Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular

Riepilogo

Un saggio di emolisi può essere usato come un rapido, ad alta resa di schermo citocompatibilità sistemi di rilascio di farmaci e l'attività endosomolytic per la consegna del carico intracellulare. Il saggio misura la rottura di membrane eritrocitarie in funzione del pH.

Abstract

Doppi strati di fosfolipidi che costituiscono endo-lisosomiale vescicole possono rappresentare un ostacolo alla consegna di farmaci biologici a bersagli intracellulari. Per superare questo ostacolo, una serie di trasportatori di farmaci sintetici sono stati progettati per interrompere attivamente la membrana endosomiale e consegnare cargo nel citoplasma. Qui, descriviamo il saggio emolisi, che può essere usato come un rapido, ad alta resa per la schermata citocompatibilità e attività endosomolytic dei sistemi intracellulari drug delivery.

Nel saggio emolisi, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che imitano extracellulari, endosomali precoce e tardiva endo-lisosomiali ambienti. A seguito di una fase di centrifugazione a pellet intatti cellule rosse del sangue, la quantità di emoglobina rilasciata nel terreno viene misurata spettrofotometricamente (405 nm per migliore dinamica). Il rosso per cento rottura delle cellule del sangue viene poi quantificato rispetto al controllo positivo samples lisate con un detergente. In questo sistema modello la membrana eritrocitaria funge da surrogato per la membrana lipidica a due strati che racchiudono endo-lisosomiale vescicole. Il risultato desiderato è emolisi trascurabile a pH fisiologico (7,4) ed emolisi robusta in endo-lisosomiale intervallo di pH da circa pH 5-6,8.

Introduzione

Sebbene vi siano molti potenziali obiettivi terapeutici impatto elevato all'interno della cellula, la consegna intracellulare di agenti rappresenta una sfida significativa. Spesso, i farmaci biologici, in particolare, vengono internalizzati dalle cellule e trafficata in vescicole che o portare al degrado del loro contenuto tramite l'endo-lisosomiale via, o vengono trasportati indietro fuori dalla cellula tramite esocitosi. ¹ In quest'ultimo processo, il pH interno delle vescicole viene acidificata a circa 5-6, che è il pH ottimale per l'attività di enzimi che funzionano in questo vano, ad esempio il lisozima. ²

Recentemente, un certo numero di materiali sono stati specificamente progettati per sfruttare l'acidificazione di endosomi per facilitare l'erogazione citosolico del loro carico. Un esempio di questo approccio utilizza nanoparticelle polimeriche sintetiche, micelle cui anima è zwitterionici e carica neutra a pH fisiologico (cioè 7,4). Tuttavia, a pH 6,0- 6,5, i polimeri diventano protonati e acquisire una carica positiva netta che destabilizza il nucleo micelle, e segmenti polimerici esposti interagire e distruggere la membrana endosomiale. Questa attività è stato dimostrato per promuovere la fuga endosomiale di peptidi e acido nucleico-terapie basate, consentendo loro di accedere ai bersagli citosolico. ^3,4 Altri esempi di metodi sviluppati per mediare fuga endosomiale che distruggere la barriera membrana includono 'fusogenico' peptidi o proteine ​​che possono mediare la fusione della membrana o transitoria formazione di pori nel doppio strato fosfolipidico. ⁵ omopolimeri di acidi acrilici anionici alchile come acido poli (propylacrylic) sono un altro approccio ben studiato, e in questi polimeri, lo stato di protonazione di acido carbossilico detta sospensione transizione in una idrofobica, membrana dirompente stato in endo-lisosomiale intervalli di pH. ^6,7

Un sistema modello utile per lo screening di comportamento endosomolytic è l'indirizzox pH-dipendente vivo dosaggio emolisi. ⁸ In questo sistema modello, la membrana eritrocitaria serve come un surrogato della membrana a doppio strato lipidico che racchiudono endo-vescicole lisosomiali. Questo modello generalizzabile è stato utilizzato da altri per valutare il comportamento endosomolytic di penetrazione cellulare peptidi e altri sistemi polimerici consegna del gene. ^8-11 In questo esperimento, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che mimano extracellulari (7.4), precoce endosomali (6.8), e la fine del endo-lisosomiale (<6.8) ambienti. La quantità di emoglobina rilasciata durante il periodo di incubazione è quantificato come misura di lisi dei globuli rossi, che viene normalizzato alla quantità di emoglobina rilasciata in campioni di controllo positivi lisate con un detergente.

Da screening di una piccola libreria di materiali di prova potenzialmente endosomolytic, si può dedurre che i campioni che non producono emolisi a pH 7.4, ma orlo significativamente elevatiolysis a pH <6.5, saranno i candidati più efficaci e cytocompatible per la consegna della droga citosolico. Materiali che soddisfano questi criteri dovrebbe rimanere inerte e non indiscriminatamente distruggere le membrane a doppio strato lipidico (cioè che potrebbe causare citotossicità) fino ad essere esposto ad una diminuzione del pH locale dopo interiorizzazione in endo-compartimenti lisosomiali.

