حقن المجسم من الرنا الميكروي، معربا عن Lentiviruses إلى CA1 الحصين ماوس المنطقة وتقييم حصيلة السلوكية

Summary

MicroRNAs لها أدوار هامة في بنية الدماغ ووظيفته. هنا نحن تصف طريقة لفرض ميرنا الحصين الإفراط في التعبير باستخدام حقن المجسم من الفيروسة البطيئة ميرنا، معربا عن هندسيا. يمكن لهذا النهج بمثابة وسيلة سريعة نسبيا لتقييم في الجسم الحي آثار لل miRNAs الإفراط في المعبر عنها في مناطق محددة في الدماغ.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) هي عبارة عن جزيئات الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل واحدة تنظيمية صغيرة حول 22 النيوكليوتيدات طويلة على أنه يجوز لكل هدف العديد من النصوص مرنا وخافت على كامل مسار الجين التعبير من خلال تدمير حمل و / أو ترجمة تثبيط هذه الأهداف. العديد من miRNAs تلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على بنية الخلايا العصبية وظيفة وظائف المخ في المستوى العالي، ويتم البحث عن طرق لمعالجة مستوياتها لاستكشاف هذه الوظائف. هنا، نقدم طريقة مباشرة في الجسم الحي لدراسة العواقب المعرفية لل miRNAs القسري الزائدة في الفئران عن طريق الحقن المجسم من جزيئات الفيروس ميرنا ترميز. على وجه التحديد، والبروتوكول الحالي ينطوي على الحقن في المنطقة CA1 الحصين، الأمر الذي يسهم في توطيد الثدييات الذاكرة، والتعلم، واستجابات التوتر، ويقدم موقع الحقن مريحة. يتم قياس الإحداثيات وفقا لbregma الماوس، ويتم التحكم رقميا نضح الفيروس وأبقى بطيئة جدا.بعد الحقن، وختم الجرح الجراحة والحيوانات استرداد. Lentiviruses ترميز كواتم الصوت من الأهداف مرنا المقابلة تعمل على توريط ميرنا / الهدف التفاعل محددة مسؤولة عن تأثير الملاحظ، مع الفئران السذاجة، حقن الفئران بمحلول ملحي وحقن الفئران مع "فارغة" ناقلات الفيروسة البطيئة والضوابط. شهر واحد بعد الحقن، ويتم فحص الحيوانات في متاهة موريس المائية (MWM) لتقييم التعلم الملاحة وقدراتهم الذاكرة. وMWM هو خزان جولة مملوءة بالماء الملون مع منصة صغيرة مغمورة 1 سم تحت سطح الماء. الإشارات البصرية ثابت حول خزان تسمح للملاحة الفضائية (صوت وربما حقل المغناطيسي للأرض أيضا مساعدة الحيوانات في التنقل). ورصد كاميرا فيديو تتيح قياس مسار السباحة والوقت للعثور على وترقى المنصة. تدرس الماوس الأولى التي تركيب منصة خفية يوفر الهروب من السباحة القسري؛ ثم يتم اختباره لاستخدام هذا الهروب وجمعةinally، تتم إزالة منصة والاختبارات التحقيق فحص إذا كان الماوس يتذكر موقعه السابق. الاختبارات المتكررة على مدى عدة أيام متتالية تسليط الضوء على تحسن أداء الفئران اختبارها في الإختفاء أقصر لإيجاد وتحميل منصة، وطرق وأكثر مباشرة للوصول إلى منصة أو موقعه. عدم إظهار هذا التحسن تمثل ضعف في التعلم والذاكرة و / أو القلق، والتي قد ثم يتم اختبارها على وجه التحديد (على سبيل المثال في المتاهة زائد مرتفعة). هذا النهج يمكن التحقق من صحة لل miRNAs محددة ومحاضر الهدف في درس المعرفي و / أو العمليات المرتبطة بالتوتر.

