Biomacromolecular Uyuşturucu Sitozolik Teslimat için pH-duyarlı endosomolitik Ajanlar değerlendirilmesi için Ex Vivo Kırmızı Kan Hücresi Hemoliz Testi

Özet

Bir hemoliz tahlil hücre içi kargo için ilaç dağıtım sistemleri 'cytocompatibility ve endosomolitik aktivite hızlı, yüksek hacimli ekran olarak kullanılabilir. Tahlil çevresel pH bir fonksiyonu olarak eritrosit membran parçalama ölçer.

Özet

Endo-lizozomal veziküller oluşturan çift katmanlı fosfolipidlerin hücre içi hedeflere biyolojik ilaçların teslim için bir engel teşkil edebilir. Bu engeli aşmak için, sentetik ilaç taşıyıcı bir dizi aktif endozomal zarı bozar ve sitoplazma içine kargo sunmak için tasarlanmış edilmiştir. Burada, hücre içi ilaç dağıtım sistemleri cytocompatibility ve endosomolitik etkinlik için hızlı, yüksek hacimli ekran olarak kullanılabilir hemoliz tahlil, açıklar.

Hemoliz testi, insan kırmızı kan hücreleri ve test materyalleri ekstraselüler, erken endozomal ve geç endo-lizozomal ortamlarda taklit tanımlanan pH'da tampon co-inkübe edilir. Pelet bozulmamış kırmızı kan hücreleri santrifüj basamağı sonrasında, orta salınan hemoglobin miktarı, spektrofotometrik (en iyi dinamik aralığı için 405 nm) olarak ölçülür. Yüzde kırmızı kan hücre parçalama sonra pozitif kontrol samp göre ölçülürles bir deterjan ile lize. Bu model sistemde eritrosit membran endo-lizozomal veziküller içine iki tabakalı lipid membran için bir vekil olarak hizmet vermektedir. İstenen sonucu fizyolojik pH (7.4) ve yaklaşık pH 5-6,8 gelen endo-lizozom pH aralığında sağlam hemoliz de ihmal hemoliz olduğunu.

Giriş

Hücre içinde birçok potansiyel yüksek etkili tedavi hedefleri olmasına rağmen, maddelerin hücre içi teslimat önemli bir sorun teşkil etmektedir. Sık sık, ilaçlar, özellikle biyolojik, ekzositoz yoluyla hücreler tarafından içselleştirilmesi ve veziküller içine kaçırılan ya endo-lizozom yolağı yoluyla içindekiler bozulmaya yol açan veya hücrenin geri shuttled vardır vardır. Ikincisi süreçte ^1, iç pH veziküllerin enzim aktivitesi için optimum pH olan yaklaşık olarak 5-6 olana kadar asitleştirildi, bu gibi lisozim gibi bu bölme içinde işlev. ²

Son zamanlarda, malzemeleri bir dizi özel bir asitleştirme kendi kargo sitozolik teslim kolaylaştırmak için endozomlar kaldıraç için tasarlanmış edilmiştir. Bu yaklaşımın bir örneği olan temel fizyolojik pH (yani 7.4) zwitteriyonik ve şarj nötr sentetik polimer misel nanopartiküller kullanır. Bununla birlikte, pH 6.0 '- 6.5, polimerler protonlanır olmak ve misel çekirdek oynattığını net pozitif yük kazanma, ve maruz kalan polimer segmentleri ile etkileşim ve endozomal zarı bozar. Bu aktivite, onların sitosolik hedefleri erişim imkanı sağlayan, peptid ve nükleik asit-bazlı terapötiklerin endozomal kaçış teşvik etmek için gösterilmiştir. Membran bariyeri bozmak endozomal kaçış aracılık için geliştirilmiş yöntemlerin diğer örnekleri ya da ^3,4 'füzojenik' peptitler yer fosfolipid çift-katlı membran füzyonu veya geçici gözenek oluşumuna aracılık eden proteinlerdir. örneğin poli (propylacrylic asit) gibi anyonik alkil akrilik asit homopolimerleri ⁵ diğer bir iyi incelenmiş olan bir yaklaşım, ve bu polimerler de, kolye karboksilik asit protonasyon durum geçiş belirler Endo-Lizozomal pH aralıkları bir hidrofobik, membran-yıkıcı devlet. ^6,7

