الحمراء، يتم قياس طيفيا كمية الهيموجلوبين تطلق في المتوسط ​​(405 نانومتر لمجموعة ديناميكية أفضل). وكميا في المئة ثم خلايا الدم الحمراء نسبة إلى تعطيل عصيدة مراقبة إيجابيةليه هي lysed مع المنظفات. في هذا النظام النموذجي غشاء كرات الدم الحمراء بمثابة بديل للطبقة ثنائية المادة الدهنية التي إحاطة غشاء إندو-الليزوزومية الحويصلات. النتيجة المرجوة هي انحلال الدم لا يذكر في درجة الحموضة الفسيولوجية (7.4) وانحلال الدم قوية في نطاق درجة الحموضة إندو-الليزوزومية من الرقم الهيدروجيني 5-6،8 تقريبا.

Introduction

على الرغم من أن هناك العديد من إمكانيات عالية التأثير الأهداف العلاجية داخل الخلية، وتسليم من وكلاء داخل الخلايا يشكل تحديا كبيرا. في كثير من الأحيان، يتم إدماج المخدرات، وخاصة البيولوجية، والاتجار من قبل خلايا الحويصلات التي تؤدي إلى إما إلى تدهور محتوياتها من خلال مسار إندو-الليزوزومية، أو مكوكية مرة أخرى خارج الخلية عبر الإيماس. ¹ في العملية الأخيرة، ودرجة الحموضة الداخلية من الحويصلات ويحمض إلى 5-6 تقريبا، وهو الرقم الهيدروجيني الأمثل لنشاط الإنزيمات التي تعمل في هذا الحيز، مثل الليزوزيم .. ²

مؤخرا، تم عدد من المواد المهندسة وتحديدا للاستفادة من تحمض الإندوسومات لتسهيل تسليم عصاري خلوي من حمولتها. واحد الأمثلة على هذا النهج يستخدم الاصطناعية، والبوليمر النانوية التي مذيلة الأساسية هي ثنائي الشحنة وهو ورسوم محايدة في درجة الحموضة الفسيولوجية (أي 7.4). ومع ذلك، عند 6.0 درجة الحموضة- 6.5، البوليمرات تصبح البروتونية والحصول على شحنة موجبة صافية أن يزعزع استقرار مذيلة الأساسية، وشرائح البوليمر يتعرض التفاعل مع وتعطيل الغشاء endosomal. وقد تبين هذا النشاط لتعزيز الهروب من endosomal التداوي القائم على حمض النووي الببتيد و، والسماح لهم للوصول إلى أهدافها عصاري خلوي. ^3،4 أمثلة أخرى من الطرق وضعت للتوسط الهروب endosomal التي تعطل حاجز الغشاء تشمل 'fusogenic "الببتيدات أو البروتينات التي يمكن أن توسط الانصهار الغشاء أو تشكيل المسام عابرة في طبقة ثنائية فسفوليبيد .. ⁵ مجموعة السلفات من الأحماض أنيوني الاكريليك ألكيل مثل بولي (حمض propylacrylic) هي مقاربة أخرى مدروسة، وهذه البوليمرات في، الدولة بروتوناتيون من حمض الكربوكسيلية قلادة يملي الانتقال في مسعور، غشاء التخريبية الدولة في نطاقات درجة الحموضة إندو-الليزوزومية. ^6،7

نظام واحد نموذجا مفيدا لفحص السلوك هو endosomolytic هX فيفو مقايسة درجة الحموضة التي تعتمد على انحلال الدم. ⁸ في هذا النظام النموذجي، وغشاء كرات الدم الحمراء بمثابة بديل للطبقة ثنائية المادة الدهنية التي إحاطة غشاء إندو-الليزوزومية الحويصلات. وقد استخدم هذا النموذج للتعميم من قبل الآخرين لتقييم السلوك endosomolytic من اختراق الخلايا الببتيدات وغيرها من أنظمة توصيل الجينات البوليمرية. ^8-11 في هذه التجربة، الإنسان خلايا الدم الحمراء ومواد الاختبار شارك في المحتضنة في مخازن في تعريف بالوسط التي تحاكي خارج الخلية (7.4)، في وقت مبكر endosomal (6.8)، وأواخر إندو-الليزوزومية (<6.8) البيئات. وكميا كمية الهيموجلوبين صدر خلال فترة الحضانة كمقياس لتحلل الخلايا الحمراء في الدم، والتي يتم تطبيع لكمية الهيموجلوبين صدر في عينات مراقبة إيجابية هي lysed مع المنظفات.

