Ex Vivo красных клеток крови Гемолиз анализа для оценки рН реагировать эндосомолитический агентов для цитозольного поставки наркотиков Biomacromolecular

Резюме

Гемолиз анализ может быть использован в качестве быстрого, высокую пропускную способность экрана системы доставки лекарственных средств "cytocompatibility и эндосомолитический деятельности для внутриклеточной доставки грузов. Анализ измеряет нарушение мембран эритроцитов в зависимости от рН среды.

Аннотация

Фосфолипидного бислоя, которые представляют собой эндо-лизосомных пузырьков может создать барьер для доставки биологических препаратов на внутриклеточные мишени. Чтобы преодолеть этот барьер, количество синтетических наркотиков носителей были разработаны активно нарушать эндосомного мембраны и доставить груз в цитоплазму. Здесь мы описываем гемолиза анализа, который может быть использован в качестве быстрого, высокой пропускной способностью экрана для cytocompatibility и эндосомолитический активность внутриклеточных систем доставки лекарственных средств.

В гемолиза анализ, эритроциты человека и испытания материалов совместно инкубируют в буфер при определенных значениях рН, которые имитируют внеклеточной, рано эндосомного, и в конце эндо-лизосомальных среды. После центрифугирования для осаждения нетронутыми эритроцитов, количество гемоглобина попадает в среду измеряется спектрофотометрически (405 нм для лучшего динамического диапазона). Процентов красные разрушение клеток крови, то количественно по сравнению с положительным контролем SAMPле лизируются с моющим средством. В этой модели система мембран эритроцитов служит заменителем липидного бислоя мембраны, окружающие эндо-лизосомных пузырьков. Желаемый результат можно пренебречь гемолиза при физиологических рН (7,4) и надежные гемолиза в эндо-лизосомальных диапазоне рН примерно от рН 5-6.8.

Введение

Хотя есть много потенциально высокой отдачей терапевтические мишени внутри клетки, внутриклеточной доставки агентов представляет собой значительную проблему. Часто, наркотики, особенно биопрепаратов, усваиваются клетками и продают в пузырьках, которые либо приводят к ухудшению их содержимого через эндо-лизосомальных пути, или курсировал обратно из клетки с помощью экзоцитоза. ¹ В последнем процессе, внутренние рН пузырьков подкисляют до примерно 5-6, который является оптимальным рН на активность ферментов, которые функционируют в этот отсек, такие как лизоцим ^2.

В последнее время ряд материалов, которые были специально разработаны для привлечения подкисления эндосомы для облегчения цитозольного доставки своего груза. Одним из примеров такого подхода используются синтетические, полимерные мицеллы наночастиц ядро которого цвиттерионные и заряда нейтральными при физиологических рН (т.е. 7,4). Тем не менее, при рН 6,0- 6,5, полимеры становятся протонирована и приобретают положительный заряд, что дестабилизирует мицеллы ядро, и открытые сегменты полимера взаимодействуют и нарушить эндосомного мембраны. Эта деятельность была показана по содействию эндосомного выхода пептидов и нуклеиновых кислот основе терапии, что позволит им получить доступ к своим цитозольного целей. ^3,4 Другие примеры методов, разработанных для посредников эндосомного побега, которые разрушают мембраны барьера включают "fusogenic" пептиды или белков, что может выступить посредником слияние мембран или переходные образования пор в фосфолипидного бислоя. ⁵ Гомополимеры анионных алкил кислот акрилового такие как поли (propylacrylic кислоты) являются еще одним хорошо изученный подход, и в этих полимеров, протонирование состояние кулон карбоновой кислоты диктует переход в гидрофобных, мембраны прерывания государства в эндо-лизосомальных диапазонах рН. ^6,7

Одним из полезных модель системы для скрининга эндосомолитический поведение электроннойх естественных условиях рН-зависимого гемолиза анализа. ⁸ В этой модельной системы, мембраны эритроцита служит заменителем липидного бислоя мембраны, окружающие эндо-лизосомных пузырьков. Это обобщению модели была использована другими для оценки эндосомолитический поведение клеточной проникающих пептидов и других полимерных систем доставки генов. ^8-11 В этом эксперименте, эритроциты человека и испытания материалов совместно инкубируют в буфер при определенных значениях рН, которые имитируют внеклеточный (7,4), рано эндосомного (6,8), и в конце эндо-лизосомальных (<6,8) среде. Количество гемоглобина выпущен в течение инкубационного периода количественно как меру красно лизис клеток крови, которая нормирована на количество гемоглобина выпущен в положительные контрольные образцы лизируются с моющим средством.