Endosomolitik davranışı tarama için yararlı bir model sistem ex in vivo pH bağımlı hemoliz testi. ⁸ Bu model sistem olarak, eritrosit membranı endo-lizozomal veziküller içine iki tabakalı lipid membran için bir vekil olarak hizmet vermektedir. Bu genellenebilir modeli hücre delici peptidler ve diğer polimerik gen aktarım sistemlerinin endosomolitik davranışlarını değerlendirmek için başkaları tarafından kullanılmaktadır. ^8-11 Bu deneyde, insan kırmızı kan hücreleri ve test materyalleri taklit tanımlanan pH'da tampon birlikte kuluçkaya vardır ekstraselüler (7.4), erken (6.8) endozomal ve endo-lizozomal geç (<6.8) ortamları. Kuluçka dönemi sırasında serbest hemoglobin miktar deterjan ile lize pozitif kontrol örneklerinde serbest hemoglobin miktar ile normalize edilir kırmızı kan hücrelerinin lizisi, bir ölçüsü olarak ölçülür.

Potansiyel endosomolitik malzemeleri test küçük bir kütüphane tarama itibaren, bir pH 7.4 hiç hemoliz üretmek örnekleri anlaması, ancak önemli ölçüde yükselmiş etek olabilirpH <6.5 olan olysis, sitozolik ilaç dağıtım için en etkili ve cytocompatible adayları olacak. Bu kriterlere uyan malzemeler gelişigüzel endo-lizozomal bölmeye içselleştirilmesi sonrasında yerel pH bir düşüş maruz kadar iki tabakalı lipid membranlar (sitotoksisite neden olabilir yani) yok eylemsiz değil kalması beklenir.

Bu protokolde, eritrositler bir insan donör izole edilir ve pH 5.6, 6.2, 6.8, ya da deneysel endosomolitik ilaç dağıtım ajanları ile 7.4 'de co-inkübe. Bozulmamış eritrositler peletlenmiş, ve süpernatan (erimiş eritrositler serbest hemoglobin ihtiva eden) bir plaka okuyucu (Şekil 1) vasıtasıyla hemoglobin karakteristik absorbans için analiz edilir.

Protokol

1. Tamponlar ve Test Aracıları Hazırlanması ve Sterilizasyonu

1. 150 mM NaCl tampon: nanopure 500 ml su içinde 4.383 g NaCl kristaller eritilir.
2. pH Tamponları: monobazik ve dibazik sodyum fosfat uygun miktarlarda karıştırılarak pH 5.6, 6.2, 6.8 ve 7.4 'de fosfat tamponlar hazırlayın. Örnekleri gibi sitrat tampon olarak daha sonra düşük pH değerleri (yani pH <5.6) daha uygun bir tampon, test edilecek ise, kullanılmalıdır. Tampon tarifleri kolayca kullanılabilir ve bir örnek burada referans verilmiştir. ¹²
3. Bir şişe üstü vakumlu filtrasyon aparatı ve yeniden kontrol tampon pH aracılığıyla yukarıda belirtilen tüm tamponları sterilize edin.
4. % 20 oranında Triton X-100 (pozitif kontrol): Karışım 20 ml saf Triton nanopure 80 ml su içinde X-100. Şiddetle Vortex ve çözülmekte sonikasyon. Kullanımdan önce gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.

2. Eritrositler hazırlanması

1. Kan fr 25 ml eldepıhtılaşmayı önlemek için K _2-EDTA kaplı Vacutainer tüpler içine doğrudan çizilmiş om anonim bir insan donör,.

NOT: Tüm işlemler uygun Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK), ve Damara ve kan toplama tarafından önceden onaylanmalıdır donör riskini en aza indirmek için eğitimli bir Phlebotomist tarafından yapılmalıdır. Standart flebotomi prosedürler yerde yayımlanmamış edilmiştir. ^13.