من فحص مكتبة صغيرة من مواد الاختبار endosomolytic يحتمل، يمكن للمرء أن يستنتج أن العينات التي تنتج أي انحلال الدم في درجة الحموضة 7.4، ولكن تنحنح مرتفعة بشكل ملحوظolysis في درجة الحموضة <6.5، وسوف يكون المرشحين الأكثر فعالية وcytocompatible لتسليم المخدرات عصاري خلوي. ومن المتوقع أن المواد التي تناسب هذه المعايير أن تظل خاملة وليس بشكل عشوائي تدمير الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية (أي التي يمكن أن تسبب السمسة) حتى التعرض لانخفاض الرقم الهيدروجيني في استيعاب المحلية بعد في إندو-الليزوزومية المقصورات.

في هذا البروتوكول، يتم عزل الكريات الحمراء من المتبرع الإنسان وشارك في حضنت في درجة الحموضة 5.6، 6.2، 6.8، أو 7.4 مع وكلاء التجريبية endosomolytic تسليم المخدرات. الكريات الحمراء سليمة هي مكعبات، ويتم تحليل supernatants (التي تحتوي على الهيموغلوبين أفرج عنه من الكريات الحمراء هي lysed) لامتصاص سمة من الهيموجلوبين عن طريق قارئ لوحة (الشكل 1).

Protocol

1. إعداد وتعقيم المخازن وكلاء الاختبار

1. 150 ملي كلوريد الصوديوم العازلة: 4،383 ز حل بلورات كلوريد الصوديوم في 500 مل من الماء nanopure.
2. المخازن المؤقتة درجة الحموضة: إعداد مخازن الفوسفات في درجة الحموضة 5.6، 6.2، 6.8، و 7.4 عن طريق خلط كميات مناسبة من أحادى فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة و. إذا العينات لفحصها في انخفاض الرقم الهيدروجيني القيم (أي درجة الحموضة <5.6) ثم منطقة عازلة أكثر ملاءمة، مثل سترات العازلة، يجب استخدام. وصفات العازلة متوفرة بسهولة، وقدمت إشارة سبيل المثال هنا ¹²
3. تعقيم جميع المخازن المؤقتة المشار إليها أعلاه من خلال جهاز الترشيح فراغ زجاجة الأعلى وإعادة فحص درجة الحموضة عازلة لل.
4. 20٪ تريتون X-100 (مراقبة إيجابية): مزيج نقي 20 مل تريتون X-100 في 80 مل من الماء nanopure. دوامة بقوة ويصوتن حل. ترك في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها قبل الاستخدام.

2. إعداد تبدي الكريات الحمر

1. الحصول على 25 مل من الدم الابام متبرع مجهول الإنسان، والمستمدة مباشرة إلى K أنابيب Vacutainer _2-EDTA المغلفة لمنع التخثر.

يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات يجب اعتمادها مسبقا من مجلس المراجعة المؤسسية المناسبة (IRB)، وبزل الوريد وجمع الدم من قبل فصاد المدربين من أجل تقليل المخاطر التي يتعرض لها المتبرع: NOTE. وقد نشرت معيار الإجراءات الفصد في أماكن أخرى ¹³