От скрининга небольшая библиотека потенциально эндосомолитический тестовых материалов, можно сделать вывод, что образцы, которые не производят гемолиз при рН 7,4, но значительно повышенные подолеolysis при рН <6,5, будет наиболее эффективным и cytocompatible кандидатов на цитозольной доставки лекарственных средств. Материалы, которые соответствуют этим критериям можно было бы ожидать, чтобы оставаться инертным и не без разбора уничтожить двухслойных липидных мембран (например, которые могут привести к цитотоксичности), пока не подвергаясь капля в местном рН после интернализации в эндо-лизосомальных отсеков.

В этом протоколе, эритроциты изолированы от человека-донора и совместно инкубировали при рН 5,6, 6,2, 6,8 или 7,4 с экспериментальными эндосомолитический агентов доставки лекарственных средств. Интактные эритроциты осаждают, а супернатанты (содержащие гемоглобин освобожден из лизированных эритроцитов), анализируются характерные для поглощения гемоглобина через ридер (рис. 1).

протокол

1. Подготовка и стерилизация буферов и агентов тестирования

1. 150 мМ NaCl буфера: Растворить 4,383 г NaCl кристаллов в 500 мл воды NanoPure.
2. рН буфера: Подготовка фосфатного буфера рН на 5,6, 6,2, 6,8 и 7,4 путем смешивания соответствующих количеств одноосновных и двухосновных фосфат натрия. Если образцы должны быть проверены при более низких значениях рН (например, рН <5,6), то более подходящего буфера, такие как цитрат буфер, должны быть использованы. Буфер рецепты легко доступны, и пример ссылка была предоставлена ​​здесь ^12.
3. Стерилизовать всех буферов отмечалось выше через бутылочку-топ вакуум-аппарат фильтрации и повторной проверки буфера рН.
4. 20% Triton X-100 (положительный контроль): Смешайте 20 мл чистого Тритон Х-100 в 80 мл NanoPure воды. Vortex энергично и разрушать ультразвуком до растворения. Оставить при комнатной температуре в течение ночи перед использованием.

2. Подготовка эритроцитов

1. Получить 25 мл крови птОМ анонимного донора человека, обращается непосредственно в K _2-ЭДТА покрытием труб Vacutainer для предотвращения свертывания крови.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны быть предварительно одобрены соответствующими совет организации (IRB), а вены и сбор крови должен быть выполнен квалифицированным флеботомиста для того, чтобы свести к минимуму риск для донора. Стандартные процедуры кровопускания были опубликованы в другом месте ^13.

2. Центрифуга крови при 500 мкг в течение 5 мин, а знак уровня гематокрита (красный, нижний слой) и плазмы (желтоватый, верхний слой) на трубке.
3. Аспирируйте плазмы осторожно с помощью микропипетки, добавить в отбеливателем, и выбросить в биологически опасных отходов.
4. Заполните гематокрита трубки отмечены линии (исходный уровень плазмы) с 150 мМ NaCl решение. Cap и инвертировать несколько раз осторожно перемешать. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин.
5. Повторите шаги 2.3-2.4 для мытья клеток крови снова. Тогда аспирации supernatМуравей и заменить PBS при рН 7,4. Обратить перемешать.
6. Сплит кровь равномерно на четыре трубы, соответствующие каждой рН, которые будут проверены. Этикетка труб по каждому рН для тестирования (5,6, 6,2, 6,8, 7,4).
7. Центрифуга крови труб при 500 мкг в течение 5 мин. Отметить уровней на трубах, затем супернатант.
8. Заполните каждую трубку отмечены соответствии с буфером соответствующих рН (как указано в 2,6).
9. Этикетка четырех 50 мл конические пробирки (по одному на рН тест), и пипеткой 49 мл PBS соответствующих рН в каждой коническую трубку.
10. Добавить 1 мл эритроцитов (то же самое рН) в соответствующие трубки для разведение 1:50. Осмотрите разведенной крови, которая должна быть мутной и осядет, если не трогать. Если нет гранул формы, клетки лизируются.