2. 5 dk, ve hematokrit düzeyleri işareti (kırmızı, alt tabaka) ve plazma (sarımsı, üst tabaka) tüp için 500 xg'de kan santrifüjleyin.
3. Bir mikropipet ile hafifçe plazma aspire, çamaşır suyu içine ekleyin ve biyolojik tehlikeli atık içine atın.
4. 150 mM NaCl çözeltisi ile işaretlenmiş hattı (plazma orijinal seviyesi) hematokrit tüpü doldurun. Cap ve hafifçe karıştırmak için birkaç kez ters. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin.
5. Tekrar kan hücreleri yıkayın adım 2,3-2,4 tekrarlayın. Sonra supernat aspirekarınca ve pH 7.4 'de PBS ile değiştirin. Karıştırmak için Invert.
6. Test edilecek her bir pH tekabül, eşit dört tüpler içine kan Böl. Test edilecek her bir pH (5.6, 6.2, 6.8, 7.4) 'ye göre tüp etiketleyin.
7. 5 dakika boyunca 500 xg'de kan tüpleri santrifüjleyin. Borular üzerinde seviyeleri işaretleyin, sonra süpernatant aspire.
8. Uygun pH (as 2.6 belirtilir) tamponu ile işaretlenmiş satırı her tüp doldurun.
9. Etiket dört 50 ml konik tüpler (test pH başına bir), ve her konik tüp içine uygun pH PBS pipet 49 ml.
10. Bir 1:50 seyreltme için gelen tüpe eritrositler (aynı pH) 1 ml ekleyin. Görme bulanık olmalıdır ve bozulmamış bırakılırsa razı olacak seyreltilmiş kan, kontrol edin. Hiçbir pelet formlarda, hücreler lize var.

3. Lizis Testi 96 Şey Levha Kurulumu ve Sayısallaştırma

1. Test edilecek 20x arzu edilen nihai konsantrasyonu, bütün deneysel ilaç aktarma maddelerinin stok çözelti hazırlayın (Assayilaç dağıtım ajan 10 ul + nihai test karışımının içine orijinal ilaç dağıtım aracı bir 1/20 dilüsyon giden 190 ul seyreltilmiş kırmızı kan hücreleri,) alacaktır. 20, 100, ve 800 ug / ml 'lik Stoklar, sırasıyla 1, 5, ve 40 ug / mL, nihai deney konsantrasyonu ile sonuçlanır önerilmektedir.
2. V-dibine her stok solüsyonu 96-kuyucuğu pipetleyin 10 ul. En iyi sonuçlar için, üç kopya halinde her bir numune yüklemek veya dört misli.

NOT: kolaylığı için, ayrı bir 96-plaka plaka başına n'deki = 3-4 yüklenen (her konsantrasyonda) Her numune ile test edilecek her pH için hazırlıklı olmak gerektiğini tavsiye edilir.

3. Pozitif kontrol kuyuları,% 20 Triton X-100, 10 ul ilave edin.
4. Negatif kontrol kuyuları fosfat tamponu 10 ul ilave edin. Test edilecek aynı pH tampon kullanın.
5. Seyreltilmiş Eritrositlerin Pipet 190 ul her oyuğa (2.10 'a bakın), kalır emin hücre stok solüsyonu yapmatransfer sırasında homojen. İpucu: Bu görevi kolaylaştırmak için kullanın çok kanallı pipet.
6. Bir saat (: orbital çalkalayıcı ya da rocker kullanın Opsiyonel) için 37 ° C'de plakaları inkübe edin.
7. 500 pelet sağlam eritrositlere xg de 5 dakika plakaları santrifüjleyin. Not: santrifüj plaka kaldırılarak ve bir sonraki adım için taşırken, dikkatli olun ve hücre pelletini bozmaya kesin olmayacak.
8. Bir çok kanallı pipet kullanarak, açık, düz tabanlı 96-plaka içine her kuyudan süpernatant 100 ul aktarın. Not: hücre pelletini yanlışlıkla herhangi bir numune (ler) için rahatsız ise, bir süpernatant transferi işlemlerine ardından plakayı tekrar santrifüj ve.
9. Bir plaka okuyucu ile yüzer maddelerinin absorbansı ölçülür. Bir dalga boyu aralığı (- 541 nm ilâ 400) kullanılabilir dikkat ediniz.

