Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular

Resumo

Um ensaio de hemólise podem ser usados ​​como um meio rápido, tela de alto rendimento de cytocompatibility sistemas de entrega de drogas e atividade endosomolytic para entrega intracelular de carga. O ensaio mede a ruptura das membranas dos eritrócitos em função do pH do meio ambiente.

Resumo

Bicamadas de fosfolipídios que formam endo-lisossômico vesículas podem representar uma barreira para a entrega de medicamentos biológicos para alvos intracelulares. Para ultrapassar esta barreira, uma série de transportadores de drogas sintéticas têm sido desenvolvidos para a perturbação activa da membrana endossomal e entregar a carga para dentro do citoplasma. Aqui, nós descrevemos o ensaio de hemólise, a qual pode ser usada como uma rápida, tela de alto rendimento para a actividade e cytocompatibility endosomolytic de sistemas de entrega de drogas intracelulares.

No ensaio de hemólise, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pHs definidos que imitam extracelulares, cedo endossomais e lisossomais tarde endo-ambientes. Após um passo de centrifugação a pelota intactas as células vermelhas do sangue, a quantidade de hemoglobina libertada para o meio é medida por espectrofotometria (405 nm para melhor a gama dinâmica). A interrupção por cento de glóbulos vermelhos é então quantificada em relação ao controle positivo samples lisadas com detergente. Neste sistema modelo da membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. O resultado desejado é a hemólise insignificante a um pH fisiológico (7,4) e hemólise robusto na gama de pH a partir de endo-lisossomal aproximadamente pH 5-6,8.

Introdução

Embora existam muitos potenciais de alto impacto alvos terapêuticos no interior da célula, a entrega intracelular de agentes representa um desafio significativo. Frequentemente, as drogas, especialmente produtos biológicos, são internalizados pelas células e de tráfico dentro de vesículas que, ou levar a uma degradação do seu conteúdo através da via endo-lisossomal, ou são transportados de volta para fora da célula através de exocitose. ¹ No último processo, o pH interno das vesículas é acidificada para cerca de 5-6, que é o pH óptimo para a actividade das enzimas que funcionam neste compartimento, tal como a lisozima ^2.

Recentemente, um certo número de materiais foram especificamente concebidos para aproveitar a acidificação dos endossomas para facilitar a entrega citosólica da sua carga. Um exemplo desta abordagem utiliza sintéticos, as nanopartículas de polímeros de micelas cujo núcleo é zwitteriónicos e carga neutra a um pH fisiológico (isto é, 7.4). No entanto, a pH 6,0- 6,5, os polímeros tornam-se protonado e adquirem uma carga positiva, que desestabiliza o núcleo micelar, e os segmentos de polímeros expostos interagir com e romper a membrana endossomal. Esta actividade tem sido mostrado para promover a fuga endossomal de péptidos e ácidos nucleicos baseados em terapêutica, o que lhes permite aceder aos seus alvos citosólicas. ^3,4 Outros exemplos de métodos desenvolvidos para mediar fuga endossomal que interromper a barreira da membrana incluem as "" péptidos fusogénicos ou proteínas que podem mediar a fusão da membrana, ou a formação de poros transientes na bicamada fosfolipídica. ⁵ homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo, tais como poli (ácido propylacrylic) são outra abordagem bem estudada e, nestes polímeros, o estado de protonação do ácido carboxílico pendente dita transição em um hidrofóbico, estado da membrana disruptiva em gamas de endo-lisossomais pH ^6,7.

Um sistema modelo útil para a triagem comportamento endosomolytic é o e-x dependente do pH in vivo ensaio de hemólise. ^{8 Neste} sistema modelo, a membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. Este modelo generalizável tem sido utilizado por outros para avaliar o comportamento de células endosomolytic penetrantes péptidos e outros sistemas de entrega de genes poliméricos. ^8-11 Nesta experiência, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pH definidos que imitam extracelulares (7,4), no início endossomais (6,8), e no final endo-lisossomal (<6,8) ambientes. A quantidade de hemoglobina libertada durante o período de incubação é quantificada como uma medida da lise dos glóbulos vermelhos, que é normalizado para a quantidade de hemoglobina libertada nas amostras de controlo positivo lisadas com detergente.

De rastreio de uma pequena biblioteca de materiais de teste potencialmente endosomolytic, pode-se inferir que as amostras que não produzem hemólise, a pH 7,4, mas bainha significativamente elevadosolysis a pH <6,5, serão os candidatos mais eficazes e cytocompatible para a entrega da droga citosólica. Os materiais que se enquadram nestes critérios seria de esperar que permanecem inertes e não indiscriminadamente destruir bicamadas lipídicas (isto é, que poderia causar a citotoxicidade) até serem expostos a uma queda no pH local na sequência de internalização em endo-lisossomais compartimentos.