Introduction

وقد تم مؤخرا تحدى دور لل miRNAs خاصة في أداء الجهاز العصبي عن طريق الحقن lentiviral في العديد من الدراسات. تم العثور على MiRNAs أن تكون حاسمة للحفاظ وإعادة تشكيل بنية المشبك ¹ synaptogenesis، ^و2 و إعادة عرض المشبك وصيانة ^3. هذه الدراسات تشير بقوة إلى أن miRNAs يشاركون، عبر آثار التنظيمية multileveled سواء في صياغة وتصل في الحفاظ على الناتج الرئيسي من الجهاز العصبي، والوظيفة المعرفية. حقن المجسم من جسيمات الفيروسة البطيئة إلى مناطق محددة في الدماغ القوارض تمكن بالبحث عن تغييرات في التشكل المشبك ونشاط الخلايا العصبية، وكانت تستخدم لإقامة أهمية وظيفية من خلال النصوص التي تبديها ^4،5. قد تكون متورطة عدوى مباشرة من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ محددة جيدا مع ميرنا، معربا عن lentiviruses في دراسات الشيخوخة، واضطرابات المخ وتنكس عصبي؛ دراسات ميرناو في مجال التنظيم السلوكي ^6-8 هي في حالة أقل بكثير المتقدمة، وحقن المجسم من ميرنا، معربا عن جسيمات الفيروسة البطيئة تليها الاختبارات السلوكية قد تكون مفيدة لمثل هذه الأغراض. وهناك طريقة أكثر بكثير شاقة لإحداث الزائد أو الناقص في التعبير ينطوي المهندسة وراثيا أو الضربة القاضية في الفئران خروج المغلوب. ويمكن لنظم وراثية تسمح بالمزيد من أجل السيطرة المشروطة والزمانية على التعبير (على سبيل المثال لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، ونظم تيت)، ولكن هذه بالكاد توفر خصوصية المكاني لإجراء الحقن، وهناك دائما تقريبا كمية معينة من التسرب. أيضا، الإجراءات الهندسية لا تتطلب عملية جراحية، ويمكن استخدامها في جميع أنحاء مختبرات مع استنساخ جيدة نسبيا، إلا أنها تكون أبطأ وتتطلب أكثر من ذلك بكثير القوى العاملة والموارد المالية. وبالإضافة إلى ذلك، والسيطرة الزمنية من الإفراط في أو تحت التعبير في حقن الفئران هي أكثر دقة بكثير بالمقارنة مع الفئران المعدلة وراثيا.

Protocol

1. إعداد الفيروسة البطيئة

1. تنمو الخلايا HEK-293FT إلى 90٪ التقاء.
2. في يوم من ترنسفكأيشن تغيير المتوسطة الخلية إلى DMEM المصل خالية تستكمل مع 1 ملي الجلوتامين و 50 ملغ / مل البنسلين، الستربتوميسين.
3. شارك في بالنقل الخلايا مع متجه pLKO.1-بورو ومع البلازميدات ترميز لR8.2 الدلتا والأنصاف VSV-G وميرنا من الفائدة، وذلك باستخدام 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل polyethylenimine باعتبارها الناقل ^9.
4. جمع lentiviruses المعبأة في 24 ساعة و 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، مرشح من خلال 0.45 ميكرون التصفية.
5. تركيز lentiviruses باستخدام تنبيذ فائق في 70،000 XG، لمدة 2 ساعة و 15 درجة مئوية، وقسامة وتخزينها في -70 درجة مئوية.
6. قياس عيار الفيروس عن طريق إصابة الخلايا HEK-293T مع الاستعدادات الفيروس المخفف متسلسل (من 1 إلى 10 ^-6 مل من ناقلات لكل بئر). يتم تقييم الناتج عيار (10 × ⁹ الجسيمات المعدية لكل مل من المستحسن الحد الأدنى من ~ 1) للتعبير عن جنرال الكتريكشمال شرق من الفائدة، وذلك باستخدام اختيار بوروميسين وعن طريق قياس GFP معربا عن الفيروسات عن طريق عد الخلايا الفلورسنت.

لبروتوكول أكثر تفصيلا من إعداد الفيروسة البطيئة انظر ^10.