NOT: Farklı plaka okuyucu farklı doygunluk noktaları ve hassasiyetleri olabilir, bu yüzden benim için bir dalga boyu seçimiasurements deterjan tedavisinin yol açtığı gibi deneysel örneklerinden hemoliz veriler güvenilir maksimum hemoliz karşı normalize edilebilir olup olmadığına bağlıdır. Bu pozitif kontrol numunelerinin absorbans değerlerinin doğru bir ölçüm gerektirir.

10. Microsoft Excel veya benzer bir veri analiz yazılımı kullanarak, her bir pH (adım 3.4) için ayarlanmış negatif kontrol örnekleri arka absorbans ölçümleri ortalama bulabilirsiniz. Bu pH ölçüldü diğer tüm numuneler bu plan absorbans Değ.Çıkar.
11. Arka plan çıkarma sonra, pozitif kontrol ortalama absorbans deterjan işlenmiş örnekleri (adım 3.3) bulabilirsiniz. Sonra% 100 hemoliz temsil etmelidir ki, bu ortalama absorbans değeri tüm deneysel veri noktaları normalleştirmek. Nihayet, deterjan kontrolü iyi göreli her oluştu% hemoliz hesaplamak için% 100 her iyi değeriyle çarpın.

Sonuçlar

Genellikle, ideal bir pH bağımlı hemolitik davranışı gösteren ilaç ajanları, nükleik asitler ya da biyolojik olarak aktif diğer moleküllerin sitosolik teslimat için yüksek bir potansiyele sahiptir. Bu pH 7.4 'de minimal hemoliz sergiler Şekil 2'de de gösterildiği gibi, Ajan # 1 örneklediği, ama endozomal pH aralıkları (<6.5) de hemolitik davranış keskin bir artış olduğunu. Bu ajanlar hemocompatible olmayabilir ve potansiyel olarak bu konsantrasyonlarda sitotoks...

Tartışmalar

endosomolitik fonksiyon için tasarlanmış pH duyarlı polimerler ya da diğer maddeler gibi hızla ve etkili bir şekilde endosome karşılaşılan pH değerlerinde kırmızı kan hücrelerinin lizisi (Şekil 1 esas taranmış olabilir; pH 6.8 - erken endosome, pH 6.2 - geç endosome, pH 5,6 - Lizozom). ^14-17 pH bağımlı hemoliz biomacromolecular tedavi (örn. peptidler, siRNA, ODN'ler, proteinler) endozomal serbest arabuluculuk taşıyıcılar yeteneği taranması için kull...

Malzemeler

Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tüpler	Fisher Scientific	22-253-145	Kan toplama için
BD Vacutainer Kan Toplama İğneler, 20.5-ölçer	Fisher Scientific	02-665-31	Kan toplama için
BD Vacutainer Tüp Tutucu / İğne Adaptörü	Fisher Scientific	22-289-953	Kan toplama için
BD Marka İzopropil Alkol Swablar	Fisher Scientific	13-680-63	Kan toplama için
BD Vacutainer Lateks-Alerjik Turnike	Fisher Scientific	02-657-6	Kan toplama için
Hidroklorik asit (kons.)	Fisher Scientific	A144-500	D-PBS, pH ayarlaması için.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Pozitif kontrol
Dulbecco PBS	Invitrogen	14190
SFCA Membranlı Nalgene MF75 Steril Disposable Şişe Üstü Filtre Ünitesi	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-kuyucuğu, düz dipli, doku kültürü ile tedavi edilen polistiren	Fisher Scientific	08-772-2C	Testin sonunda, plaka okuma için.
BD 96-kuyucuğu, yuvarlak dipli, doku kültürü ile tedavi edilen polistiren	Fisher Scientific	08-772-17	Deneysel ajanlar ile kırmızı kan hücrelerinin kuluçka için.