Neste protocolo, os eritrócitos são isoladas a partir de um dador humano e co-incubou-se a pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 com experimentais agentes de entrega de droga endosomolytic. Eritrócitos intactos são sedimentadas e os sobrenadantes (que contêm hemoglobina libertada a partir de eritrócitos lisados) são analisadas para a característica de absorção de hemoglobina através de um leitor de placa (Figura 1).

Protocolo

1. Preparação e Esterilização de Buffers e agentes de teste

1. 150 mM de NaCl: Dissolver 4,383 g de cristais de NaCl em 500 ml de água nanopura.
2. Os tampões de pH: Preparar tampão fosfato a pH 5,6, 6,2, 6,8, e 7,4 por mistura de quantidades apropriadas de fosfato monobásico e fosfato de sódio dibásico. Se as amostras são testadas a valores de pH mais baixos (isto é, pH <5,6), em seguida, um tampão mais apropriado, tal como tampão de citrato, deve ser usado. Receitas tampão estão facilmente disponíveis, e um exemplo de referência tenha sido fornecido aqui ^12.
3. Esterilizar todos os buffers acima indicadas através de um aparelho de filtração garrafa-top vácuo e re-check tampão pH.
4. 20% de Triton X-100 (testemunha positiva): Misturar 20 ml puro Triton X-100 em 80 ml de água nanopura. Vortex vigorosamente e sonicar a dissolver-se. Deixar a temperatura ambiente durante a noite antes da utilização.

2. Preparação de eritrócitos

1. Obter 25 ml de sangue from um anônimo doador humano, elaborado diretamente em tubos de K _2-EDTA revestidos Vacutainer para impedir a coagulação.

NOTA: Todos os procedimentos devem ser pré-aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional apropriado (IRB), e punção venosa e coleta de sangue deve ser realizada por um flebotomista treinado, a fim de minimizar o risco para o doador. Os procedimentos padrão de flebotomia ter sido publicado anteriormente ^13.

2. Centrifugar o sangue a 500 xg durante 5 min, e os níveis de hematócrito marca (vermelho, a camada inferior) e de plasma (camada superior amarelada) no tubo.
3. Aspirar plasma suavemente através de uma micropipeta, adicionar em água sanitária, e descartar em resíduos com risco biológico.
4. Encher o tubo hematócrito a linha marcada (nível original de plasma) com 150 mM de solução de NaCl. Cap e inverter algumas vezes para misturar suavemente. Centrifugar a 500 xg durante 5 min.
5. Repita o passo 2,3-2,4 para lavar as células do sangue novamente. Em seguida, aspire supernatformiga e substituir com PBS a pH 7,4. Inverter para misturar.
6. Dividir sangue uniformemente em quatro tubos, correspondendo a cada pH que será testado. Rotular os tubos de acordo com cada valor de pH a ser testado (5.6, 6.2, 6.8, 7.4).
7. Centrifugar os tubos de sangue a 500 xg durante 5 min. Marcar níveis em tubos, em seguida, aspirar o sobrenadante.
8. Encher cada tubo de linha marcada com tampão de pH apropriado (como indicado em 2.6).
9. Etiqueta quatro tubos de 50 ml (um por pH de teste), e pipeta de 49 ml de PBS de pH apropriado para cada tubo cónico.
10. Adicionar 1 ml de eritrócitos (mesmo pH) para dentro do tubo correspondente para uma diluição de 1:50. Inspecionar visualmente o sangue diluído, que deve ser turva e vai resolver, se deixado em repouso. Se nenhuma forma de pelotas, as células têm lisadas.

3. Lise Ensaio 96 Configuração da Bem e Quantificação

1. Preparar soluções de reserva de todos os agentes de entrega de droga experimental, a 20x a concentração final desejada para ser testado (Ensaioterá 10 ul de agente de entrega de droga + 190 ul diluídas células vermelhas do sangue, conduzindo a uma diluição de 1/20 do original de agente de libertação de fármacos para a mistura de ensaio final). Os estoques de 20, 100, e 800 ug / ml são sugeridas, resultando em concentrações de ensaio finais de 1, 5, e 40 ug / ml, respectivamente.
2. Pipetar 10 ul de cada solução de estoque em Fundo em V de 96 poços. Para melhores resultados, coloque cada amostra em triplicado ou quadruplicado.

NOTA: Para facilidade, recomenda-se que uma placa de 96 poços separada deve ser preparada para cada pH a ser testado, com cada uma das amostras (a cada concentração) carregado com n = 3-4 por prato.

