生体高分子薬の細胞質ゾルデリバリーのためのpH応答性エンドソーム溶解剤の評価のためにex vivoで赤血球溶血アッセイ

要約

溶血アッセイは、細胞内の貨物の配達のための薬物送達システム "cytocompatibilityとエンドソーム溶解活性の急速な、高スループットの画面として使用することができます。アッセイは、環境pHの関数としての赤血球膜の破壊を測定します。

要約

エンド-リソソーム小胞を構成するリン脂質二重層は細胞内標的に対する生物学的薬剤の送達に障壁をもたらすことができます。この障壁を克服するために、合成麻薬キャリアの数を積極的にエンドソーム膜を破壊し、細胞質内に貨物を提供するように設計されています。ここでは、細胞内薬物送達システムのcytocompatibilityとエンドソーム溶解活性のために迅速、ハイスループットスクリーニングとして使用することができ溶血アッセイを、説明します。

溶血アッセイ、ヒト赤血球および試験材料では、細胞外の早期エンドソーム、後期のendo-リソソーム環境を模倣する定義されたpHの緩衝液中で同時インキュベートされています。ペレット無傷赤血球に遠心分離工程に続いて、培地中に放出されたヘモグロビンの量を分光光度法（最高のダイナミックレンジの405 nm）で測定されます。パーセント赤血球の破壊は、その後陽性対照SAMPに対する相対定量化されLESは、洗剤を用いて溶解。このモデル系では赤血球膜には、エンド - リソソーム小胞を囲む脂質二重膜の代用として機能します。所望の結果は、生理学的pH（7.4）とpH約5から6.8からのendo-リソソームのpH範囲で堅牢な溶血で無視できる溶血です。

概要

細胞内の多くの潜在的な影響力の大きい治療標的がありますが、薬剤の細胞内送達は、重要な課題となっています。頻繁に、薬剤、特に生物学的製剤は、エキソサイトーシスを介して細胞によって内在化および小胞に人身売買どちらのendo-リソソーム経路を介して、それらの内容の劣化につながること、またはセルの裏に運ばれますされています。後者の過程で^1、内部のpHが小胞の酵素の活性の至適pHである、約5から6に酸性化されているリゾチームなど、この区画内の関数は、図²

最近では、材料の数は、特にの酸性化は、その貨物の細胞質送達を容易にするエンドソームを活用するように操作されている。このアプローチの一つの例では、コア生理学的pH（ すなわち 7.4）で両性イオンと電荷的に中性である合成、高分子ミセルのナノ粒子を使用しています。しかし、pH6.0で- 6.5、ポリマーがプロトン化になるとミセルのコアを不安定正味の正電荷を取得し、露出したポリマーセグメントと相互作用し、エンドソーム膜を破壊する。この活動は、彼らの細胞質ゾルのターゲットにアクセスできるように、ペプチドおよび核酸ベースの治療薬のエンドソーム脱出を促進することが示されている。膜障壁を崩壊エンドソーム脱出を媒介するために開発された方法の^3,4他の例は、または'融合'ペプチドが含まれるリン脂質二重層の膜融合や過渡孔形成を媒介することができるタンパク質は、例えば、ポリ（プロピルアクリル酸）のようなアニオン性アルキルアクリル酸の⁵ホモは別のよく研究されたアプローチであり、これらのポリマーに、ペンダントカルボン酸のプロトン化状態が遷移を指示エンド-リソソームのpH範囲において、疎水性膜の中断状態になります^。6,7

エンドソーム溶解挙動をスクリーニングするための一つの有用なモデル系はeですX生体内pH依存性溶血アッセイ。このモデルシステムでは^8、赤血球膜は、エンド-リソソーム小胞を囲む脂質二重膜の代用として機能します。この一般化モデルは細胞透過性ペプチドおよび他の高分子遺伝子送達システムのエンドソーム溶解挙動を評価するために他の人によって使用されています^8月11日今回の実験では、ヒト赤血球および試験材料は模倣する定義されたpHで緩衝液中で同時インキュベートアール、（7.4）は、細胞外（6.8）初期エンドソーム、およびエンドリソソーム後期（<6.8）環境に対応しています。潜伏期間中に放出されたヘモグロビンの量は、洗剤を用いて溶解し、陽性対照試料で放出されたヘモグロビンの量に正規化されている赤血球の溶解、の尺度として定量化される。