3. Лизис анализа 96 лунок установки плиты и количественной

1. Подготовка растворов всех экспериментальных средств доставки лекарственных средств, в 20х желаемой конечной концентрации для тестирования (анализасостоится 10 мкл препарата агент доставки + 190 мкл разведенного красных кровяных клеток, что приводит к 1/20 разбавления исходного агента доставки лекарственного средства в конечной смеси теста). Запасы 20, 100 и 800 мкг / мл Предлагается, в результате чего конечная концентрация теста на 1, 5 и 40 мкг / мл, соответственно.
2. Внесите 10 мкл каждого раствора в нижней V-96-луночных планшетах. Для получения оптимальных результатов, загрузить каждого образца в трех экземплярах или четырех экземплярах.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства, рекомендуется отдельный 96-луночный планшет должны быть подготовлены для каждого значения рН должны быть протестированы, с каждого образца (в каждой концентрации) загружается при п = 3-4 в тарелку.

3. Для положительного контроля скважин, добавить 10 мкл 20% Triton X-100.
4. Для отрицательных скважин управления, добавьте 10 мкл фосфатного буфера. Использование буфера в то же рН для проверки.
5. Внесите 190 мкл разбавленного эритроцитов (см. 2,10) в каждую лунку, убедившись, что решение складе клетка остаетсяоднородный во время передачи. Совет: Используйте многоканальные пипетки, чтобы упростить эту задачу.
6. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение одного часа (Дополнительно: Используйте орбитальный шейкер или рокер).
7. Центрифуга пластин в течение 5 мин при 500 хд для осаждения эритроцитов нетронутыми. Примечание: при снятии пластины из центрифуги и транспортировки его к следующему шагу, соблюдайте осторожность и быть уверенным, чтобы не нарушать клеточный осадок.
8. С помощью многоканальной пипетки, передавать 100 мкл супернатанта из каждой лунки в ясный, с плоским дном 96-луночный планшет. Примечание: если осадок клеток случайно нарушенных для любого образца (ов), можно повторно центрифугируют пластины, а затем приступить супернатант передачи.
9. Измерение поглощения супернатантов с ридер. Обратите внимание, что диапазон длин волн может быть использована (400 - 541 нм).

ПРИМЕЧАНИЕ: Различные читатели пластины могут иметь различные точки насыщения и чувствительностью, поэтому выбор длины волны для меняasurements зависит от наличия или отсутствия гемолиза данных из экспериментальных образцов может быть надежно нормированы на максимальную гемолиза, как индуцированные моющим средством лечения. Это требует точного измерения значения абсорбции положительные контрольные образцы.

10. Использование Microsoft Excel или аналогичного программного обеспечения анализа данных, найти среднее значение оптической плотности фона от негативных контрольных образцов установлены для каждого рН (шаг 3,4). Вычтем это значение фона поглощения от всех других образцов, которые были измерены в то рН.
11. После вычитания фона, найти среднюю оптическую плотность положительного контроля моющих средств обработанные образцы (шаг 3,3). Тогда нормализовать все экспериментальные точки, чтобы это среднее значение оптической плотности, которая должна представлять собой 100% гемолиз. И, наконец, умножим каждую лунку значения на 100% при расчете% гемолизу, которая произошла в каждой отдельной скважине по отношению к моющим средством управления.

Результаты

Как правило, агенты, которые обладают идеальными рН-зависимые гемолитические поведения имеют самый высокий потенциал для цитозольного доставки лекарств, нуклеиновых кислот и других биологически активных молекул. Примером этого может служить агент № 1, как изображается на рис?...

Обсуждение

рН-отзывчивым полимеров или других агентов, предназначенных для эндосомолитический функции могут быть быстро и эффективно экранируется на основе лизиса эритроцитов при значениях рН, встречающихся в ядрышко (рис. 1; рН 6,8 - начале ядрышко, рН 6,2 - поздно ядрышко, рН 5,6 - лизосом).

Материалы

Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer трубы	Fisher Scientific	22-253-145	Для сбора крови
BD Vacutainer сбору крови иглы, 20,5 калибра	Fisher Scientific	02-665-31	Для сбора крови
BD Vacutainer держатель трубки / иглы адаптер	Fisher Scientific	22-289-953	Для сбора крови
BD Марка изопропиловый спирт тампоны	Fisher Scientific	13-680-63	Для сбора крови
BD Vacutainer латекса Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Для сбора крови
Соляная кислота (конц.)	Fisher Scientific	A144-500	Для регулировки рН D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Положительный контроль
Дульбекко PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 стерильные одноразовые бутылки-Top фильтр с SFCA мембранные	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-луночные планшеты с плоским дном, культуры тканей обработанных полистирола	Fisher Scientific	08-772-2C	Для пластины чтении в конце анализа.
BD 96-луночные, с круглым дном, культуры тканей обработанных полистирола	Fisher Scientific	08-772-17	Для инкубации эритроцитов с экспериментальными средствами.