2. أجهزة الطرد المركزي في 500 XG الدم لمدة 5 دقائق، ومستويات الهيماتوكريت علامة (حمراء، وانخفاض طبقة) والبلازما (مصفر، الطبقة العليا) على أنبوب.
3. نضح البلازما بلطف عبر micropipettor، إضافة إلى التبييض، وتجاهل إلى نفايات biohazardous.
4. ملء أنبوب الهيماتوكريت إلى خط علامة (المستوى الأصلي من البلازما) مع محلول كلوريد الصوديوم 150 ملم. الغطاء وقلب عدة مرات لخلط بلطف. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
5. كرر الخطوة 2،3-2،4 لغسل خلايا الدم مرة أخرى. ثم نضح supernatالنمل واستبدالها مع PBS في درجة الحموضة 7.4. قلب لخلط.
6. تقسيم بالتساوي الدم إلى أربعة أنابيب، المقابلة لكل درجة الحموضة التي سيتم اختبارها. تسمية أنابيب وفقا لدرجة الحموضة كل لفحصها (5.6، 6.2، 6.8، 7.4).
7. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الدم في 500 x ج لمدة 5 دقائق. بمناسبة مستويات على أنابيب، ثم طاف نضح.
8. ملء كل أنبوب إلى خط ملحوظ مع العازلة الرقم الهيدروجيني المناسب (كما هو موضح في 2.6).
9. التسمية 4 مل المخروطية أنابيب 50 (واحد لكل درجة الحموضة للاختبار)، والماصة 49 مل من برنامج تلفزيوني من درجة الحموضة المناسبة في كل أنبوب مخروطي الشكل.
10. إضافة 1 مل من الكريات الحمراء (درجة الحموضة نفسه) في أنبوب المقابلة لتخفيف 1:50. تفقد البصر الدم الواحد، التي ينبغي أن عكرا وسوف يستقر إذا ما تركت دون عائق. إذا لم أشكال بيليه، وهي lysed الخلايا.

3. تحلل الفحص 96 لوحة الإعداد حسنا والكمي

1. إعداد تقييم حلول جميع وكلاء المخدرات التسليم التجريبية، في 20X تركيز النهائي المطلوب لفحصها (الفحصوسوف يستغرق 10 ميكرولتر من عامل توصيل الدواء + 190 ميكرولتر المخفف خلايا الدم الحمراء، مما يؤدي إلى التخفيف 1/20 من وكيل تسليم المخدرات إلى الخليط الأصلي الاختبار النهائي). واقترح الأسهم من 20، 100، و 800 ميكروغرام / مل، مما أدى إلى تركيزات الاختبار النهائي من 5، 1، و 40 ميكروغرام / لتر، على التوالي.
2. الماصة 10 ميكرولتر من محلول المخزون في كل V-96-أسفل وحات جيدة. لأفضل النتائج، تحميل كل عينة في ثلاث نسخ أو quadruplicate.

ملاحظة: للحصول على سهولة، فمن المستحسن أن تعد منفصلة 96-وحة جيدا لكل درجة الحموضة لفحصها، مع كل عينة (في كل التركيز) في تحميل العدد = 3-4 في لوحة.

3. لآبار مراقبة إيجابية، إضافة 10 ميكرولتر من 20٪ تريتون X-100.
4. لآبار المراقبة السلبية، إضافة 10 ميكرولتر من العازلة الفوسفات. استخدام المخزن المؤقت في نفس درجة الحموضة لفحصها.
5. الماصة 190 ميكرولتر من الكريات الحمراء المخفف (انظر 2.10) إلى كل بئر، والتأكد من محلول المخزون الخلية لا يزالمتجانسة أثناء النقل. تلميح: استخدام متعدد القنوات ماصة لتبسيط هذه المهمة.
6. احتضان لوحات في C ° 37 لمدة ساعة (اختياري: استخدام شاكر المداري أو الروك).
7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق لوحات في 500 XG إلى الكريات الحمراء بيليه سليمة. ملاحظة: عند إزالة لوحة من أجهزة الطرد المركزي ونقله إلى الخطوة التالية، والتعامل مع بعناية وتكون على يقين من عدم تعطيل بيليه الخلية.
8. باستخدام الماصة متعددة، نقل 100 ميكرولتر من طاف من كل بئر في واضحة، لوحة 96-مسطحة القاع جيدا. ملاحظة: إذا تشعر بالانزعاج بطريق الخطأ بيليه الخلية لأي عينة (ق)، ويمكن للمرء أن إعادة أجهزة الطرد المركزي لوحة ومن ثم المضي قدما في نقل طاف.
9. قياس الامتصاصية من supernatants مع قارئ لوحة. لاحظ أنه يمكن استخدام مجموعة واسعة من الأطوال الموجية (400-541 نانومتر).