2. إعداد الحيوانات لجراحة

1. وينبغي أن تشمل الجراحين زي ثوب الجراحية، والقفازات المعقمة، وكأب وقناع.
2. وزن الحيوان، ثم تخدير ذلك مع حقن IP من خليط الكيتامين، مع حجم يتناسب مع وزن الحيوان كما هو محدد لكل دواء. بالنسبة لمزيج من الكيتامين / زيلازين، وعادة ما يستخدم مجموعة جرعة من 80-200 ملغم / كغم من الكيتامين و 7-20 ملغ / كغ زيلازين بالنسبة للفئران.
3. الانتظار حتى الحيوان هو تخدير كامل، ثم تحقق من عدم وجود منعكس الانسحاب في أطرافه الخلفية للحيوان عن طريق تمديد أطرافه ومن ثم الضغط عليه بإصبعك.
4. حقن الحيوان تحت الجلد مع Rimadyl، كما هو محدد في المربع، لتخفيف الألم. مجموعة الجرعة النموذجية لRymadil هو 5-10 ملغ.
5. وضع الحيوان على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة وترطيب العينين مع مرهم.
6. حلاقة المنطقة الواقعة بين الأذنين اثنين مع آلة التشذيب.
7. تطهير الجلد مع بتدين.

3. تعرض الجمجمة والحفر

1. وضع الحيوان داخل stereotact عن طريق ضبط قضبان في الشقوق الأمامية فقط إلى آذان الحيوان.
2. استخدام مشرط لجعل شق الأمامي الخلفي من حوالي 1.5 سم بين الآذان وابقائه مفتوحا مع المشابك جراحة (serfines).
3. تنظيف السطح من الجمجمة مع مسحة القطن حتى التقاطع بين الدرز الإكليلي والغرز السهمي؛ أي و bregma التقاطع بين الغرز الاكليلية واللامية، أي امدا، مرئية.
4. تشير غيض من حقنة، التي عقدها stereotact، إلى نقطة bregma، في جميع المحاور الثلاثة. كتابة الإحداثيات. ويعتبر هذا نقطة الصفر كما ص.الباحث في جميع المحاور الثلاثة.
5. رفع المحقنة في المحور الرأسي بحيث أن حركة مستو لا تخدش الجمجمة وتحريك رأس المحقنة إلى الموقع الصحيح. حقن CA1 الحصين تتطلب ما يلي ينسق النسبية إلى bregma ب (ملم): -2 في المحور الأمامي / الخلفي، ± 1.8 في المحور الأفقي / الإنسي و-1.5 في محور ظهري / بطني.
6. خفض غيض من حقنة حتى يلمس الجمجمة وبمناسبة بقعة مع علامة. إزالة حقنة الظهر لتجنب طعن.
7. حفر حفرة ضحلة، إلا في عظم الجمجمة باستخدام الحفار غرامة. عقد الحفار ثابت حتى انها لن تستمر في حفر في أسفل الأنسجة اللينة. يمكنك منع هذا عن طريق مستقرا يد واحدة مع الأخرى وعن طريق حفر في نبضات قصيرة.

4. حقن من الفيروسة البطيئة

1. سحب 0.5 مل من محلول الفيروسة البطيئة المركزة.
2. وضع حقنة فوق حفرة وببطء خفضه عموديا حتى الجرميةالشطرنج سطح الجمجمة. الاستمرار في خفض حقنة في الدماغ ببطء شديد. في هذه الخطوة قد تحدث بعض النزيف الذي لا يدل بالضرورة على اختراق فاشلة. إذا كان النزيف يحدث امتصاص هذا الامر مع مسحة القطن.
3. تعيين مضخة الرقمية إلى 0.02 مل / دقيقة (سيتم حقن 0.5 ميكرولتر في 25 دقيقة) والبدء في ضخ. التسريب البطيء يسمح لنشر الفعال للفيروس في الأنسجة ويمنع عودة تدفق. في بعض أنواع حقنة النظر في إدراج الحقنة لعمق إضافي قدره 0.5 مم قبل أن يتراجع إلى إحداثيات الأصلي وغرس.
4. بعد اكتمال التسريب انتظر 5 دقائق إضافية للسماح للمواد أن تنتشر في الدماغ بدلا من التقوقع في القناة التي شكلتها الحقنة.
5. إزالة المحقنة ببطء شديد ومراقبة التدفقات الى الوراء. إذا لوحظ تدفق إلى الوراء في هذه الخطوة، وجزء من المواد حقن ربما كان خسر.