潜在的にエンドソーム溶解試験材料の小さなライブラリーをスクリーニングすることから、1つは、pH7.4で全く溶血を生じないが、有意に上昇し、その裾のサンプルを推測することができますpHでolysis <6.5は、細胞質ゾルの薬物送達のための最も効果的かつcytocompatible候補となります。これらの基準に適合する材料は、不活性のままで無差別にエンド-リソソーム区画に内在化後の局所pHの低下にさらされるまで、脂質二重膜（細胞毒性を引き起こす可能性がIE）を破壊しないことが予想される。

このプロトコルでは、赤血球はヒトのドナーから単離されており、実験的なエンドソーム溶解薬物送達剤を用いてpHを5.6、6.2、6.8、または7.4で共存培養した。無傷赤血球をペレット化し、上清を（溶解赤血球から放出されたヘモグロビンを含む）プレートリーダー（ 図1）を経由してヘモグロビンの吸光特性を分析する。

プロトコル

1。バッファおよびテストエージェントの調製と滅菌

1. 150mMのNaCl緩衝液：ナノ純水500ml中に4.383グラムNaCl結晶を溶かす。
2. pH緩衝液：一塩基と二塩基性リン酸ナトリウムの適切な量を混合することにより、pHが5.6、6.2、6.8、および7.4のリン酸緩衝液を準備します。サンプルは低いpH値（ すなわち pHが<5.6）などのクエン酸緩衝液として、より適切な緩衝液、でテストする場合は、使用すべきである。バッファのレシピは、容易に入手可能であり、例えば参照がここで提供されています¹²
3. ボトルトップ吸引ろ過装置と再確認バッファーのpHを介して上記のようにすべてのバッファーを滅菌する。
4. 20パーセントのTriton X-100（陽性対照）：ミックス20ミリリットル純粋トリトンX-100ナノ純水80mlインチ激しくボルテックスし、溶解するために超音波処理する。使用前に室温で一晩にしておきます。

2。赤血球の調製

1. 血液frの25ミリリットルを得る凝固を防ぐために、K _2-EDTA-コーティングさバキュテイナー管に直接描かれたOMは、匿名の人間のドナー、。

注：すべての手順は、適切な治験審査委員会（IRB）による事前承認を受けなければならず、静脈穿刺および採血がドナーへのリスクを最小限にするために訓練された瀉血専門医が行う必要があります。標準的な瀉血の手続きは、他の場所で公開されている¹³

2. 5分間、チューブ上のヘマトクリット値（赤、下層）と血漿（黄色がかった、上層）のマーク·レベルについては、500×gで血液を遠心分離します。
3. マイクロピペッターを介して緩やかにプラズマを吸引除去し、漂白剤に追加して、バイオハザード廃棄物に捨ててください。
4. 150mMのNaCl溶液でマークされた行（プラズマの元のレベル）にヘマトクリット管を埋める。キャップ、穏やかに混合するために数回転倒。 5分間、500×gで遠心分離します。
5. 再び血液細胞を洗浄するステップ2.3から2.4を繰り返します。その後supernatを吸引アリとpH7.4のPBSで置き換える。混在させる反転。
6. テストされる各pHに対応する4つのチューブ内に均等に血を分割します。 （5.6、6.2、6.8、7.4）でテストする各pHに応じてチューブにラベルする。
7. 5分間、500×gで採血管を遠心する。チューブ上のレベルにマークを付け、その後、上清を吸引除去する。
8. 適切なpH（2.6に示されるように）のバッファでマークされた行に各管を埋める。
9. ラベル4 50 mlコニカルチューブ（試験へのpH当たり1）、および各コニカルチューブに適切なpHのPBSのピペット49ミリリットル。
10. 1:50希釈のための対応するチューブに赤血球の1ミリリットル（同じpH）を追加します。視覚的に混濁されるべきであり、邪魔されずに放置しておくと落ち着きます希釈血液を検査。ペレットの形していない場合は、細胞を溶解した。

3。溶解アッセイ96ウェルプレートのセットアップと定量

1. テストする20X所望の最終濃度で、すべての実験薬物送達剤のストック溶液を準備します（アッセイ薬物送達剤+ 190μlの希釈赤血球、最終テスト混合物の中に、元の薬物送達剤の1/20希釈につながる）の10μlがかかります。 20、100、800μg/ mlの株式がそれぞれ1,5、および40μg/ mlのの最終試験濃度で、その結果、提案されている。
2. V底96ウェルプレートに各ストック溶液の10μlのピペット。最適な結果を得るために、三重または四重に各サンプルをロードします。

注：簡単にするために、それは独立した96ウェルプレートは、n = 3-4あたりのプレートにロードされた各サンプル（各濃度における）で、テストする各pHのために準備することをお勧めします。