In questo protocollo, eritrociti sono isolati da un donatore umano e co-incubate a pH 5,6, 6,2, 6,8, 7,4 o con agenti farmaci sperimentali endosomolytic consegna. Eritrociti intatti sono pellettizzati, ei surnatanti (contenenti emoglobina rilasciata da eritrociti lisati) vengono analizzati per l'assorbanza caratteristica di emoglobina mediante un lettore di piastre (Figura 1).

Protocollo

1. Preparazione e sterilizzazione di buffer e agenti di test

1. 150 mM NaCl tampone: sciogliere 4,383 g di cristalli di NaCl in 500 ml di acqua Nanopure.
2. Buffer pH: Preparare tamponi fosfato a pH 5.6, 6.2, 6.8, e 7.4 mescolando quantità appropriate di monobasico e sodio fosfato bibasico. Se i campioni devono essere sottoposti a valori di pH più bassi (pH <5.6) poi un buffer più appropriato, come il tampone citrato, dovrebbe essere usato. Ricette del buffer sono facilmente disponibili, e un esempio di riferimento è stato fornito qui ^12.
3. Sterilizzare tutti i buffer notato in precedenza attraverso una bottiglia-top gli aspiratori per filtrazione e ricontrollare tampone di pH.
4. 20% Triton X-100 (controllo positivo): Mescolare 20 ml puro Triton X-100 in 80 ml di acqua Nanopure. Vortex vigorosamente e ultrasuoni per sciogliere. Lasciare a temperatura ambiente per una notte prima dell'uso.

2. Preparazione di eritrociti

1. Ottenere 25 ml di sangue from un donatore anonimo umano, disegnato direttamente in K _2-EDTA rivestite vacutainer per prevenire la coagulazione.

NOTA: Tutte le procedure devono essere pre-approvato dal Consiglio appropriata revisione istituzionale (IRB) e prelievo venoso e raccolta del sangue deve essere eseguita da un flebotomo addestrato al fine di minimizzare il rischio per il donatore. Procedure standard di flebotomia sono stati pubblicati altrove ^13.

2. Centrifugare il sangue a 500 xg per 5 minuti, ed i livelli di ematocrito marchio (rosso, strato inferiore) e plasma (giallo, strato superiore) sul tubo.
3. Aspirare delicatamente plasma tramite una micropipetta, aggiungere in candeggina, e gettare in rifiuti a rischio biologico.
4. Riempire tubo di ematocrito alla linea marcata (livello iniziale del plasma) con 150 mM di soluzione di NaCl. Chiudere e capovolgere un paio di volte per mescolare delicatamente. Centrifugare a 500 xg per 5 min.
5. Ripetere il passaggio 2,3-2,4 per lavare le cellule del sangue di nuovo. Poi aspirare Supernatformica e sostituirlo con PBS a pH 7,4. Capovolgere per miscelare.
6. Dividere il sangue in modo uniforme in quattro tubi, corrispondente a ciascun pH che sarà testato. Etichettare i tubi secondo ognuna pH da testare (5,6, 6,2, 6,8, 7,4).
7. Centrifugare provette a 500 xg per 5 min. Segna i livelli su tubi, quindi aspirare il surnatante.
8. Riempire ogni provetta di linea contrassegnata con tampone di pH adeguato (come indicato in 2.6).
9. Etichettare quattro provette da 50 ml coniche (uno per pH a test), e pipettare 49 ml di PBS a pH appropriato in ciascuna provetta conica.
10. Aggiungere 1 ml di eritrociti (pH stesso) nel tubo corrispondente per una diluizione 1:50. Ispezionare visivamente il sangue diluito, che deve essere torbida e si sistemerà, se lasciati indisturbati. Se nessuna forma di pellet, le cellule sono lisate.

3. Lysis Assay 96 pozzetti Piastra di supporto e di quantificazione

1. Preparare soluzioni di base di tutti gli agenti sperimentali di consegna della droga, a 20 volte la concentrazione finale desiderata da sottoporre a prova (testavrà 10 ml di agente di consegna della droga + 190 ul cellule rosse del sangue diluito, che portano ad una diluizione 1/20 di un agente originale di somministrazione di farmaci in miscela di prova finale). Stock di 20, 100, e 800 pg / ml sono suggeriti, risultante in concentrazioni finali di 1, 5, e 40 pg / ml, rispettivamente.
2. Pipettare 10 ml di ciascuna soluzione madre in fondo a V da 96 pozzetti. Per ottenere risultati ottimali, caricare ciascun campione in triplicato o quadruplicato.