5. ختم الجرح والإنعاش

1. ختم عشرالجرح الإلكترونية مع histoacryl. تأكد من تجنب تسريب histoacryl في عيون.
2. حقن الحيوان الغشاء البريتونى (IP) مع 1 مل ملحي قبل ساخنة، لتجنب الجفاف.
3. وضع الحيوان في قفص الانتعاش الذي يتم وضعه على وسادة ساخنة. مشاهدة هذا الحيوان في حين أنه يتعافى لمدة ساعة إضافية.

في حالة فقدان الوزن، inappetance، يجب أن يتم تنفيذ ضعف / عدم القدرة على الحصول على الأعلاف أو المياه، الدولة المحتضرة أو العدوى، والقتل الرحيم للحيوان. طرق مقبولة للقتل الرحيم من القوارض والباربيتورات، ومواد التخدير المستنشق، CO _2، CO، أو كلوريد البوتاسيوم بالتزامن مع التخدير العام.

بعد 4 إلى 6 أسابيع، وتقييم يتم تقييم الذاكرة الملاحة الحيوان في متاهة موريس المائية. سوف الفيروسة البطيئة عادة تصيب معظم الخلايا داخل المجال الحقن.

6. تقييم السلوكية في متاهة موريس المائية

1. تدريب الحيوانات في Mالسوسن متاهة مائية. للتدريب الدقيق وبروتوكول الاختبار يرى ^11. بعد كل محاكمة، يجف الحيوان بمنشفة جافة، والاستعاضة عنها في قفصه وتجديد المياه في الخزان.
2. اختبار الحيوانات في متاهة موريس المائية لمدة 3 أيام متتالية، 4 تجارب كل يوم. كل يوم تضاف الحيوانات في متاهة في كل من 4 اتجاهات من المتاهة (شمال، جنوب، شرق وغرب) في ترتيب المتغيرة، على سبيل المثال يوم واحد: الشرق والغرب والشمال والجنوب، اليوم الثاني: الغرب والجنوب والشمال الشرقي. مسح الحيوانات بعد كل محاكمة.
3. أثناء الاختبار التجارب تتبع هذا الحيوان مع نظام تتبع مثل نظام تتبع Noldus.
4. بعد 12 ^عشر اختبار محاكمة، إدراج الحيوانية في خزان الماء دون منصة لدقيقة واحدة. هذا وسوف تستخدم لتحليل استراتيجية تبحث يأخذ الحيوان.
5. تحليل البيانات على النحو المقترح في ^12.

النتائج

حقن من 0.5 ميكرولتر الفيروسة البطيئة في المنطقة CA1 في حصين الماوس، مع معدل تدفق مبين في القسم بروتوكول غلة المجال المصابة من حوالي 1 ملم في محور منقاري-الذيلية، وحوالي 0.5 ملم في الإنسي الوحشي والأمامي الخلفي محاور (الشكل 3).

Discussion

حقن المجسم من الفيروسة البطيئة هي طريقة سريعة نسبيا للتقييم في الجسم الحي على حد سواء أعلى أو أسفل تنظيم الجينات وmiRNAs مختلفة. البديل الرئيسي هو الفأر وراثيا الذي هو تقنية تستهلك الكثير أكثر شاقة والوقت ثم حقن الفيروسة البطيئة مباشرة. وبالإضافة إلى ذلك، وتنظيم م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Equipment
Rodent weigh scale	Burtons (UK)	115-455
heating pad	FIRstTechnology	DCT-25
trimming machine	Stoelting	51465
stereotact	Stoelting	51730
Scalpel and blades	Kent scientific	INS500348
Harland syringe	Hamilton	7632-01
driller	Stoelting	51449
digital pump	Harvard apparatus	704507
Water tank and platform	Stoelting	60135

			Reagents
ketamine	Vetoquinol(Lure France)	3055503
domitor	Orion pharma	107140-10
Rimadyl	Pfizer animal health	24751
moisture ointment - Synthomycine 5%	Rekah Pharmaceutical	195
histoacryl	Braun	112101
saline	Sigma Aldrich	D8662