3. 正の対照ウェルは、10μlの20％Triton X-100を追加します。
4. 陰性対照ウェルは、リン酸緩衝液10μlを加える。テストする同じpHでバッファを使用します。
5. 希釈された赤血球のピペットで190μL（2.10参照）を各ウェルに、残っていることを確認細胞原液を作る転送中に均質。ヒント：このタスクを簡素化するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
6. 1時間（：オービタルシェーカーやロッカーを使用して、オプション）を37℃でプレートをインキュベートする。
7. 500はペレット無傷赤血球にxgで5分間プレートを遠心します。注：遠心分離機からプレートを外して、次のステップにそれを輸送する際、取り扱いに注意し、細胞ペレットを妨害しないように注意する。
8. マルチチャンネルピペットを使用し、クリア、平底96ウェルプレートに各ウェルから100μlの上清を移す。注：細胞ペレットを誤って任意のサンプル（s）の妨害された場合は、1つは、再遠心することができますプレート後、上澄みの転送を続行します。
9. プレートリーダーを用いて上清の吸光度を測定します。波長の範囲は（ - 541 nmの400）を使用することができることに注意してください。

注：異なるプレートリーダーが異なる飽和点と感度を持っている可能性がありますので、私のために波長の選択asurementsは、界面活性剤処理により誘導されるような実験サンプルから溶血データが確実に最大溶血に対して正規化することができるかどうかによって異なります。これは、ポジティブコントロールサンプルの吸光度の値を正確に測定する必要があります。

10. Microsoft Excelまたは類似のデータ解析ソフトウェアを使用して、各pH（ステップ3.4）用に設定され陰性対照試料からのバックグラウンド吸光度の測定値の平均を求める。そのpHで測定した他のすべての試料から、このバックグラウンドの吸光度の値を減算します。
11. バックグラウンドを差し引いた後、陽性コントロールの平均吸光度洗剤で処理したサンプル（ステップ3.3）を見つける。次いで100％溶血を表すべきであるこの平均吸光度値にすべての実験データ点を正規化します。最後に、洗剤コントロールに対する相対的なだけでなく、個々に発生した％溶血を計算するために100％で各ウェルの値を乗算します。

結果

典型的には、理想的なpH依存性溶血性挙動を示す薬剤は、薬物、核酸、または他の生物活性分子の細胞質送達のための最高の可能性を秘めている。これは、pH7.4で最小限の溶血を示し、 図2に描かエージェントとして第1に代表されるが、エンドソームのpH範囲（<6.5）における溶血性行動が急激に増加しています。これらの薬剤は血液適合性ではない可能性があり、潜在的に?...

ディスカッション

-初期エンドソームのpH 6.2 -後期エンドソームのpH 5.6 - pHは6.8、エンドソーム溶解機能のために設計されたpH応答性ポリマーまたは他の薬剤を迅速かつ効果的にエンドソーム（ 図1に遭遇したpH値で赤血球の溶解に基づいてスクリーニングすることができるリソソーム^{）14から17、pH}依存性溶血は、生体高分子の治療法（ 例えば、ペプチドは、siRNA、ODNは、タンパク質）...

資料

試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
BDバキュテイナー - K2EDTAバキュテイナー管	フィッシャー·サイエンティフィック	22-253-145	採血用
BDバキュテイナ採血針、20.5ゲージ	フィッシャー·サイエンティフィック	02-665-31	採血用
BDバキュテイナチューブホルダー/ニードルアダプタ	フィッシャー·サイエンティフィック	22-289-953	採血用
BDのブランドイソプロピルアルコール綿棒	フィッシャー·サイエンティフィック	13-680-63	採血用
BDバキュテイナーラテックスフリー止血帯	フィッシャー·サイエンティフィック	02-657-6	採血用
塩酸（濃）	フィッシャー·サイエンティフィック	A144-500	D-PBSのpHを調整するための。
トリトンX-100	シグマアルドリッチ	T8787	陽性対照
ダルベッコPBS	インビトロジェン	14190
ナルゲンSFCAメンブレンMF75滅菌使い捨てボトルトップフィルターユニット	フィッシャー·サイエンティフィック	09から740-44A
BDの96ウェルプレート平底、組織培養処理されたポリスチレン	フィッシャー·サイエンティフィック	08から772-2C	アッセイの終了時に、板読書のため。
BDの96ウェルプレート、丸底組織培養処理されたポリスチレン	フィッシャー·サイエンティフィック	08-772-17	実験的な薬剤と赤血球のインキュベーション。