NOTA: per facilità, si raccomanda una distinta piastra a 96 pozzetti deve essere preparato per ciascun pH da testare, con ciascun campione (per ogni concentrazione) caricato con n = 3-4 per piastra.

3. Per pozzetti di controllo positivi, aggiungere 10 ml di 20% Triton X-100.
4. Per i pozzetti di controllo negativo, aggiungere 10 ml di tampone fosfato. Utilizzare tampone al pH stesso da testare.
5. Dispensare 190 ml di eritrociti diluiti (vedi 2.10) in ogni pozzetto, assicurandosi soluzione madre cella rimaneomogenea durante il trasferimento. Suggerimento: Utilizzare pipetta multicanale per semplificare questo compito.
6. Incubare le piastre a 37 ° C per un'ora (Opzionale: Utilizzare un agitatore orbitale o rocker).
7. Centrifugare piastre per 5 min a 500 xg per eritrociti pellet intatti. Nota: quando si rimuove la placca dalla centrifuga e il trasporto al passo successivo, maneggiare con cura ed essere certi di non disturbare il pellet.
8. Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 pl di surnatante da ciascun pozzetto in una chiara, a fondo piatto da 96 pozzetti. Nota: se il pellet cellulare è accidentalmente disturbato per ogni campione (s), si può ri-centrifugare la piastra e quindi procedere con il trasferimento supernatante.
9. Misurare assorbanza di supernatanti con un lettore di piastre. Si noti che un intervallo di lunghezze d'onda possono essere utilizzati (400-541 nm).

NOTA: lettori di piastre diverse possono avere punti di saturazione e sensibilità diverse, in modo che la scelta di una lunghezza d'onda per measurements dipende se i dati di emolisi campioni sperimentali può essere normalizzati affidabile contro emolisi massima indotta dal trattamento detergente. Questo richiede una misurazione precisa valori di assorbanza dei campioni di controllo positivi.

10. Utilizzo di Microsoft Excel o un simile software di analisi dei dati, trovare la media delle letture di assorbanza lo sfondo da campioni di controllo negativo create per ogni pH (punto 3.4). Sottrarre questo valore assorbanza di fondo da tutti gli altri campioni che sono stati misurati in quel pH.
11. Dopo sottrazione del fondo, trovare l'assorbanza media del controllo positivo detergente trattati con campioni (punto 3.3). Poi normalizzare tutti i punti dati sperimentali a questo valore medio di assorbanza, che dovrebbe rappresentare il 100% emolisi. Infine, moltiplicare ogni valore ben del 100% per calcolare emolisi% che si è verificato in ogni singolo pozzetto rispetto al controllo detergente.

Risultati

In genere, gli agenti che presentano ideale pH-dipendente comportamento emolitica hanno il più alto potenziale per la consegna citosolico di farmaci, acidi nucleici, o altre molecole bioattive. Questo è esemplificato da Agent # 1 come rappresentato in figura 2, che presenta emolisi minima a pH 7,4, ma un forte aumento comportamento emolitica a intervalli di pH endosomiali (<6,5). Alcuni agenti possono esibire livelli significativi di comportamento emolitica a intervalli di pH fisiologici (Age...

Discussione

pH-sensibili polimeri o altri agenti destinati endosomolytic funzione può essere rapidamente ed efficacemente proiettato sulla base di lisi dei globuli rossi a pH incontrate in endosomi (Figura 1; pH 6,8 - endosoma precoce, pH 6,2 - endosoma tardi, pH 5,6 - lisosoma). ^14-17 pH-dipendente emolisi è stato utilizzato per schermare la capacità dei vettori di mediare endosomal rilascio di peptidi terapeutici biomacromolecular (ad esempio, siRNA, ODN, proteine), ed i risultati di questa...

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubi	Fisher Scientific	22-253-145	Per la raccolta del sangue
BD Vacutainer sangue aghi di raccolta, 20,5 scartamento	Fisher Scientific	02-665-31	Per la raccolta del sangue
BD Vacutainer tubo porta / ago Adattatore	Fisher Scientific	22-289-953	Per la raccolta del sangue
BD Marca isopropilico tamponi imbevuti di alcool	Fisher Scientific	13-680-63	Per la raccolta del sangue
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Per la raccolta del sangue
Acido cloridrico (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	Per la regolazione del pH del D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Controllo positivo
Dulbecco PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 sterile monouso Bottle-Top Unità Filtro con membrana SFCA	Fisher Scientific	09-740-44A
BD piastre a 96 pozzetti, a fondo piatto, di coltura trattata con polistirolo	Fisher Scientific	08-772-2C	Per piastra di lettura al termine del saggio.
BD piastre a 96 pozzetti, fondo tondo, di coltura trattata con polistirolo	Fisher Scientific	08-772-17	Per incubazione di globuli rossi con agenti sperimentali.