ملاحظة: لوحة مختلفة القراء قد يكون نقطة التشبع والحساسيات المختلفة، وبالتالي فإن اختيار الطول الموجي بالنسبة ليasurements يعتمد على ما إذا كان أو لا يمكن انحلال الدم البيانات من نماذج تجريبية تطبيع موثوق ضد انحلال الدم الناجم عن الحد الأقصى والعلاج المنظفات. هذا يتطلب القياس الدقيق للقيم الامتصاصية للعينات مراقبة إيجابية.

10. باستخدام Microsoft Excel أو تحليل البيانات برامج مماثلة، والعثور على متوسط ​​قراءات الامتصاصية الخلفية من عينات المراقبة السلبية التي أنشئت من أجل كل درجة الحموضة (الخطوة 3.4). طرح هذه القيمة الامتصاصية الخلفية من جميع العينات الأخرى التي تم قياس درجة الحموضة في ذلك.
11. بعد الطرح الخلفية، والعثور على امتصاص متوسط ​​مراقبة إيجابية المنظفات المعالجة عينات (الخطوة 3.3). ثم تطبيع جميع نقاط البيانات التجريبية لهذه القيمة يعني الامتصاصية، التي ينبغي أن تمثل 100٪ انحلال الدم. وأخيرا، وتتضاعف كل قيمة جيدة بنسبة 100٪ لحساب انحلال الدم٪ التي وقعت في كل فرد النسبي بشكل جيد للتحكم المنظفات.

النتائج

عادة، والعوامل التي يحمل الرقم الهيدروجيني المثالي التي تعتمد على السلوك الانحلالي لديها أعلى احتمال تسليم عصاري خلوي من المخدرات، والأحماض النووية، أو الجزيئات الحيوية النشطة الأخرى. ويتمثل ذلك من خلال وكيل # 1 كما صورت في الشكل 2، والذي يسلك انحلال الد...

Discussion

يمكن الرقم الهيدروجيني التي تستجيب للبوليمرات أو غيرها من العوامل صممت لتكون وظيفة endosomolytic بسرعة وفعالية فحص يعتمد على تحلل كريات الدم الحمراء عند قيم الرقم الهيدروجيني ووجهت في دخلول؛ جسيم داخلي (الشكل 1؛ درجة الحموضة 6.8 - دخلول؛ جسيم داخلي في وقت مبكر، ودر?...

Materials

اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer أنابيب	فيشر العلمية	22-253-145	لجمع الدم
BD إبر جمع الدم Vacutainer و 20.5 عيار	فيشر العلمية	02-665-31	لجمع الدم
BD Vacutainer أنبوب حامل / إبرة محول	فيشر العلمية	22-289-953	لجمع الدم
BD العلامة التجارية مسحات الكحول الآيزوبروبيل	فيشر العلمية	13-680-63	لجمع الدم
BD Vacutainer اللاتكس خالية العاصبة	فيشر العلمية	02-657-6	لجمع الدم
حمض الهيدروكلوريك (conc.)	فيشر العلمية	A144-500	لتعديل درجة الحموضة من D-PBS.
تريتون X-100	سيغما الدريخ	T8787	السيطرة الإيجابية
Dulbecco في PBS	إينفيتروجن	14190
Nalgene MF75 المعقمة المتاح زجاجة الأعلى وحدة تصفية مع غشاء SFCA	فيشر العلمية	09-740-44A
96-BD جيدا لوحات، والبوليسترين مسطحة، زراعة الأنسجة المعالجة	فيشر العلمية	08-772-2C	لقراءة لوحة في نهاية الفحص.
96-BD جيدا لوحات، والبوليسترين ذهابا والقاع، زراعة الأنسجة المعالجة	فيشر العلمية	08-772-17	لحضانة خلايا الدم الحمراء مع وكلاء التجريبية.