3. Para poços de controlo positivo, adicionar 10 ul de Triton X-20% 100.
4. Para poços de controlo negativo, adicionam-se 10 ul de tampão de fosfato. Utilize uma solução tampão ao mesmo pH a ser testado.
5. Pipete 190 pi de eritrócitos diluídas (ver 2.10) a cada poço, tornando solução stock certeza célula permanecehomogénea durante a transferência. Dica: Use uma pipeta multi-canal para simplificar essa tarefa.
6. Incubar as placas a 37 ° C durante uma hora (Opcional: Utilizar um agitador orbital ou oscilante).
7. Centrifugar as placas durante 5 minutos a 500 xg para eritrócitos intactos pelota. Nota: durante a remoção da placa da centrífuga e transportá-lo para o passo seguinte, manusear com cuidado e ter a certeza de não perturbar o sedimento celular.
8. Utilizando uma pipeta multicanal, transferir 100 ul do sobrenadante de cada poço para uma clara, de fundo chato de placas de 96 poços. Observação: se o sedimento de células foi acidentalmente perturbado por qualquer amostra (s), pode-se re-centrifugar a placa e, em seguida, proceder à transferência de sobrenadante.
9. Medir a absorvância do sobrenadante com um leitor de placas. Note-se que uma gama de comprimentos de onda podem ser utilizados (400 - 541 nm).

NOTA: leitores de placas diferentes podem ter pontos de saturação e sensibilidades diferentes, para a escolha de um comprimento de onda para measurements depende ou não de dados de hemólise de amostras experimentais podem ser confiavelmente normalizado contra hemólise máximo induzido por tratamento com detergente. Isto requer uma medição precisa dos valores de absorvância das amostras de controlo positivo.

10. Usando o Microsoft Excel ou um software de análise de dados semelhante, encontre a média das leituras de absorvência de fundo a partir das amostras de controlo negativo criados para cada pH (passo 3.4). Subtrair o valor de absorvância de fundo a partir de todas as outras amostras que foram medidas naquele pH.
11. Após subtracção do fundo, encontrar a absorvência média do controlo positivo detergente tratados com amostras (passo 3.3.) Então normalizar todos os pontos de dados experimentais, para este valor de absorvância média, a qual deve representar 100% de hemólise. Finalmente, multiplicar cada valor bem por 100% para calcular% de hemólise, que ocorreu em cada poço individual em relação ao controlo de detergente.

Resultados

Tipicamente, os agentes que exibem um comportamento dependente do pH ideal hemolítica têm o maior potencial para a entrega de drogas citosólica, ácidos nucleicos ou outras moléculas bioactivas. Isto é exemplificado pelo agente # 1, como mostrado na Figura 2, o qual exibe a hemólise mínima a um pH de 7,4, mas um aumento significativo no comportamento hemolítica em gamas de pH endossomais (<6,5). Alguns agentes podem exibir níveis significativos de comportamento hemolítica em gamas de ...

Discussão

pH-responsivos polímeros ou outros agentes destinados a função endosomolytic pode ser rápida e eficazmente rastreados com base na lise de células vermelhas do sangue em valores de pH encontrados no endossoma (Figura 1, pH 6,8 - endossomo precoce, a pH 6,2 - endossoma tardio, pH 5,6 - lisossoma). ^14-17 hemólise dependente do pH foi usado para analisar a capacidade de mediar a libertação transportadoras endossomal da terapêutica biomacromolecular péptidos (por exemplo, siRNA,...

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubos	Fisher Scientific	22-253-145	Para coleta de sangue
BD Vacutainer sangue agulhas para coleta, 20,5 calibre-	Fisher Scientific	02-665-31	Para coleta de sangue
BD Vacutainer Tubo Adaptador Titular / Agulha	Fisher Scientific	22-289-953	Para coleta de sangue
BD Marca álcool isopropílico Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	Para coleta de sangue
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Para coleta de sangue
Ácido clorídrico (cone.)	Fisher Scientific	A144-500	Para o ajuste do pH de D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Controle positivo
PBS Dulbecco	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 estéril Unidade de frascos de filtro descartável com SFCA Membrana	Fisher Scientific	09-740 44A-
BD placas de 96 poços, de fundo chato de poliestireno tecido, a cultura tratada com	Fisher Scientific	08-772 2C-	Por placa de leitura no final do ensaio.
BD placas de 96 poços, de fundo redondo de poliestireno de tecido, a cultura tratada com	Fisher Scientific	08-772-17	Por incubação de células vermelhas do sangue com agentes experimentais.